專利名稱：診斷和治療前列腺癌和肺癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及前列腺癌和肺癌相關(guān)的基因和編碼的蛋白，以及檢測和治療前列腺癌 和肺癌的方法和試劑。參考文獻下列文獻被下文引用，以支持本發(fā)明的背景技術(shù)或?qū)嵤┍景l(fā)明所應(yīng)用的方法。1. Bjarnadottir TK, Geirardsdottir K，Ingemansson M，Mirza MA, Fredriksson R，Schioth HB. Identification of novel splice variants of Adhesion Gprotein-coupled receptors. Gene. 2007 Jan 31 ；387 (1-2) 38-48. Epub 2006 Aug30.2. Bjarnadottir TK, Fredriksson R，Hoglund PJ, Gloriam DE, LagerstromMC, Schioth HB. The human and mouse repertoire of the adhesion family of G-protein-coupled receptors. Genomics. 2004Jul ；84(1) :23_33·3. Fredriksson R，Lagerstrom MC, Hoglund PJ, Schioth HB.Novel humanG protein-coupled receptors with long N-terminals containing GPS domains andSer/ Thr-rich regions. FEBS Lett. 2002Nov 20 ；531 (3) :407_14·4. Nusse，R.，van Ooyen, Α.，Cox, D.，F(xiàn)ung，Y. K. &Varmus，H. Mode ofproviral activation of a putative mammary oncogene (int-1)on mousechromosome 15. Nature 307,131-6(1984).5. Nusse, R. &Varmus, H. E. Many tumors induced by the mousemammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of thehost genome. Cell 31,99-109(1982).6. Sorensen，A. B.，Duch，M.，Amtoft，H. W.，Jorgensen，P. &Pedersen， F. S. Sequence tags of provirus integration sites in DNAs of tumors induced bythe murine retrovirus SL3-3. J Virol 70,4063-70(1996).7. Lund, A. H. et al. Genome-wide retroviral insertional tagging of genesinvolved in cancer in Cdkn2a_deficient mice. Nat Genet 32，160-5 (2002) ·8. Mikkers, H. et al. High-throughput retroviral tagging to identifycomponents of specific signaling pathways in cancer. Nat Genet 32， 153-9(2002).9. Collier，L. S.，Carlson，C. M.，Ravimohan，S.，Dupuy, A. J. &Largaespada， D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature 436，272-6 (2005) ·10. Dupuy, A. J.，Akagi, K.，Largaespada，D. Α.，Copeland，N. G. &Jenkins， N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic SleepingBeauty transposon system. Nature 436，221-6 (2005)·11. Wang, et al. , Nucleic Acids Research, (England) 2005, Vol. 33, p. 21.12. Oh da Y，Kim K，Kwon HB, Seong JY. Cellular and molecular biologyoforphan G protein-coupled receptors.Int Rev Cytol. 2006 ；252 163—218.13. Lundstrom K. Latest development in drug discovery on G protein-coupled receptors.Curr Protein Pept Sci. 20060ct ；7 (5) 465-70.14. Jacoby EiBouhelal RiGerspacher M，Seuwen K. The 7TM G-protein-coupled receptor target family. ChemMedChem. 2006Aug ； 1 (8) :761_82·
背景技術(shù)：
前列腺癌是北美男性中最普遍的惡性癌癥。據(jù)估計在美國每年有大約200，000例 新發(fā)病例和31，500例與前列腺癌相關(guān)的死亡發(fā)生。前列腺癌是目前男性癌癥死亡中第二 主要的病因，僅次于肺癌。其占所有男性癌癥的29%和男性癌癥相關(guān)死亡的11%。目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)血清PSA(前列腺-特異性抗原)用作前列腺癌篩查的實驗室 指標(biāo)。與很多血清腫瘤標(biāo)志一樣，正常和癌變的腺體都產(chǎn)生PSA。患有前列腺癌的男性，局 部的和晚期或播散的疾病都增加其血清水平。PSA水平一般與腫瘤體積成比例。由于癌癥 和良性前列腺增生測到的PSA水平之間有很大的重疊，獲得低點的或臨界升高值的連續(xù)水 平是重要的。游離PSA(fPSA)檢測的引入導(dǎo)致了早期前列腺癌鑒定更高水平的特異性。1998 年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了 fPSA檢測作為總PSA值在4. 0-10. 0ng/mL間的男性的診斷輔助手段。此處 經(jīng)常是總PSA檢測的診斷灰色地帶，fPSA可以幫助分類。通常，在任意游離PSA水平，越為 增大的前列腺，其癌變的可能越大。但是，這些檢測至多是定性的，更可靠的檢測類型和對 癌癥治療分期的方法是必需的。前列腺癌，與其它類型癌癥一樣，是由基因變異，S卩，突變導(dǎo)致的。在突變細胞中， 促進和抑制生長的因子間的正常平衡被打破，結(jié)果，這些突變細胞持續(xù)增生——腫瘤細胞 的標(biāo)志。突變可以自發(fā)或由外部因素而引起，例如化學(xué)誘變劑，輻射，或病毒整合，其插入可 能包含或不包含癌基因的外源基因組DNA。細胞基因可以由點突變，插入和移碼(包括截 短)，(功能)缺失(包括沉默)，或有時可以導(dǎo)致基因融合的易位修飾。這樣，原癌基因可 以變成癌基因，其促進增生，抑癌基因可以失活，也誘導(dǎo)腫瘤生長。上面提到的DNA變化的 任意聯(lián)合都能促使腫瘤形成。這些變化的結(jié)果可能會或不會被免疫系統(tǒng)的檢查(免疫監(jiān) 視)所抑制。在此之前，GPRllO水平的變化和前列腺癌或肺癌之間不存在已被證明的關(guān)聯(lián)。這 樣的關(guān)聯(lián)可以有很多重要的診斷和治療用途。依據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)(i)GPR110水平在前 列腺癌和肺癌細胞中顯著增加，和(ii)這種增加可以在病人血液或尿液中被檢測。發(fā)明概述本發(fā)明包括，一方面，在人對象中篩查肺癌或前列腺癌的方法。