專(zhuān)利名稱(chēng)：Pkib和naaladl2用作前列腺癌治療和診斷的靶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及癌癥診斷和治療領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明 涉及用于檢測(cè)和診斷前列腺癌的方法，以及用于治療和預(yù)防前列腺癌的方法。而且，本發(fā)明 涉及用于篩選可用于預(yù)防前列腺癌的藥劑的方法。
背景技術(shù)：
前列腺癌(PC)是美國(guó)和歐洲最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤，并且是第二大癌癥相關(guān)死 亡的原因(Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64.)。由于西式飲食的流行和老齡人口 的爆發(fā)性增長(zhǎng)，PC的發(fā)病率在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家顯著增加(Gronberg H，Lancet 2003 361 859-64. and Hsing AW et al.，Epidemiol Rev2001 23 :3_13.)。使用血清前列腺特異抗原 (PSA)進(jìn)行篩選導(dǎo)致PC的早期檢出大大改善，增加了可通過(guò)外科手術(shù)和放射治療治愈的局 部化疾病的患者的比例(Gronberg H, Lancet 2003 36 1 :859_64. and Hsing AW et al.， EpidemiolRev 2001 23:3-13.)。然而，有20-30%的這類(lèi)PC患者仍然受到疾病復(fù)發(fā)的困 擾(Feldman BJ et al. , Nat Rev Cancer 2001 1 :34-45. and Han M et al. , J Urol2001 166 :416-9.)。雄激素/雄激素受體(AR)信號(hào)途徑在PC發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮核心作用，在相對(duì) 早期階段，PC的生長(zhǎng)通常是雄激素依賴(lài)的(Feldman BJ et al.，Nat RevCancer 20011 34-45. and Han M et al.，J Urol 2001 166:416-9.)。因此，大多數(shù)具有復(fù)發(fā)或晚期疾病 的患者對(duì)雄激素消減療法(androgen-ablation therapy)響應(yīng)良好，該療法通過(guò)手術(shù)或醫(yī) 藥去勢(shì)抑制睪丸雄激素的產(chǎn)生。雖然如此，但是這些患者最終會(huì)獲得不依賴(lài)雄激素的和侵 襲性更高的表型，稱(chēng)作激素難治性前列腺癌(HRPC)?？蛇x擇地，他們最終會(huì)獲得對(duì)雄激素 消減療法(去勢(shì))的耐受性，以及侵襲性更高的表型，稱(chēng)作去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)， 這基本上是致死的疾病(Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 200623:8253-61.)。最 近，多烯紫杉醇(docetaxel)和強(qiáng)的松(prednisone)的組合被確立為HRPC患者的新護(hù)理 標(biāo)準(zhǔn)(Tannock IF et al.，N Engl J Med 2004351 :1502-12.)，但是它們不能實(shí)現(xiàn)治愈， 對(duì)HRPC患者的生存益處非常有限。因此，現(xiàn)在許多研究團(tuán)隊(duì)正在嘗試各種方法，鑒定對(duì) HRPC生長(zhǎng)起貢獻(xiàn)的新型分子靶標(biāo)或信號(hào)途徑(Scher HI et al.，J Clin Oncol 2005 23 8253-61.)。這種去勢(shì)抵抗性進(jìn)程的機(jī)制被假定為可分成兩個(gè)途徑，即涉及AR的途徑；和旁 路AR或不依賴(lài)AR的途徑。它們并不相互排斥，而往往在CRPC細(xì)胞中共存(Feldman BJ, Feldman D. Nat Rev Cancer 20011 :34—45，Scher HI,Sawyers CL. J Clin Oncol 200623 8253-61.)。有報(bào)道，許多旁路AR或不依賴(lài)AR的途徑在CRPC細(xì)胞中被激活，有助于獲得惡 性或侵襲性更高的表型。AR途徑與AR非依賴(lài)途徑一例如Her-2/neu和IL-6/STAT3—之 間還會(huì)發(fā)生對(duì)話(huà)(Cross-talk) (Feldman BJ, Feldman D.Nat Rev Cancer 20011 34-45, Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 200623 :8253_61，Grossmann ME, et al. JNCI 200193 1687-97, Yang L, et al. BBRC 2003305 462-469.)。在獨(dú)立途徑中，PTEN-PI3K-Akt途徑可能是可以解釋CRPC表型的最關(guān)鍵的途徑 之一。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其被磷脂肌醇(3，4，5)-磷酸(PIP3)激活，而激 活的或磷酸化的Akt可通過(guò)調(diào)節(jié)GSK3beta、BAD、F0X0和mTOR來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞存 活(Sharma M, et al. J Biol Chem 2002277:30935-41，Pap M, Cooper GM. J Biol Chem 1998273 19929-32, Downward J.1998Curr Opin Cell Biol 10 :262-67, Datta SR, et al. Cell 199791 :231-41, Downward J. Cell Develop Biol 2004 15 177-82, Vivanco I and Sawyers C. NatRev Cancer 20022 :289_501，Hay N. Cancer Cell 20058:179-83)。在正常細(xì)胞中，腫瘤阻遏物PTEN- —種可從PIP3除去磷酸的脂質(zhì)磷酸酶(lipid phosphatase)—可抑制Akt激活，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，而一些腫瘤細(xì)胞具有PTEN突變或PTEN 表達(dá)缺失，導(dǎo)致Akt激活。除了其抗細(xì)胞凋亡功能之外，在前列腺癌細(xì)胞中，激活的Akt直 接與AR結(jié)合，并且在沒(méi)有雄激素的條件下使AR磷酸化，這也有助于CRPC表型(Wen Y，et al. CancerRes 200060 :6841_45)。實(shí)際上，在高格里森等級(jí)的PC中磷酸化AkT的水平上升，并且與PC進(jìn)展或CRPC進(jìn) 展相關(guān)(Malik SN，et al. Clin Cancer Res 20028 :1168-71,Kreisberg JI，et al. Cancer Res 200464 :5232_36)。Akt的激活需要Thr308和Ser473殘基的磷酸化。磷酸肌醇依賴(lài)的激酶1 (PDK1) 能夠催化Thr308的磷酸化，并且有人提出若干激酶可發(fā)揮所謂PDK2的功能，可催化Ser473 的磷酸化，但是它們中是否有一些或全部在癌細(xì)胞中發(fā)揮生理性PDK2的作用仍然有待確 認(rèn)(Grossmann ME, et al. JNCI200193 :1687_97，Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 200484 137-67.)。另一方面，cAMP依賴(lài)的蛋白激酶A(PKA)經(jīng)常被認(rèn)為對(duì)于介導(dǎo)由cAMP引發(fā)的多 種生理或病理效應(yīng)以及與G蛋白的偶聯(lián)是至關(guān)重要的。多種配體-受體系統(tǒng)可激活PKA 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并且其激活與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的控制有關(guān)(Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 200484 137-67, Stork PJ，Schmitt JM. Trends Cell Biol 200212:258-66)。在前列腺癌中，有多項(xiàng)報(bào)告稱(chēng)，PKA參與了雄激素非依賴(lài)性生長(zhǎng)和神經(jīng)內(nèi)分泌分 化(Cox ME,et al.J Biol Chem 2000275 :13812_8，Deeble PD, CoxME,et al. Cancer Res 200767 663-72)。