該方法包括步驟 (a)檢測對象樣品中人GPRllO的水平或其RNA轉(zhuǎn)錄物的水平，(b)確定人GPR110或其RNA 轉(zhuǎn)錄物的檢測水平是否分別比從大多數(shù)正常人樣品確定的正常人個體內(nèi)GPRllO或其轉(zhuǎn)錄 物水平高至少三倍?？蛇x擇地，該方法可以包括通過在人對象中分別獨立檢驗肺癌或前列 腺癌的方法篩查肺癌或前列腺癌的存在，條件是測定水平比正常水平高至少三倍，其中獨 立檢驗可以在步驟(a)和(b)之前，同時，或之后進行。在對象樣品是肺或前列腺的組織學(xué)組織樣品情況下，步驟(a)可以包括，在對抗體結(jié)合到具有GPRllO表位的細胞有效的條件下，將所述樣品與特異性針對GPRllO表位的 抗-GRPllO抗體接觸，并檢測結(jié)合于所述樣品的抗體水平，和步驟(b)可以包括確定與對象 肺或前列腺組織樣品結(jié)合的抗體的檢測水平是否分別比結(jié)合于從正常個體獲得的人肺或 前列腺組織樣品的抗-GPRllO抗體的檢測水平高至少三倍?？贵w可以特異性針對由SEQ ID NO 1內(nèi)的氨基酸殘基表示的GPRllO表位?？贵w可以是放射標(biāo)記的GPRllO抗體，步驟(a) 可以包括通過閃爍掃描法檢測所述組織內(nèi)局部化的放射性標(biāo)記的水平。在對象樣品是對象血液或血清樣品的情況下，步驟(a)可以包括，在對抗體結(jié)合 GPRllO表位有效的條件下，將所述樣品與特異性針對GPRllO表位的抗-GPRllO抗體接觸， 從未結(jié)合抗體分離結(jié)合于GPRllO表位的抗體，并檢測結(jié)合于GPRllO表位的抗體的水平，和 步驟(b)可以包括確定結(jié)合于GPRllO表位的抗體的檢測水平是否比結(jié)合于從正常個體獲 得的血液或血清樣品中存在的GPRllO表位的抗-GPRllO抗體的檢測水平高至少三倍。步 驟(a)可以包括將血液或血清樣品的體液施加于固相免疫檢測裝置，其中樣品中GPRllO水 平由比色或熒光指標(biāo)定性表示，確定步驟包括將該指標(biāo)與已知標(biāo)準(zhǔn)比較。在對象樣品是肺或前列腺組織樣品的情況下，步驟(a)可以包括處理樣品以從中 提取RNA轉(zhuǎn)錄物和檢測編碼GPRllO蛋白至少一個片段的RNA轉(zhuǎn)錄物的水平，和步驟(b)可 以包括確定RNA轉(zhuǎn)錄物的檢測水平是否比從正常個體獲得的肺或前列腺組織樣品中編碼 GPRllO蛋白至少一個片段的轉(zhuǎn)錄物的檢測水平高至少三倍。另一方面，本發(fā)明包括檢查肺癌或前列腺癌存在的方法中的改進，其通過檢測肺 癌或前列腺癌的診斷性生物學(xué)指標(biāo)水平的降低或升高來進行。這種改進包括步驟(a)檢 測對象樣品中人GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的水平，和(b)確定人GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的檢測水平 是否分別比從多數(shù)正常人樣品確定的正常人個體中GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的水平高至少三 倍，作為肺癌或前列腺癌存在的另一個指標(biāo)。上面提到的方法的多種優(yōu)選實施方案也應(yīng)用 于本發(fā)明的這個方面。例如，所述改進可以用于檢查人男性對象中前列腺癌的方法中，所述方法包括將 對象體液樣品與特異性針對選自總前列腺特異性抗原(PSA)，游離PSA，和磷脂酰肌醇聚糖 3蛋白(GPC3)之一的至少一種標(biāo)志蛋白的抗體反應(yīng)，確定對象是否有增加水平的至少一種 所述標(biāo)志蛋白，做為前列腺癌的指標(biāo)。又另一方面，本發(fā)明涉及來自人對象的血液或血清樣品中的GPRllO的檢測值和 選自總前列腺特異性抗原(PSA)，游離PSA和磷脂酰肌醇聚糖3蛋白(GPC3)的至少一種的 標(biāo)志抗原的檢測值在篩查個體前列腺癌的存在中的用途。本發(fā)明也公開了用于篩查人對象中的前列腺癌或肺癌，或?qū)ο笄傲邢侔┗蚍伟?治療分期的診斷裝置，包括(a)接受對象體液樣品的結(jié)構(gòu)，(b) —種抗體，其特異性針對 GPRllO的選定結(jié)構(gòu)域或表位，結(jié)合于所述結(jié)構(gòu)，能夠與所述結(jié)構(gòu)接受的體液反應(yīng)，并與其他 結(jié)合于該結(jié)構(gòu)的試劑一起產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)，指示包含所述表位或結(jié)構(gòu)域的GPRllO樣品 蛋白的存在，和(c)已知標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，根據(jù)此指標(biāo)，可檢測反應(yīng)所產(chǎn)生的水平可以被評定為與 前列腺癌或肺癌有關(guān)的增加水平。此裝置可以更普遍地用于篩查或分期以GPRllO水平增 加為特征的其它類型的人類癌癥。所述裝置的結(jié)構(gòu)可以包括多孔墊板，其中包埋有抗體，當(dāng)液體樣品加到墊板上時， 用于與所述樣品反應(yīng)，可檢測反應(yīng)可以用比色或熒光指標(biāo)指示，且已知的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)可以包
7括這樣的指標(biāo)，其代表包含相應(yīng)于前列腺癌或肺癌相關(guān)的表位或結(jié)構(gòu)域的表位或結(jié)構(gòu)域的 GPRllO 水平。所述裝置可以包括用于形成與產(chǎn)生的GPRllO的水平有關(guān)的信號的分光光度計測 量器，用于比較該信號與前列腺癌或肺癌相關(guān)的已知標(biāo)準(zhǔn)信號值的微處理器，和用于顯示 所述微處理器的輸出結(jié)果的顯示器。所述裝置中的抗-GPRllO結(jié)合蛋白可以是特異性針對包含在SEQ IDNO :1或SEQ ID NO 2中的表位的抗體。為了用于篩查人對象的前列腺癌，所述裝置的元件(b)可以進一步包括一種抗 體，其(i)特異性針對至少一種選自總前列腺特異性抗原(PSA)，游離PSA，和磷脂酰肌醇聚 糖3蛋白(GPC3)之一的標(biāo)志蛋白，(ii)與所述結(jié)構(gòu)結(jié)合和(iii)能夠與所述結(jié)構(gòu)接受的 體液反應(yīng)，與結(jié)合于該結(jié)構(gòu)的其它試劑一起，產(chǎn)生指示樣品中標(biāo)志蛋白水平的可檢測反應(yīng)， 和元件(c)可以進一步包括第二已知標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，根據(jù)該指標(biāo)，產(chǎn)生的可檢測的標(biāo)志蛋白反 應(yīng)水平，與可檢測的GPRllO水平一起，被評定為前列腺癌的指標(biāo)。兩個標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)可以被安 排為，例如，配對值，每個配對代表個體前列腺癌預(yù)先確定的可能性。本發(fā)明還公開了一種治療個體前列腺癌或肺癌的方法，步驟為(a)分別與同樣 組織的人細胞中GPRllO蛋白或RNA轉(zhuǎn)錄物的正常范圍比較，確定來自對象的癌癥組織細胞 是否有增加水平的GPRllO蛋白或RNA轉(zhuǎn)錄物，作為前列腺癌或肺癌的指標(biāo)，和(b)如果個 體有如此增加的GPRllO水平，施用治療有效量的GPRllO抗體，當(dāng)其與前列腺癌或肺癌細胞 免疫特異性反應(yīng)時有效抑制該細胞的生長或生存。GPRllO抗體可以是特異性針對包含在SEQ ID NO :1中的表位的人或人源化的 抗-GPRllO抗體。當(dāng)結(jié)合于前列腺癌或肺癌細胞表面的GPRllO時，該抗體可以有效促進抗 體依賴的細胞毒。該抗體可以偶聯(lián)于一種治療劑，當(dāng)該治療劑結(jié)合于或被摻入所述細胞，其 有效殺傷或抑制癌癥細胞。進一步公開的是一種減輕患有前列腺癌或肺癌的個體腫瘤負荷的方法，步驟為 (a)將對象抗原呈遞細胞暴露于人GPRl 10多肽或其抗原片段，和(b)通過暴露，刺激和引起 CD4輔助性T細胞，CD8細胞毒性淋巴細胞Tc和CD8非細胞毒性T抑制性淋巴細胞的克隆 性擴增，從而引起對象中GPRllO抗原特異性CD4輔助性T細胞，GPRllO抗原特異性CD8細 胞毒性淋巴細胞Tc和GPRllO抗原特異性CD8非細胞毒性T-抑制性淋巴細胞的擴增。所述暴露步驟可以包括，有效激活細胞的條件下，體外暴露對象抗原呈遞細胞于 人GPRllO多肽或其抗原片段，并將激活的細胞注射給對象?？蛇x擇地，暴露步驟可以包括將合適佐劑中攜帶的人GPRllO多肽或其片段注射