還有人提出PKA途徑與AR途徑的對(duì)話(huà)參與了 PC細(xì)胞的雄激素非依賴(lài)性 或去勢(shì)抵抗性生長(zhǎng)(Stork PJ，SchmittJM. Trends Cell Biol 200212 :258_66，Sadar MD. J Biol Chem 1999274 :7777_83)。該P(yáng)KA途徑受到多種因子的調(diào)節(jié)，例如PKA調(diào)節(jié)亞基(PKA-R)或PKA抑制 ^ (Taylor SS, Kim C, Vigil D, et al. BBA 20051754 :25-37, Dalton GD, Dewey WL. Neuropeptides 200640 :23_34)，在癌細(xì)胞中，這些調(diào)節(jié)因子被異常表達(dá)從而改變PKA 途徑，并且其中一些是癌癥治療的靶標(biāo)(Miller WR. Ann NY Acad Sci 2002968:37-48， 2002)。
先前，為了表征臨床HRPC或CRPC的分子特征和鑒定用于HRPC或CRPC治療的分 子靶標(biāo)，對(duì)通過(guò)LMM(激光微束顯微解剖)方法從HRPC或CRPC組織純化的癌細(xì)胞進(jìn)行了全 基因組范圍的cDNA微陣列分析，并且在HRPC或CRPC細(xì)胞中鑒定了若干不受調(diào)節(jié)的基因， 其中一些可能涉及雄激素非依賴(lài)性和侵襲性表型(Tamura K et al. ,Cancer Res 2007 67 5117-25.)。
發(fā)明概要根據(jù)HRPC或CRPC細(xì)胞的全基因組范圍表達(dá)譜，有兩個(gè)分子靶標(biāo)PKIB(GenBank 登錄號(hào)匪181795)和NAALADL2 (GenBank登錄號(hào)匪207015andAK021754)，被鑒定為可用 于PC治療和診斷。此外，該蛋白可用作分子靶標(biāo)，用于開(kāi)發(fā)新的HRPC治療方法。PKIB是PKA途徑中的調(diào)節(jié)因子之一，是CRPC中的一種過(guò)表達(dá)基因。本發(fā)明人證 明，它藉由PKA途徑與Akt途徑之間的功能聯(lián)系對(duì)PC細(xì)胞的生存力及其惡性表型起貢獻(xiàn)。PKIB屬于PKI (蛋白激酶A抑制物)家族。PKIA被認(rèn)為通過(guò)直接與PKA-C結(jié)合來(lái) 抑制蛋白激酶A催化亞基(PKA-C) (GenBank登錄號(hào)匪002730)的激酶活性，并將PKA-C 從細(xì)胞核外排到細(xì)胞質(zhì)(Glass DB etal.，J Biol Chem 1986261 12166-71. and Wen ff et al.，J Biol Chem 1994269:32214-20.)。蛋白激酶 A (PKA)，cAMP 依賴(lài)的蛋白激酶 A, 經(jīng)常被認(rèn)為對(duì)于介導(dǎo)由cAMP引發(fā)的多種生理或病理效應(yīng)以及與G蛋白的偶聯(lián)是至關(guān)重要 的，多種配體和受體系統(tǒng)可激活PKA信號(hào)途徑，并且PKA激活與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的控制有關(guān) (Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 200484 137-67, Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 200212:258-66)。在前列腺癌中，有多項(xiàng)報(bào)告提示，它參與了雄激素非依賴(lài)性生 長(zhǎng)和神經(jīng)內(nèi)分泌分化(Cox ME，et al. J Biol Chem 2000275 :13812_8，Deeble PD，Cox ME, et al. Cancer Res 200767 663-72)，PKA途徑與AR途徑的對(duì)話(huà)也被提示參與了 PC細(xì)胞 的雄激素非依賴(lài)性或去勢(shì)抵抗性生長(zhǎng)(Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 200212 258-66，Sadar MD. J Biol Chem 1999274 :7777_83)。NAALADL2是一種新的II型膜蛋白，屬于谷氨酸羧肽酶II (GCPII)家族。GCPII的 前列腺形式稱(chēng)作前列腺特異膜抗原(PSMA)，在前列腺癌中表達(dá)，并且PSMA水平增加與PC進(jìn) 展和HRPC有關(guān)(Rajasekaran AK et al.，AmJ Physiol Cell Physiol 2005 288 :C975_81. and Murphy GP et al.，Prostate 200042:145-9.)。考慮到它與 PSMA 的同源性和相似的 表達(dá)模式，NAALADL2應(yīng)當(dāng)被稱(chēng)作“PSMA2”。PSMA是FDA批準(zhǔn)的前列腺癌顯像劑一lllln標(biāo) 記7E11單克隆抗體(Prostascint, Cytogen, Princeton, NJ)的靶標(biāo)。PSMA是單克隆抗體 如J591的靶標(biāo)，J591正在臨床試驗(yàn)中用于將顯像劑或治療劑特異性投遞到PSMA表達(dá)細(xì)