給對象。在一個相關(guān)的方面，本發(fā)明包括一種減輕患有前列腺癌或肺癌的對象腫瘤負荷的 方法，其是通過將合適佐劑中攜帶的人GPRllO多肽或其抗原片段注射給對象。在另外的方面，本發(fā)明包括一種篩選可以有效治療前列腺癌或肺癌的化合物的方 法。該方法包括將每一系列待檢化合物加入到其細胞表面表達GPRllO蛋白的細胞中的步 驟，在GPRllO激動劑或拮抗劑結(jié)合到細胞表面蛋白的情況下，會有效導(dǎo)致細胞狀態(tài)的可檢 測變化，加入每種待檢化合物，確定是否發(fā)生了此種細胞狀態(tài)的可檢測變化。在另外的方面，本發(fā)明包括分析物GPRllO或其片段或變體的檢測。試劑包括特異性針對GPRllO或片段的抗GPRllO抗體，和檢測標(biāo)簽或標(biāo)記，優(yōu)選共價結(jié)合于該抗體，當(dāng)結(jié) 合于被測物GPR110，其能用于檢測和/或定量出現(xiàn)的抗體量。閱讀了下面更充分描述的本發(fā)明內(nèi)容的條件下，本發(fā)明的這些和其他方面，目的， 優(yōu)點，和特點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖簡介

圖1顯示了小鼠GprllO基因座的基因組排列，為UCSC基因組網(wǎng)絡(luò)站點瀏覽器的 專門屏幕打印視圖(February 2006版mm8基因匯編)。頂部，在17號染色體上的堿基位 置?！癙icoSL3”下面的綠色垂直柱代表逆轉(zhuǎn)錄病毒整合到從單一腫瘤(754S-2)鑒定的基因 座。公共結(jié)構(gòu)域整合位點(68SB865H07-1)在“RTCGD”下面被標(biāo)明。圖2A-2C顯示了人前列腺腫瘤(2A)，良性前列腺增生(2B)，和正常組織(2C)的免 疫組化染色(棕色)。在正常組織或良性前列腺增生中通常觀察到?jīng)]有表達或低表達，而 在腫瘤組織中觀察到顯著的過表達。多克隆兔抗體血清與人GPRllO的1-590氨基酸殘基 (此處定義為SEQ ID NO 1)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的表位反應(yīng)，。圖3A和3B顯示了用抗-GPRllO抗體(3A)和抗-PSA抗體染人良性前列腺增生組 織的免疫組化染色(棕色)。箭頭指向一小組癌癥干細胞，其為GPRllO陽性和PSA陰性。 使用的GPRllO肽血清與圖2中描述的相同。圖4A和4B顯示了人肺腫瘤(4A)和正常組織(4B)的免疫組化染色(棕色)。正 常組織中觀察到不表達或低表達，而腫瘤組織中觀察到顯著的過表達。使用的肽血清與圖 2中描述的相同。圖5A和5B顯示了確定病人GPRllO水平的固相診斷裝置，在檢測初始階段(5A) 和最終階段(5B)。圖6顯示了依照本發(fā)明構(gòu)建的用于診斷前列腺癌或肺癌基因易感性的基因芯片 的一部分。圖7A和7B顯示了通過在兩份不同的正常和腫瘤肺組織中定量PCR檢測的 GPR110RNA的表達。⑶SB基因做為內(nèi)對照被檢測。相對于正常肺樣品的平均表達，計算每 份樣品的表達。發(fā)明詳述A 定義下列術(shù)語具有下面給出的定義，除非另在說明書中指明。“篩查”癌癥意味著診斷信息，單獨，或者與其他診斷信息一起，可以用于確定癌癥 的存在或不存在，或者癌癥可能性的增加，或者用于癌癥分類，例如，肺癌以GPRllO表達水 平升高為特征?！霸\斷肺癌或前列腺癌的其它指標(biāo)”指診斷試驗，而不是可以用于檢測或特征化癌 癥的存在或程度或類型的生物學(xué)指標(biāo)。典型的指標(biāo)包括X-線，CT掃描，或MRI成像方法獲 得的成像資料，或活組織的組織學(xué)觀察。癌癥的“分期”治療，依照本發(fā)明，包括基于檢測到的GPRllO水平確定個體的癌 癥分期和制定該期的療法。癌癥有四個公認分期，其通過癌癥細胞的定位和組織架構(gòu)的程 度定義。此外，癌癥可以被定義為早期(此時癌癥對很多基于激素的治療有反應(yīng))，和晚期(更嚴(yán)重的雄激素不依賴的階段)?！癎PRl 10的檢測水平”指野生型人GPR110，或者變體(例如，剪接變體或該蛋白突 變形式)，或GPRllO片段的檢測水平?！叭薌PRllO轉(zhuǎn)錄物的檢測水平”指編碼野生型人GPR110，或者變體(例如，剪接變 體或該蛋白突變形式)或GPRllO片段的RNA轉(zhuǎn)錄物的檢測水平。GPRllO “增加”或“高于正?！钡乃街咐缤ㄟ^免疫化學(xué)染色或檢測確定的該蛋 白或其片段或變體的水平比正常(非癌性的)個體群檢測的該蛋白的可檢測水平值高至少 約百分之五十。優(yōu)選地，GPRllO的水平至少比來自正常人的相似樣品的GPRllO值高三倍。GPRl 10RNA轉(zhuǎn)錄物“增加”或“高于正?！钡乃街咐?，通過PCR擴增和轉(zhuǎn)錄物分 離確定的轉(zhuǎn)錄物量的水平比正常(非癌性的)個體群檢測的該轉(zhuǎn)錄物的可檢測水平值高至 少約百分之五十。優(yōu)選地，GPRllO的水平至少比來自正常人的相似樣品的GPRllO值高三 倍?！罢?非癌性的)個體群檢測的GPRllO蛋白或其RNA轉(zhuǎn)錄物的可檢測水平值” 可以指，例如，5個或更多，優(yōu)選10個或更多正常個體群的該值的統(tǒng)計學(xué)均數(shù)或平均值，或 者可以指正常個體群中個體的GPRllO蛋白或轉(zhuǎn)錄物的最高記錄值。該數(shù)值通過使用以下 描述的檢測方法檢測來自所選樣品源例如肺或前列腺組織或者血液或血清樣品的GPRllO 或其轉(zhuǎn)錄物而迅速確定。應(yīng)理解正常值是從與檢測其中GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物水平增加的存 在的組織或樣品源相同類型的組織例如肺或前列腺組織或樣品源例如血液或血清樣品確 定的。"GPRl 10檢測”指一種檢測，其測定野生型或變體形式的GPRllO蛋白或其表位的 水平或存在，或測定編碼GPRllO蛋白或其片段的RNA轉(zhuǎn)錄物水平。B. GPRllO蛋白和表達人GPRllO基因編碼一個推定的孤立“粘附類型”G蛋白-偶聯(lián)受體，其生物學(xué) 功能和天然配體是未知的(refs. 1-3)。人GPRllO基因有兩種已知的同種型并被發(fā)現(xiàn)位 于染色體區(qū)6pl2.3。同種型1(NM_153840. 2)編碼一種推定的蛋白(NP_722582. 2)，具 有910個氨基酸(AA)，計算分子量(MW) 101234Da。同種型2 (NM_025048. 2)編碼一種推 定蛋白(NP_079324. 2)，具有218個氨基酸，計算分子量24745Da,和與同種型1相比獨 特的C-末端。小鼠GprllO基因(NM_133766. 1)被發(fā)現(xiàn)位于染色體區(qū)17B3;編碼的蛋白 (NP_598537. 1)具有908個氨基酸，計算分子量101338Da。人GPRllO蛋白是一種推定的細 胞表面7跨膜蛋白，包含G-蛋白-偶聯(lián)受體蛋白水解位點(GPS)結(jié)構(gòu)域和SEA結(jié)構(gòu)域，以 及幾個可能的靠近N-端的N-連結(jié)糖基化位點。C.鑒定GPRllO為癌癥基因癌癥基因(癌基因和腫瘤抑制基因)通過使用原病毒標(biāo)記以高通量方式定義。盡 管病毒還沒有被提示為人類癌癥的主要原因，利用腫瘤病毒的研究已經(jīng)導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了很多癌 基因和原癌基因。在病毒標(biāo)記中，小鼠被不包含癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(例如，小鼠白血 病病毒，MLV或小鼠乳腺瘤病毒，MMTV(4-8)。近來，通過使用轉(zhuǎn)座子，這種方法的宿主范圍 已被拓寬(9，10)。在逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染過程中，病毒整合到細胞基因組，將其DNA插入基因附近或 內(nèi)部，其導(dǎo)致各種結(jié)果(i)插入位點距離原癌基因太遠，從而不能活化原癌基因。在此情