(Murphy GP et al. ， Prostate 200042 145-9. andHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 200110:511-9.)。除了其作為腫瘤標(biāo)志的特征之外，PSMA具有GPC活性，其底物 包括多聚-Y-谷氨酸化葉酸鹽(poly-y-glutamated folates) (Zhou J et al. , Nature Review Drug Disc 20054:1015-26.)。PSMA的酶活性可被利用來(lái)設(shè)計(jì)前體藥物，其中僅在 表達(dá)PSMA的細(xì)胞中藥物的無(wú)活性谷氨酸化形式被選擇性切裂并從而被激活(DermyWA et al.，Eur J Med Chem 200136 :577_95.)。然而，人們對(duì)于PSMA如何與前列腺癌進(jìn)程相關(guān)聯(lián) 一無(wú)所知，靶定PSMA功能或其活性自身的可能性仍然不知曉。本發(fā)明突出提供一種通過(guò)確定來(lái)源于受試者的生物樣品中PIKB和NAALADL的表
7達(dá)水平來(lái)診斷或確定受試者的前列腺癌或前列腺癌傾向的方法。任何上述基因的表達(dá)水平 與該基因的正常對(duì)照水平相比的增加表明受試者罹患前列腺癌或者具有前列腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)。本發(fā)明至少部分地基于如下的發(fā)現(xiàn)，即包含特定序列(尤其是SEQ IDN0 16,17 和19)的雙鏈分子可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。具體地，本發(fā)明提供了以PIKB和 NAALADL2基因?yàn)榘袠?biāo)的小干擾RNA(siRNA)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，雙鏈分子可以被編碼在載體中，并從所述載體表達(dá)。因此，本發(fā)明提供了通過(guò)施用本發(fā)明的雙鏈分子或載體來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和治療前 列腺癌的方法。這種方法包括向受試者施用包含一種或多種所述雙鏈分子或載體的組合 物。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于治療癌癥的組合物，其含有至少一種本發(fā)明的雙鏈 分子或載體。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方 法，其包括如下步驟使測(cè)試化合物與表達(dá)PIKB或NAALADL2蛋白的細(xì)胞接觸，然后選擇可 降低PIKB或NAALADL2蛋白的表達(dá)水平的測(cè)試化合物。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種篩選用 于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，其中檢測(cè)PIKB和蛋白激酶A催化亞基(PKA-C)之 間的結(jié)合。我們預(yù)期，可抑制PIKB與PKA-C之間結(jié)合的化合物可以減輕前列腺癌的癥狀。 而且，本發(fā)明提供了篩選用于檢測(cè)癌癥的抗體的方法，其中檢測(cè)細(xì)胞表面中的NAALANDL2。 將識(shí)別NAALANDL2的抗體用于檢測(cè)前列腺癌。附圖簡(jiǎn)述

圖1A半定量RT-PCR確認(rèn)，與同樣經(jīng)顯微解剖的正常前列腺上皮細(xì)胞(NPmix)、 完整的正常前列腺組織和生命器官(心、肺、肝和腎)相比，PKIB在HRPC細(xì)胞(5/5)中過(guò) 表達(dá)，但在HSPC細(xì)胞中則不然。cDNA含量的定量都使用ACTB。B針對(duì)PKIB表達(dá)的多組 織Northern(MTN)印跡分析顯示，在成人器官中，胎盤(pán)顯示大約1. 5kb條帶，而在生命器官 (心、肺、肝和腎)則沒(méi)有。PKIB表達(dá)的Northern印跡分析顯示，數(shù)個(gè)PC細(xì)胞系(22Rvl和 PC-3)強(qiáng)烈表達(dá)PKIB，而其它正常成人器官?zèng)]有表達(dá)PKIB。C-F顯示了 PC組織的免疫組化 分析。C前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)顯示微弱的PKIB染色(+)。DGleason 3級(jí)的PC顯示微弱 的染色(+)，而正常前列腺上皮(N)顯示陰性染色。E Gleason 5級(jí)的PC顯示強(qiáng)烈的PKIB 陽(yáng)性染色(+++)。F HRPC也顯示強(qiáng)烈的PKIB陽(yáng)性染色(+++)。圖2A半定量RT-PCR確認(rèn)，與同樣顯微解剖的正常前列腺上皮細(xì)胞(NPmix)、完整 的正常前列腺組織和生命器官(心、肺、肝和腎)相比，NAALADL2在HRPC細(xì)胞(7/11)中過(guò) 表達(dá)。cDNA含量的定量都使用ACTB。B NAALADL2表達(dá)的MTN印跡分析顯示，在成人器官 中，僅在PC細(xì)胞系中存在大約10kb、6kb和5kb的三個(gè)條帶，而在生命器官(心、肺、肝和 腎)則沒(méi)有。圖3PKIB_siRNA對(duì)PC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。A RT-PCR確認(rèn)在22Rvl細(xì)胞(左)和 LNCaP (HP)細(xì)胞(右)中，sil和si2對(duì)PKIB表達(dá)具有敲低作用(knockdown effect)，但 si3和陰性對(duì)照siEGFP都沒(méi)有。B用表達(dá)針對(duì)PKIB的指定siRNA(siUsi2和si3)的載體 和陰性對(duì)照載體(siEGFP)轉(zhuǎn)染的22Rvl細(xì)胞(左)和LNCaP (HP)細(xì)胞(右)的各自的MTT 測(cè)定。與遺傳霉素(Geneticin)溫育20天后，對(duì)每次的平均值作圖，誤差線(xiàn)指示SD (標(biāo)準(zhǔn)偏 差)。Y軸上的ABS表示490nm吸光度，以630nm為參比，用微滴定板讀數(shù)器測(cè)量。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。用sil和si2轉(zhuǎn)染22Rvl (左)和LNCaP(HP)細(xì)胞(右)導(dǎo)致存活細(xì)胞數(shù)目大 大減少，而與此相比的是用si3和siEGFP轉(zhuǎn)染沒(méi)有觀(guān)察到敲低作用(P < 0. 01, Student t 檢驗(yàn))。C用針對(duì)PKIB的指定siRNA表達(dá)載體(sil,si2和si3)和陰性對(duì)照載體(siEGFP) 轉(zhuǎn)染的22Rvl細(xì)胞(左)和LNCaP(HP)細(xì)胞(右)的集落形成測(cè)定。用遺傳霉素溫育20 天后，用結(jié)晶紫染色(crystalviolet staining)使細(xì)胞可視化。圖4NAALADL2-siRNA對(duì)PC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。A RT-PCR確認(rèn)，在22Rvl細(xì)胞中， si#690對(duì)NAALADL2表達(dá)有敲低作用，但si#913, si#1328和陰性對(duì)照siEGFP沒(méi)有。利用 ACTB 定量 RNA。B 用針對(duì) NAALADL2 的指定 siRNA 表達(dá)載體(si#690，si#913 和 si#1328)和 陰性對(duì)照載體(siEGFP)轉(zhuǎn)染的22Rvl細(xì)胞的MTT測(cè)定。與遺傳霉素溫育20天后，對(duì)每次 的平均值作圖，誤差線(xiàn)指示SD (標(biāo)準(zhǔn)偏差)。Y軸上的ABS表示490nm吸光度，以630nm為 參考，用微滴定板讀數(shù)器測(cè)量。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。用si#690轉(zhuǎn)染22Rvl細(xì)胞導(dǎo)致存活細(xì) 胞數(shù)目大大減少，而相比之下其它siRNA處理沒(méi)有觀(guān)察到敲低作用(P < 0. 01，Student t 檢驗(yàn))。C用針對(duì)NAALADL2的指定siRNA表達(dá)載體(si#690, si#913和si#1328)和陰性對(duì) 照載體(siEGFP)轉(zhuǎn)染的22Rvl細(xì)胞的集落形成測(cè)定。