10況下，不選擇該細胞。(ii)原病毒插入到一個原癌基因的200kb內(nèi)，但不在該基因內(nèi)(類型 1)。在此，或者病毒啟動子或者病毒增強子增加了該原癌基因的表達水平。(iii)原病毒插 入一個基因內(nèi)，破壞或改變其功能(類型2)。不選擇在不是原癌基因或腫瘤抑制基因的基 因中包含類型1或類型2插入事件的細胞。如果整合導(dǎo)致了腫瘤的形成，鄰近整合位點的 基因能夠被鑒定，可分類為原癌基因或者腫瘤抑制基因。本方法用于鑒定許多新原癌基因 和進一步證實通過與病毒癌基因的同源性特點發(fā)現(xiàn)的已知的原癌基因(7，8)。如果逆轉(zhuǎn)錄 病毒落入到一個基因內(nèi)并截短或破壞它，可以獲得一個腫瘤抑制基因。在這些情況下，該抑 制基因可以是單倍體不足的，或可選擇地，小鼠同時提供其它等位基因上的突變。整合事件 也能夠?qū)е赂鼜?fù)雜的結(jié)果，例如截短的基因產(chǎn)物或反義或微RNA的轉(zhuǎn)錄的顯性負面效應(yīng)。在用T淋巴細胞病毒SL3-3的篩選中，收獲包含原病毒整合入GprllO基因的內(nèi)含 子1中的小鼠腫瘤(圖1)。該整合引起GprllO基因的過表達。該基因的人類同源體是人 GPRllO 基因。D.人類腫瘤和正常組織中GPRllO的表達和RNA轉(zhuǎn)錄物GPRllO抗體的抗原性表位在人前列腺腫瘤中過表達(圖2A)，而良性前列腺增生 (BPH)細胞和前列腺腫瘤細胞的正常對應(yīng)部分沒有或只微弱表達GPRllO蛋白(圖2B，2C)， 說明該蛋白分布和/或局部量(密度)的增加可以診斷人前列腺癌。有時，一小亞類BPH 細胞被GPRllO抗體染色(圖3A，箭頭)。這些GPRllO陽性細胞缺乏PSA表達(圖3B，箭 頭)，并且符合被分類為前列腺癌干細胞。此外，GPRl 10抗體的抗原表位在人肺腫瘤內(nèi)也是過表達的(圖4A)，而這些腫瘤細 胞的正常對應(yīng)部分沒有或只微量表達GPRllO蛋白(圖4B)，說明該蛋白分布和/或局部量 (密度)的增加可以診斷人肺癌。更為普遍地，本發(fā)明提供了一種檢測通常只微弱表達或包含GPRllO的組織或其 他對象樣品例如血液或血清以確定癌癥存在和程度的方法。該方法尤其對檢測前列腺和肺 組織有用，例如確定病人前列腺癌和肺癌的亞型。在一種直接用于檢測前列腺和肺組織的 方法中，組織被標(biāo)記的特異性針對GPRllO的選擇結(jié)構(gòu)域或表位的抗體染色，例如，熒光標(biāo) 記抗體(見下面的E部分)，以將標(biāo)記連接到組織細胞?？蛇x擇地，組織用非標(biāo)記的GPRllO 抗體染色，細胞結(jié)合抗體復(fù)合物用第二標(biāo)記抗體標(biāo)記，例如攜帶熒光、比色或金_顆粒報道 子的第二抗體。根據(jù)相對于正常前列腺或肺細胞中標(biāo)志的分布和范圍的可檢測標(biāo)志增加的 分布和/或范圍(通常是兩者)來確定組織中前列腺癌或肺癌的存在，程度和分期。給結(jié) 合于組織學(xué)的組織樣品的抗體的程度和范圍評分的計分法眾所周知(例如，“Loda系統(tǒng)”)。 在本方法中，強度評分2+或3+和細胞染色評分2或3見于35% -40%的用抗GPRllO 抗體標(biāo)記的肺腫瘤。對于前列腺腫瘤，20%的腫瘤具有強度評分1和％細胞染色評分2。對 于良性前列腺增生樣品，當(dāng)用抗GPRllO抗體標(biāo)記時，70%的強度評分和％細胞染色評分都 為0 ；30%具有強度評分“痕量”或1，3%細胞評分1。為確證GPR110在肺癌中的作用，檢測兩種不同系列的正常和腫瘤肺組織中的 GPRl 10RNA轉(zhuǎn)錄物水平(使用外顯子連接(ExJ2_3) Taqman探針)。在第一系列組織中，被 檢測的15份肺腺癌腫瘤中的4份(2，3，6和13)顯示了比正常肺樣品高8倍到超過100倍 的GPR110RNA水平(圖7A)。在第二系列組織中，與正常肺樣品相比，40份肺癌樣品中的6 份具有從5倍到35倍GPRllO的過表達(圖7B)。此6份升高的樣品(27，33，34，和39)中的4份來自肺腺癌，剩下的2份(26和40)是鱗狀細胞癌。從兩個表達實驗總的來說，升高 的GPRllO表達可見于約20%的被檢測肺腫瘤。E.制備抗-GPRllO抗體該部分描述了抗-GPRllO抗體的產(chǎn)生，像在下面部分進一步描述的那樣，用于診 斷和治療目的。本發(fā)明使用的抗-GPRllO抗體能夠通過各種生產(chǎn)單克隆，多克隆，和/或重 組抗體的常規(guī)方法獲得。一種優(yōu)選的抗體，尤其用于診斷用途，是小鼠單克隆抗體，根據(jù)眾 所周知的雜交瘤方法制備。簡要地，可以首先獲得人GPR110，例如，通過表達GPRllO基因。 純化的GPRllO蛋白用作免疫原?？蛇x擇地，GPRllO的一部分肽可以用做致敏抗原。特別 地，為了產(chǎn)生特異性針對選擇的GPRllO表位或結(jié)構(gòu)域的抗體，定義該結(jié)構(gòu)域或表位的肽可 以用做免疫原。示例性的免疫原包括SEQ ID NO 1內(nèi)的氨基酸殘基代表的GPRllO表位。在診斷應(yīng)用中有用的抗-GPRllO抗體可以用多種可檢測標(biāo)簽標(biāo)記，包括可檢 測的報道子，例如用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的酶，可檢測的顆粒，例如金顆粒和 攜帶報道子的脂質(zhì)體，比色或熒光報道子，標(biāo)記例如量子點納米晶體顆粒(quantum dot nanocrystal particle)，放射性標(biāo)記，和標(biāo)記例如生物素標(biāo)記，其可以連接第二可檢測標(biāo) 記，例如可連接報道子標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素標(biāo)記。在一些檢測形式中，未標(biāo)記的抗GPRllO 抗體，例如，小鼠IgG抗體，通過與標(biāo)記的抗體如標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體反應(yīng)而被檢測。對于治療用途，具有GPRllO結(jié)合活性的人單克隆抗體能夠通過用GPRllO體外致 敏人淋巴細胞，和使致敏的淋巴細胞與具有永久分裂潛能的人源骨髓瘤細胞融合而產(chǎn)生。 可選擇地，做為抗原的GPRllO可以被施用給具有所有人類抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物，以獲 得抗-GPRllO抗體產(chǎn)生細胞，于是GPRl 10的人類抗體可以從永生化的抗-GPRllO抗體產(chǎn)生 細胞獲得。同樣用于治療用途，抗體可以偶聯(lián)于(用其衍生化)一種治療劑，例如毒素，錨定 于螯合形式的放射性標(biāo)記的金屬，或裝載抗腫瘤劑的載體例如脂質(zhì)體，其中抗體載體定位 于細胞表面，有效引起細胞膜的破壞(例如，通過載體與細胞膜的融合)，并釋放治療劑到 細胞內(nèi)。在另外的方法中，特異性針對GPRllO抗原的人或人源化抗體可以用重組技術(shù)制 備，例如已被報道過的那些(見，例如，美國專利6，090，382和6，258，562)。F.診斷方法和試劑在一個方面，本發(fā)明包括篩查人對象前列腺癌或肺癌的方法，所述方法通過以下 步驟進行(a)檢測對象樣品中人GPRllO或其RNA轉(zhuǎn)錄物水平，和(b)確定人GPRllO或其 RNA轉(zhuǎn)錄物的檢測水平是否分別比從多數(shù)正常人樣品確定的正常人個體的GPRllO或其轉(zhuǎn) 錄物水平至少高三倍。如果檢測水平比正常水平至少高三倍，該方法可以進一步包括通過 在對象中分別獨立檢驗肺癌或前列腺癌的方法檢測肺癌或前列腺癌的存在，其中獨立檢驗 可以在步驟(a)和(b)之前，同時或以后進行。例如，當(dāng)獨立檢驗先于GPRllO檢測，該獨立檢驗可以表明肺癌或前列腺腫瘤的存 在，并且GPRllO檢測隨后被用于確證癌癥的存在和/或指明癌癥是以GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物 水平增加為特征的類型。當(dāng)獨立檢驗與GPRllO檢測同時進行，該方法提供檢測結(jié)果，其中 兩個或更多的癌癥標(biāo)志包括GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物被用于檢測個體中的肺癌或前列腺癌。在 第三種實施方案中，獨立檢驗可以在GPRllO檢測之后進行，以證明肺癌或前列腺癌的診