與遺傳霉素溫育20天后，用結(jié)晶 紫染色(crystal violet staining)細(xì)胞使之可視化。D RT-PCR確認(rèn)在另一種NAALADL2 表達(dá)型的C4-2B細(xì)胞中，對(duì)應(yīng)于si#690的合成RNA雙鏈體(duplex)對(duì)NAALADL2表達(dá)有敲 低作用，但si#913, si#1328和陰性對(duì)照siEGFP則沒(méi)有。利用ACTB定量RNA。E與對(duì)照RNA 雙鏈體siEGFP相比，對(duì)應(yīng)于si#690的合成RNA雙鏈體抑制了 C4-2B細(xì)胞的細(xì)胞生存力(P < 0. 01, Student t 檢驗(yàn))。圖5PKIB蛋白(A)和NAALADL2蛋白(B)的亞細(xì)胞定位。使用抗標(biāo)簽抗體進(jìn)行免 疫細(xì)胞組化分析顯示，外源PKIB定位于細(xì)胞質(zhì)，外源NAALADL2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜。 C PKIB-Myc和HA-PKA-C表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染22Rvl細(xì)胞，用每種標(biāo)簽抗體免疫沉淀它們的細(xì)胞 裂解物。PKIB-Myc與PKA-C免疫共沉淀，反之亦然，表明PKIB與PKA-C間的直接相互作用。 D免疫細(xì)胞組化分析觀(guān)察到，當(dāng)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞時(shí)，大多數(shù)PKA-C定位于細(xì)胞質(zhì)， 一些PKA-C信號(hào)位于細(xì)胞核(左)。另一方面，當(dāng)siRNA敲低PC-3細(xì)胞中的內(nèi)源PKIB時(shí)， 免疫細(xì)胞組化分析顯示在細(xì)胞核中沒(méi)有或者有非常少的PKA-C信號(hào)(右)。E在PC細(xì)胞中 用siRNA雙鏈體處理后，將細(xì)胞分級(jí)為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，以便更加定量地分析細(xì)胞核 PKA-C。使用30微克經(jīng)分級(jí)的細(xì)胞裂解物，用抗PKA-C抗體和作為上樣和細(xì)胞核級(jí)分對(duì)照 的抗核纖層蛋白B抗體進(jìn)行western印跡。與對(duì)照siRNA相比，由siRNA導(dǎo)致的PKIB敲低 可明顯降低細(xì)胞核中的PKA-C量，而細(xì)胞質(zhì)中的PKA-C量在PKIB敲低中僅略微增加。圖 6A RT-PCR 確認(rèn)了 PKIB 在 DU145 來(lái)源(deribed)的克隆(PKIB#1、#2、#3)中 的組成性表達(dá)。B Western印跡確認(rèn)了 PKIB在DU145來(lái)源(deribed)的克隆(PKIB#1、#2、 #3)中的組成性表達(dá)。C表達(dá)高水平的外源PKIB的DU145克隆(克隆1_3)和用模擬(Mock) 載體轉(zhuǎn)染的克隆(#1、#2、#3混合物)的體內(nèi)生長(zhǎng)速度。X和Y軸分別表示接種后的日數(shù)點(diǎn) 和用直徑吸光度(absorbance of the diameter)計(jì)算的、與作為對(duì)照的第1天的吸光度值 比較的相對(duì)生長(zhǎng)速度。PKIB過(guò)表達(dá)細(xì)胞比模擬細(xì)胞生長(zhǎng)更快速，提示PKIB在前列腺癌中的 促生長(zhǎng)作用。D將2X106個(gè)穩(wěn)定表達(dá)PKIB的DU145來(lái)源的克隆(右)或者模擬細(xì)胞(左) 接種在雄性裸鼠的脅部(frank)。接種15周后，僅在右脅部建立了腫瘤(PKIB++ ；箭頭)， 而在左脅部(模擬)沒(méi)有。E基質(zhì)膠侵襲測(cè)定(Matrigel invasion assay)顯示了 NIH3T3細(xì)胞在被PKIB表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的侵襲性質(zhì)。Y軸表示遷移通過(guò)基質(zhì)膠包被膜的細(xì)胞數(shù)目。 試驗(yàn)重復(fù)三次，對(duì)每次的平均值作圖，誤差線(xiàn)表示SD (標(biāo)準(zhǔn)偏差)。PKIB的過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn) 7 NIH3T3細(xì)胞的侵襲性(P = 0. 0052)。