12斷，和/或表明癌癥是以GPRllO或其變體的增加的水平的存在為特征的類型。所述方法的一種實施方案中，對象樣品是肺或前列腺組織學(xué)的組織樣品，已經(jīng)在 上面描述。在該實施方案中，樣品被制備用于組織學(xué)檢測，在抗體結(jié)合具有GPRllO表位的 細胞的有效條件下，用特異性針對GPRllO表位的抗GPRllO抗體染色。與樣品相關(guān)的抗體 水平可以使用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法確定，例如總體染色或熒光的檢測，或在抗-GPRllO抗體被 放射性標(biāo)志標(biāo)記的情況下通過放射性水平的檢測。該方法的一種實施方案中，對象樣品是血液或血清樣品，在下面詳述。該實施方案 包括在抗體結(jié)合GPRllO表位的有效條件下，使樣品與特異性針對GPRllO表位的抗GPRllO 抗體接觸，和分離未結(jié)合抗體和結(jié)合于GPRl 10表位的抗體，檢測結(jié)合于GPRl 10表位的抗體 的水平。具有固定的抗-GI^R測定的固相-條帶檢測裝置用于捕獲樣品中的GPR110，在下面 討論。優(yōu)選的體液樣品是血液，尿液和唾液。尿液被檢測的情況下，指示前列腺癌或肺癌的 GPRllO的檢測水平典型地處于大于約lng/ml樣品液體的范圍。第三種普遍實施方案中，對象樣品是肺或前列腺組織，用于檢測GPRllO轉(zhuǎn)錄物， 參照圖7A和7B在上面詳述。在此實施方案中，組織樣品被處理，從中提取RNA轉(zhuǎn)錄物，依 照公知的方法，編碼GPRllO蛋白至少一個片段的RNA轉(zhuǎn)錄物水平由標(biāo)準(zhǔn)方法確定，例如通 過PCR序列特異性擴增，或其它方法，包括序列特異性探針。更普遍地，GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的檢測，做為診斷前列腺癌或肺癌的存在、程度、或 分期的一種輔助，可以單獨或與前列腺癌或肺癌相關(guān)的另外的標(biāo)志蛋白的檢測和篩查聯(lián)合 使用。生物標(biāo)記或標(biāo)志蛋白指任何可檢測的生物分子，其中改變的表達，分布或該生物標(biāo)記 的特定形式與生理條件例如疾病狀態(tài)的存在、程度或分期相關(guān)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解， 不需要生物標(biāo)記和生理條件之間有嚴(yán)格的關(guān)聯(lián)，在生物標(biāo)記和生理條件之間只存在統(tǒng)計學(xué) 顯著性關(guān)聯(lián)。另外的生物標(biāo)記可以選自，但不限于，前列腺特異性抗原(PSA)，包括總的PSA 或游離的PSA或兩者，磷脂酰肌醇聚糖3蛋白(GPC3)和其組合。在另外的生物標(biāo)記是PSA的情形下，根據(jù)本領(lǐng)域的方法，對于總PSA、游離PSA或其 組合可以如上述確定PSA的水平或分布。在一些例子中，總PSA和fPSA的水平，在本領(lǐng)域 通常表示為fPSA對總PSA的比例，可以與GPRllO的檢測聯(lián)合使用。PSA檢測可以在與檢測 GPRllO所使用的相同或不同的生物學(xué)樣品上進行。例如，為了篩查男性人對象前列腺癌，上 面描述的本方法中的步驟(a)可包括使樣品與特異性針對前列腺特異性抗原(PSA)的抗體 反應(yīng)，以產(chǎn)生與樣品中PSA水平相關(guān)的反應(yīng)產(chǎn)物，步驟(b)可以包括與非癌性人群樣品中的 PSA的正常范圍比較，確定PSA的水平。另外的生物標(biāo)記GPC3的特點在于硫酸肝素蛋白多糖，其通過糖基化磷脂酰肌醇 錨定在細胞膜上。該蛋白分子量65. 6kDa，多肽鏈有580個氨基酸殘基。該蛋白多糖的硫酸 肝素鏈與肝素結(jié)合生長因子相互作用，從而作為細胞信號的共受體，盡管GPC3也可以其它 方式結(jié)合。在胚胎發(fā)育中，GPC3調(diào)節(jié)腎臟分支形態(tài)發(fā)生過程中BMP和EGF-介導(dǎo)效應(yīng)。它 也控制肢體成型和骨骼發(fā)育中對BMP4的細胞反應(yīng)。GPC3蛋白的水平在前列腺癌組織中增 加。其做為前列腺癌的特異生物標(biāo)記的用途和其檢測方法，例如通過特異結(jié)合于GPC3的 抗體的檢測，在系列號為11/325,847的美國共同申請中描述。檢測GPC3的方法可以使用 特異性結(jié)合于GPC3的抗體，例如多克隆，單克隆，或重組抗體。一種示例性抗體，尤其用于 診斷用途，包括小鼠單克隆抗體，其根據(jù)公知的雜交瘤方法制備。簡要地，可以首先獲得人GPC3，例如，通過表達 GPC3(MXR7)基因，如 Lage，H.等(Gene 188 (1997)，151-156)公開的 那樣。純化的GPC3蛋白被用做免疫原?？蛇x擇地，GPC3的一部分肽可以被用做致敏抗原。 部分肽可以通過從人GPC3氨基酸序列化學(xué)合成獲得。例如可以應(yīng)用的示例GPC3序列包括 但不限于,DLFIDKKVLKVAHVEHEET，SEQ ID NO 3 (氨基酸殘基365到383，由外顯子4編碼) 和LAYDLDVDDAPGNSQQ, SEQID NO 4 (氨基酸殘基526到541，由外顯子8編碼)等?？紤]到 GPR3的序列已知，用于產(chǎn)生直接針對GPC3的抗體的其它肽對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易 見的。檢測可以通過多種用于檢測體液抗原的測定方法中的任一種實現(xiàn)，包括ELISA技 術(shù)，均相法，例如，包括熒光淬滅，和多種固相夾心檢測，其中GPRllO抗原被固相支持物上 攜帶的抗-GPRllO抗體捕獲，固定的抗原_抗體復(fù)合物被第二抗-GPRllO抗體標(biāo)記，例如， 攜帶比色或金-顆粒報道子的第二抗體。圖5A和5B說明了依照本發(fā)明的一個實施方案構(gòu)建的固相檢測條，其適于進行剛 才提到夾心免疫測定，并且分別顯示了開始和最終的檢測狀態(tài)。檢測條，總體顯示在10處， 包括多孔支持物或墊12，其具有在支持物上游區(qū)的加樣區(qū)14和在下游區(qū)的樣品檢測區(qū)16。 加樣區(qū)包括可檢測的抗-GPRSlO抗體試劑，例如，標(biāo)記金顆粒的抗GPRllO抗體，以非結(jié)合， 即，非固定形式攜帶在該區(qū)內(nèi)。該試劑由實心圓標(biāo)示，例如在18處。與標(biāo)記的抗體試劑中 的抗體相同或不同的抗GPRllO抗體被固定于固體支持物的檢測區(qū)內(nèi)，由“Y”形標(biāo)示，例如 在20處。還顯示了參照區(qū)22，其定位鄰近于檢測區(qū)，具有一個或多個有顏色的或陰影區(qū)，對 應(yīng)體液標(biāo)本中GPRllO的不同檢測水平。在實施方案中顯示，區(qū)22包括三個區(qū)域22a，22b， 和22c，分別對應(yīng)GPRllO的以下檢測水平(a)低于癌癥相關(guān)的水平，(b)對應(yīng)較低的癌癥 相關(guān)閾值水平，和(c)比22b區(qū)的閾層值明顯高的水平，如，2-3倍。這三個區(qū)域提供了一種 已知的標(biāo)準(zhǔn)指示，照此指示，產(chǎn)生的可檢測反應(yīng)水平可以被評估作為與前列腺癌或肺癌相 關(guān)的水平。檢測條和參考區(qū)一起組成了檢測裝置，用于在人對象內(nèi)篩查前列腺癌或肺癌，或 用于人對象前列腺癌或肺癌的分期治療。在實施中，已知量的待檢體液樣品被加入到檢測條的加樣區(qū)，其彌散入該區(qū)，使得 抗體試劑與樣品中的GPRllO抗原反應(yīng)以形成抗原_抗體復(fù)合物。然后該復(fù)合物和未結(jié)合 抗體試劑借毛細作用移往下游檢測區(qū)，在該處抗原-抗體復(fù)合物由固定的抗體捕獲，未結(jié) 合試劑被帶到支持物的末端，如24處所示。正如所能理解的，體液中的抗原濃度越高，檢測 區(qū)捕獲的試劑濃度越高，該區(qū)內(nèi)的顏色或強度越大。所述檢測區(qū)產(chǎn)生的顏色或強度與參照 區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)比較，以確定與前列腺癌或肺癌存在或不存在相關(guān)的GPRllO的定性水平。如果在 檢測中觀察到高于閾值水平的GPR110，該對象可以歸類于存在可能性更高的癌癥類型，并 且該對象可以被推薦進行另外的檢查和/或更經(jīng)常的檢查。在另外一個實施方案中，檢測裝置包括如同上述的檢測條，但其已知的參照指示 是由檢測條閱讀儀器提供的，閱讀器具有⑴接受檢測條的閱讀槽，( )光源和光學(xué)檢測， 例如，分光光度計測量器，用于在檢測條的檢測區(qū)測量與檢測相關(guān)的光學(xué)情況，(iii)電子 的或處理器單元，其記錄和處理來自光學(xué)檢測器的信號，并轉(zhuǎn)換該信號為GPRllO的檢測水 平，和(iv)用戶顯示屏或窗。該儀器可以報告檢測的體液樣品實際的GPR110，允許操作者 比較顯示值與檢測條或儀器提供的已知標(biāo)準(zhǔn)指示水平，以評估是否該個體有與前列腺癌或
14肺癌相關(guān)聯(lián)的GPRllO水平的增加，或為了治療設(shè)計，評估癌癥的可能階段?？蛇x擇地，儀器 自身可以包含儲存的已知標(biāo)準(zhǔn)指示水平，其可以在內(nèi)部與檢測的水平比較，以產(chǎn)生指明是 否檢測到了與前列腺癌或肺癌相關(guān)聯(lián)的GPRllO的增加水平的輸出信號，或指明癌癥的階 段。為了檢測多種標(biāo)志蛋白，剛才描述的檢測裝置可以怎樣被改變，是能夠被理解的， 特別地，為了篩查或檢測前列腺癌，GPRllO蛋白與總PSA，游離PSA和/或GPC3組合。每個 標(biāo)記可以在限定了標(biāo)記-特異性抗體的單獨檢測條中檢測，裝置可以進一步包括多種參照 區(qū)，每個區(qū)提供已知標(biāo)準(zhǔn)指示，并由此可檢測的標(biāo)記蛋白反應(yīng)產(chǎn)生的水平可以被評估，與可 檢測的GPRllO水平一起，做為前列腺癌的指標(biāo)?？蛇x擇地，在電子檢測裝置中，多種標(biāo)志的參照值可以被存儲或用元組值代表，例 如，配對值，其中元組中的每個值代表給定標(biāo)志的癌癥指示值，所以通過對照儲存的元組 值，分析多個值檢測結(jié)果，基于與多種標(biāo)志的相關(guān)性，該裝置可以確定癌癥風(fēng)險。G.鑒定與癌癥相關(guān)的基因突變在另一個方面，本發(fā)明提供了一種鑒定與人對象體內(nèi)癌癥風(fēng)險增加相關(guān)的突變， 所述癌癥例如前列腺癌或肺癌。以下部分描述與前列腺癌或肺癌有關(guān)；但是，應(yīng)理解該方法 可以實施加于其它導(dǎo)致GPRllO表達增加的癌癥。實施該方法時，從患有前列腺癌或肺癌的 病人中提取基因組DNA，所述病人優(yōu)選包括選自代表不同種族和年齡組的男性或女性的病 人。DNA序列或被檢測區(qū)，特別地，是⑴人GPRllO基因的啟動子或15kB內(nèi)的或不超過外 顯子1的5’UTR區(qū)，(ii)同一個基因5kB內(nèi)的或不超過外顯子15的3’UTR區(qū)，和(iii)同 一個基因外顯子1-15之內(nèi)。位于上述區(qū)域的一個或多個位點的突變，包括基因擴增，通過比較每個序列和來 自正常(野生型)前列腺或肺組織的同一個區(qū)域的序列被鑒定。優(yōu)選地，確定來自許多野 生型個體的序列以保證真實的野生型序列。對于每份提取的DNA，比較病人序列和野生型序 列，以鑒定病人序列中的突變，從而鑒定可能與前列腺癌或肺癌風(fēng)險增加有關(guān)的突變。一旦大量的這些突變例如至少50-200或更多被鑒定，其可以被用于構(gòu)建基因篩 查裝置，例如，基因芯片，其對篩查個體對前列腺癌或肺癌的基因易感性有用。在一種實施 方案中，所述裝置包括基因芯片，其如圖6中30所示，具有陣列區(qū)，如區(qū)34，36，各自包含結(jié) 合的已知序列片段，如區(qū)34內(nèi)的片段37。片段或探針長度優(yōu)選25-27個堿基，各自包括上 文鑒定的GPRllO基因上游與前列腺癌或肺癌相關(guān)的突變之一?；蛐酒瑯?gòu)建和用這樣的 芯片檢測突變序列是公知的。在一種有代表性的基因篩查方法中，獲得病人細胞，提取基因組DNA，使用熒光素 化探針通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增感興趣的序列區(qū)。擴增的物質(zhì)于隨后在適于雜交的條件下與芯片 陣列的序列反應(yīng)，清洗陣列表面以去除未結(jié)合物質(zhì)，接著用合適的芯片閱讀器掃描以鑒定 與前列腺癌或肺癌相關(guān)的任何突變序列。附圖顯示了將標(biāo)記的基因組DNA片段(標(biāo)明為42 處)結(jié)合到具有結(jié)合的探針分子40的陣列區(qū)38。測定該陣列區(qū)的熒光信號可診斷臨界上 游GPRllO區(qū)中的已知基因突變，能夠診斷對前列腺癌或肺癌的基因易感性。在另一可選實施方案中，如上面被鑒定的突變用于構(gòu)建一系列分子倒位探針 (MIPs)，其能夠鑒定基因突變的存在。構(gòu)建和使用MIPs用于鑒定基因突變已經(jīng)描述過(見， 例如，參考文獻11)。
H.治療方法和藥物制劑該發(fā)明也包括治療以癌癥細胞中GPRllO表達增加為特征的癌癥的方法，例如，減 輕人對象的腫瘤負荷。下面部分的描述與前列腺癌或肺癌相關(guān)；但是，應(yīng)理解該方法可以用 于以GPRllO表達增加為特征的其它癌癥。在一種方法中，GPRllO抗原，例如，全長GPRllO或一個抗原肽，如，上面公開的 GPRllO肽中的一個，如包含來自SEQ ID NO :1之一的氨基序列被用于激活參與誘導(dǎo)特異 性針對前列腺癌或肺癌細胞的細胞毒性T細胞的免疫細胞。在一種實施方案中，在有效激 活細胞的條件下例如存在GM-CSF的條件下，其可以通過離體暴露將從病人獲得的抗原呈 遞細胞給GPRllO抗原實現(xiàn)。一旦被離體激活，該細胞再返回到病人體內(nèi)，在那里激活的細 胞有效刺激抗腫瘤的細胞毒性T細胞的克隆性擴增。該免疫治療方法在例如美國專利號 6，080，409和其中引用的相關(guān)文獻中描述?？蛇x擇地，GPRllO抗原可以作為疫苗施用給病人，通常其存在于合適的佐劑中，例 如包含GM-CSF的佐劑。該肽疫苗有效地刺激和引起⑶4輔助性T細胞，⑶8Tc細胞毒性淋 巴細胞和CD8非細胞毒性T-抑制性淋巴細胞的克隆性擴增，引起個體內(nèi)GPRllO抗原特異 性⑶4輔助性T細胞，GPRllO抗原特異性⑶8Tc細胞毒性淋巴細胞和GPRllO抗原特異性 CD8非細胞毒性T-抑制性淋巴細胞的擴增。制備適于注射的包含抗原的組合物，和免疫刺激細胞毒性T細胞合適的抗原劑量 已經(jīng)在很多關(guān)于免疫治療誘導(dǎo)T細胞的專利和發(fā)表文獻中描述。那些方法在涉及治療前列 腺癌或肺癌的GPRllO抗原的本方法中是可應(yīng)用的。治療之后，監(jiān)測病人癌癥狀態(tài)的變化， 特別是通過聯(lián)合腫瘤可視化方法，例如MRI或CAT掃描，和監(jiān)測包括GPRllO自身的前列腺 癌或肺癌相關(guān)抗原的水平。在另外一種常用的免疫治療方法中，依照上述的檢測方法，診斷患有前列腺癌或 肺癌的病人首先被確證具有GPRllO水平的升高。如果該檢測中所述對象檢驗呈陽性，他或 她通過施用抗-GPRllO抗體被治療。優(yōu)選地，該抗體是人的或人源化抗體，如上面描述的那 樣制備，并通過在合適的生理學(xué)載體中靜脈注射或皮下注射而施用?？贵w量優(yōu)選1到IOmg/ 針劑，病人以每14天左右的間隔進行治療。在治療過程中，監(jiān)視病人癌癥狀態(tài)的變化(通 常通過聯(lián)合腫瘤可視化方法)和前列腺癌或肺癌相關(guān)抗原的水平，如上所述。該療法可以 與其他前列腺癌或肺癌的治療方法包括藥物或放射性同位素療法聯(lián)合進行，并且可以持續(xù) 直至觀察到腫瘤體積理想的縮小。GPRllO抗體可以是人或人源化抗體，當(dāng)結(jié)合于前列腺癌 或肺癌細胞表面的GPRllO時，有效地促進抗體-依賴的細胞毒作用。該抗體可以用治療劑 例如毒素衍生，當(dāng)偶聯(lián)物結(jié)合于該細胞或被細胞吸收，有效地殺傷或抑制癌癥細胞。I基于細胞的化合物篩選通常，多種表達系統(tǒng)和分析被用于評價G蛋白-偶聯(lián)受體(GPCR)的功能和鑒定做 為激動劑和拮抗劑的化合物。參考文獻12-14綜述了目前普遍針對GPCR的藥物化合物篩 選的高通量方法。在大規(guī)模篩選方案中，GPCR通常使用基于細胞的重組表達系統(tǒng)表達，包 括酵母，昆蟲(桿狀病毒)，非洲爪蟾屬卵母細胞，和哺乳動物細胞系。盡管確定GPCR的藥 理學(xué)活性傳統(tǒng)上是通過進行放射示蹤標(biāo)記的配體結(jié)合實驗處理的，簡單受體結(jié)合使用非放 射活性的方法，如熒光偏振和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，也可以被檢測。GPRC與下游信號通路的功能性偶聯(lián)可以通過測定下游事件如細胞內(nèi)鈣動員的標(biāo)
16準(zhǔn)實驗評估。使用這些基于細胞的實驗，目的GPCR例如在哺乳動物細胞內(nèi)連同泛宿主性的 自然存在的G蛋白如Gil5/16 (或其聯(lián)合體)或泛宿主性的改造的嵌合G-蛋白一起表達，后二 者都可以與多個GPCR偶聯(lián)并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號；細胞內(nèi)鈣的增多可以利用標(biāo)準(zhǔn)鈣-敏感熒光染料檢 測。為了檢測更多的即時第二信使信號分子，如cAMP和花生四烯酸，可以使用基因報告載 體，其中cAMP結(jié)合位點例如與螢光素酶融合基因偶聯(lián)?？蛇x擇地，基于熒光的系統(tǒng)可以用 于檢測與GPCR脫敏作用有關(guān)的蛋白例如B-抑制蛋白2的易位。其他類型的表達系統(tǒng)包括 在非洲爪蟾屬黑素細胞中表達GPCR，其中GPCR活性通過檢測黑素細胞中存在的內(nèi)源色素 的色散或凝結(jié)來測定。盡管本發(fā)明就特定實施方案和應(yīng)用作了闡述，仍可以在不脫離要求保護的本發(fā)明 情況下，進行多種變化和修改，這是可以理解的。序列表SEQ ID NO :1人GPRllO蛋白的N-末端細胞外結(jié)構(gòu)域(同種型1)(殘基1-590)MKVGVLWLISFFTFTDGHGGFLGKNDGIKTKKELIVNKKKHLGPVEEYQLLLQVTYRDSKEKRDLRNFLKLLKPPLLWSHGLIRIIRAKATTDCNSLNGVLQCTCEDSYTWFPPSCLDPQNCYLHTAGALPSCECHLNNLSQSVNFCERTKIWGTFKINERFTNDLLNSSSAIYSKYANGIEIQLKKAYERIQGFESVQVTQFRNGSIVAGYEVVGSSSASELLSAIEHVAEKAKTALHKLFPLEDGSFRVFGKAQCNDIVFGFGSKDDEYTLPCSSGYRGNITAKCESSGWQVIRETCVLSLLEELNKNFSMIVGNATEAAVSSFVQNLSVIIRQNPSTTVGNLASVVSILSNISSLSLASHFRVSNSTMEDVISIADNILNSASVTNWTVLLREEKYASSRLLETLENISTLVPPTALPLNFSRKFIDWKGIPVNKSQLKRGYSYQIKMCPQNTSIPIRGRVLIGSDQFQRSLPETIISMASLTLGNILPVSKNGNAQVNGPVISTVIQNYSINEVFLFFSKIESNLSQPHCVFWDFSHLQWNDAGCHLVNETQDIVT CQCTHLTSFSILMSPFVPSTIFPVVKffITYSEQ ID NO 2 人 GPRllO 蛋白(同種型 1)(殘基 1-910)MKVGVLWLISFFTFTDGHGGFLGKNDGIKTKKELIVNKKKHLGPVEEYQLLLQVTYRDSKEKRDLRNFLKLLKPPLLffSHG LIRIIRAKATTDCNSLNGVLQCTCEDSYTWFPPSCLDPQNCYLHTAGALPSCECHLNNLSQSVNFCERTKIWGTFKINERFTNDLLNSSSAIYSKYANGIEIQLKKAYERIQGFESVQVTQFRNGSIVAGYEVVGSSSASELLSAIEHVAEKAKTALHKLFPLEDGSFRVFGKAQCNDIVFGFGSKDDEYTLPCSSGYRGNITAKCESSGWQVIRETCVLSLLEELNKNFSMIVGNATEAAVSSFVQNLSVIIR
17
QNPSTTVGNLASVVS
ILSNISSLSLASHFRVSNSTMEDVISIADNILNSASVTNWTVLLREEKYASSRLLET
LENISTLVPPTAL
PLNFSRKFIDWKGIPVNKSQLKRGYSYQIKMCPQNTSIPIRGRVLIGSDQFQRSL
PETIISMASLTLGNI
LPVSKNGNAQVNGPVISTVIQNYSINEVFLFFSKIESNLSQPHCVFWDFSHLQW
NDAGCHLVNETQDIVT
CQCTHLTSFSILMSPFVPSTIFPVVKWITYVGLGISIGSLILCLIIEALFWKQIKKSQ
TSHTRRICMVNI
ALSLLIADVWFIVGATVDTTVNPSGVCTAAVFFTHFFYLSLFFWMLMLGILLAYRII
LVFHHMAQHLMMA
VGFCLGYGCPLIISVITIAVTQPSNTYKRKDVCWLNWSNGSKPLLAFVVPALAIV
AVNFVVVLLVLTKLff
RPTVGERLSRDDKATIIRVGKSLLILTPLLGLTWGFGIGTIVDSQNLAWHVIFALL
NAFQGFFILCFGIL
LDSKLRQLLFNKLSALSSWKQTEKQNSSDLSAKPKFSKPFNPLQNKGHYAFSH
TCDSSDNIMLTQFVSNE
SEQ ID NO 3 (365至383氨基酸殘基，由外顯子4編碼)
DLFIDKKVLKVAHVEHEET
SEQ ID NO 4(526至541氨基酸殘基，由外顯子8編碼)
LAYDLDVDDAPGNSQQ
權(quán)利要求
一種在人對象中篩查肺癌或前列腺癌的方法，包括(a)檢測對象樣品中的人GPR110或其RNA轉(zhuǎn)錄物的水平(b)確定人GPR110或其RNA轉(zhuǎn)錄物的檢測水平是否分別比從大多數(shù)正常人樣品確定的正常人對象內(nèi)GPR110或其轉(zhuǎn)錄物水平高至少三倍。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中對象樣品是肺或前列腺的組織學(xué)組織樣品，步驟(a) 包括，在對抗體結(jié)合到具有GPRllO表位的細胞有效的條件下將所述樣品與特異性針對 GPRllO表位的抗-GRPllO抗體接觸，并檢測結(jié)合于所述樣品的抗體水平，和步驟(b)包括確 定與對象肺或前列腺組織樣品結(jié)合的抗體的檢測水平是否分別比結(jié)合于從正常個體獲得 的人肺或前列腺組織樣品的抗-GPRllO抗體的檢測水平高至少三倍。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體特異性針對SEQID NO :1中氨基酸殘基代表 的GPRllO表位。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(a)中的抗-GPRllO抗體是放射性標(biāo)記的GPRllO 抗體，步驟(a)包括通過閃爍掃描法檢測所述組織內(nèi)局部化的放射性標(biāo)記的水平。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中對象樣品是對象血液或血清樣品，步驟(a)包括在對抗 體結(jié)合GPRllO表位有效的條件下將所述樣品與特異性針對GPRllO表位的抗-GPRllO抗體 接觸，從未結(jié)合抗體分離結(jié)合于GPRllO表位的抗體，并檢測結(jié)合于GPRllO表位的抗體的水 平，和步驟(b)包括確定結(jié)合于GPRllO表位的抗體的檢測水平是否比結(jié)合于從正常個體獲 得的血液或血清樣品中存在的GPRllO表位的抗-GPRllO抗體的檢測水平高至少三倍。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中步驟(a)包括將血液或血清樣品體液施加于固相免疫 分析裝置，其中樣品中的GPRllO水平由比色或熒光指標(biāo)定性表示，確定步驟包括將該指標(biāo) 與已知標(biāo)準(zhǔn)比較。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中對象樣品是肺或前列腺組織樣品，步驟(a)包括處理樣 品以從中提取RNA轉(zhuǎn)錄物并檢測編碼GPRl 10蛋白至少一個片段的RNA轉(zhuǎn)錄物的水平，和步 驟(b)包括確定RNA轉(zhuǎn)錄物的檢測水平是否比從正常個體獲得的肺或前列腺組織樣品中編 碼GPRllO蛋白至少一個片段的轉(zhuǎn)錄物的檢測水平高至少三倍。
8.通過檢測肺癌或前列腺癌的診斷性生物學(xué)標(biāo)志或其他指標(biāo)的降低或升高的水平來 篩查肺癌或前列腺癌存在的方法中的改進，包括(a)檢測對象樣品中人GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的水平，和(b)確定人GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的檢測水平是否分別比從多數(shù)正常人樣品確定的正常 人個體中GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的水平高至少三倍，作為肺癌或前列腺癌存在的另一個指標(biāo)。
9.權(quán)利要求8所述的改進，其中對象樣品是對象肺或前列腺組織學(xué)組織樣品，步驟(a) 包括在對抗體結(jié)合具有GPRllO表位的細胞有效的條件下將所述樣品與特異性針對GPRllO 表位的抗-GPRllO抗體接觸，檢測結(jié)合于所述樣品的抗體水平，和步驟(b)包括確定結(jié)合對 象肺或前列腺組織樣品的抗體的檢測水平是否分別比結(jié)合于從正常個體獲得的人肺或前 列腺組織樣品的抗GPRllO抗體的檢測水平高至少三倍。
10.權(quán)利要求9所述的改進，其中所述抗體是特異性針對SEQIDNO :1中氨基酸殘基代 表的GPRllO表位。
11.權(quán)利要求9所述的改進，其中步驟(a)中的抗-GPRllO抗體是放射性標(biāo)記的 GPR1110抗體，步驟(a)包括通過閃爍掃描檢測所述組織中局部化的放射性標(biāo)記的水平。
12.權(quán)利要求9所述的改進，其中對象樣品是對象血液或血清樣品，步驟(a)包括在對 抗體結(jié)合GPRllO表位有效的條件下將所述樣品與特異性針對GPRllO表位的抗GPRllO抗 體接觸，從未結(jié)合抗體分離結(jié)合于GPRl 10表位的抗體，并檢測結(jié)合于GPRl 10表位的抗體的 水平，和步驟(b)包括確定結(jié)合于GPRllO表位的抗體檢測水平是否比結(jié)合于從正常個體獲 得的血液或血清樣品中存在的GPRllO表位的抗-GPRllO抗體的檢測水平高至少三倍。
13.權(quán)利要求12所述的改進，其中步驟(a)包括將血液或血清樣品體液施加于固相免 疫分析裝置，其中樣品中的GPRllO水平由比色或熒光指標(biāo)定性表示，確定步驟包括將該指 標(biāo)與已知標(biāo)準(zhǔn)比較。
14.權(quán)利要求8所述的改進，其中對象樣品是肺或前列腺組織樣品，步驟(a)包括處理 樣品以從中提取RNA轉(zhuǎn)錄物和檢測編碼GPRllO蛋白至少一個片段的RNA轉(zhuǎn)錄物的水平，和 步驟(b)包括確定RNA轉(zhuǎn)錄物的檢測水平是否比從正常個體獲得的肺或前列腺組織樣品中 的編碼GPRllO蛋白至少一個片段的轉(zhuǎn)錄物的檢測水平高至少三倍。
15.權(quán)利要求8所述的改進，所述改進是在檢測男性對象中的前列腺癌方法中，其通過 將對象體液樣品與特異性針對選自總前列腺特異性抗原(PSA)，游離PSA，和磷脂酰肌醇蛋 白聚糖3(GPC3)之一的至少一種標(biāo)志蛋白的抗體反應(yīng)，并確定該對象是否具有增加水平的 至少一種所述標(biāo)志蛋白，作為前列腺癌的指標(biāo)。
16.來自人對象的血液或血清樣品中GPRllO檢測值和選自總前列腺特異性抗原 (PSA)，游離PSA和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的至少一種標(biāo)志抗原的檢測值在篩查對象 前列腺癌存在中的用途。
17.用于篩查人對象中前列腺癌或肺癌或給對象前列腺癌或肺癌治療分期的一種診斷 裝置，包括(a)接受來自對象的體液樣品的結(jié)構(gòu)(b)一種抗體，其特異性針對GPRllO的選定結(jié)構(gòu)域或表位，結(jié)合于所述結(jié)構(gòu)，能夠與所 述結(jié)構(gòu)接受的體液反應(yīng)，并與其他結(jié)合于該結(jié)構(gòu)的試劑一起產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)，指示包含 所述表位或結(jié)構(gòu)域的GPRllO樣品蛋白的存在，(c)第一已知標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，根據(jù)此指標(biāo)，可檢測反應(yīng)所產(chǎn)生的水平可以被評定為與前列腺 癌或肺癌有關(guān)的水平增加。
18.權(quán)利要求17所述的裝置，其中該裝置內(nèi)的結(jié)構(gòu)包括多孔墊板，其中包埋抗體，當(dāng)液 體樣品加到墊板上時用于與樣品反應(yīng)，可檢測反應(yīng)用比色或熒光指標(biāo)指示，且已知的標(biāo)準(zhǔn) 指標(biāo)包括這樣的標(biāo)記，其代表包含相應(yīng)于與前列腺癌或肺癌相關(guān)的表位或結(jié)構(gòu)域的表位或 結(jié)構(gòu)域的GPRllO的水平。
19.權(quán)利要求18所述的裝置，進一步包括用于產(chǎn)生與產(chǎn)生的GPRllO水平相關(guān)的信號 的分光光度計測量器，用于比較該信號與前列腺癌或肺癌相關(guān)的已知標(biāo)準(zhǔn)信號值的微處理 器，和用于顯示該微處理器的輸出結(jié)果的顯示器。
20.權(quán)利要求18所述的裝置，其中裝置內(nèi)的抗-GPRllO結(jié)合蛋白是特異性針對包含在 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中的表位的抗體。
21.一種治療對象前列腺癌或肺癌的方法，包含(a)與同樣組織的人細胞中的GPRllO或其轉(zhuǎn)錄物的正常范圍比較，確定是否來自對象 的癌癥組織細胞有增加水平的GPRllO蛋白或RNA轉(zhuǎn)錄物，作為前列腺癌或肺癌的指標(biāo)，和(b)如果該對象有如此增加的GPRllO或轉(zhuǎn)錄物水平，施用治療有效量的GPRllO抗體， 當(dāng)其與前列腺癌或肺癌細胞發(fā)生免疫特異性反應(yīng)時有效抑制該細胞的生長或生存。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中GPRllO抗體是特異性針對包含在SEQID N0:1中 的表位的人或人源化的抗-GPRllO抗體。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中當(dāng)結(jié)合于前列腺癌或肺癌細胞表面的GPRllO時，該 抗體有效促進抗體依賴性細胞毒。
24.權(quán)利要求21所述的方法，其中該抗體偶聯(lián)于治療劑，當(dāng)該治療劑結(jié)合或摻入所述 細胞時能有效殺傷或抑制癌癥細胞。
全文摘要
公開了檢測和治療前列腺癌和肺癌的方法。在實施該方法中，檢測對象樣品中的GPR110蛋白或其RNA轉(zhuǎn)錄物，觀察到的GPR110或轉(zhuǎn)錄水平被用于確定個體是否有與前列腺癌或肺癌相關(guān)的GPR110水平的升高。依照本發(fā)明，有此種水平升高的病人可以用各種GPR110相關(guān)的免疫治療劑治療。
文檔編號G01N33/53GK101918836SQ200880023852
公開日2010年12月15日 申請日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月8日
發(fā)明者B·王, M·瓦布 申請人:皮可貝拉有限責(zé)任公司