圖7A在LNCaP和PC-3細(xì)胞中用siRNA雙鏈體(siPKIB)敲低PKIB導(dǎo)致Akt的Ser 473磷酸化減弱。用siEGFP雙鏈體轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照。用RT-PCR確認(rèn)PKIB的敲低，使用 ACTB作為上樣對(duì)照。B PKIB在PC-3和22Rvl細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)提高了 Akt的Ser 473磷酸 化。PKIB過(guò)表達(dá)通過(guò)使用HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行western印跡加以確認(rèn)。C PKA-C在PC-3細(xì)胞 中的過(guò)表達(dá)也提高了 Akt的Ser 473磷酸化。PKA-C的過(guò)表達(dá)通過(guò)使用HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行 western印跡加以確認(rèn)，以Akt總量作為上樣對(duì)照。D使用重組PKIB和PKA-C蛋白進(jìn)行Akt 的體外激酶測(cè)定。Akt-Ser473的磷酸化通過(guò)抗磷酸-Akt (Ser473)抗體(Cell Signaling) 進(jìn)行檢測(cè)，Akt總量作為上樣對(duì)照。用抗Akt抗體檢測(cè)Akt總量。在PKA-C的基礎(chǔ)上添加 PKIB在體外顯著增加了 Akt-Ser473的磷酸化。圖8在臨床PC組織中，PKIB表達(dá)與Akt磷酸化關(guān)聯(lián)。圖片代表了在PC組織的面 對(duì)面切片(face-to-face slides)上進(jìn)行的A PKIB和B磷酸化Akt的免疫組織化學(xué)。發(fā)明的公開(kāi)定義除非具體指出，否則詞語(yǔ)“一”、“一個(gè)(一種)”和“該”在本文中的意思是“至少 一個(gè)，，。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“生物樣品”是指整個(gè)生物體或由其組織、細(xì)胞或組成部分 (例如體液，包括但不僅限于，血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、陰 道分泌物和精液)構(gòu)成的子集?！吧飿悠贰边€指從整個(gè)生物體，或從由其細(xì)胞、組織或組 成部分、或級(jí)分或部分構(gòu)成的子集，所制備的勻漿、裂解物、提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng) 物。最后，“生物樣品”指這樣的介質(zhì)，例如其中已有生物體繁殖的營(yíng)養(yǎng)液或凝膠其含有細(xì) 胞成分，例如蛋白質(zhì)或多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中若無(wú)具體指出可交換使用，并且用它們 公認(rèn)的單字母編碼指示。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)適用于這樣的核酸(核苷酸)聚合物，其中有一個(gè)或 多個(gè)核酸通過(guò)酯鍵連接。多核苷酸或寡核苷酸可以由DNA、RNA或其組合構(gòu)成。雙鏈分子術(shù)語(yǔ)“分離的雙鏈分子”是指可抑制靶基因的表達(dá)的核酸分子，包括例如短干擾 RNA(siRNA ；例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA(shRNA))和短干擾DNA/RNA(siD/ R-NA ；例如DNA和RNA的雙鏈嵌合體(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發(fā)夾嵌合體(shD/ R-NA))。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“siRNA”是指可阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將 siRNA引入到細(xì)胞中的常規(guī)技術(shù)，包括以DNA為RNA轉(zhuǎn)錄模板的技術(shù)。siRNA包括PKIB或 NAALADL2有義核酸序列(也稱(chēng)作“有義鏈”)、PKIB或NAALADL2反義核酸序列(也稱(chēng)作“反 義鏈”)、或兩者。siRNA可以被構(gòu)建成使單個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)具有靶基因的有義核酸序列和互 補(bǔ)的反義核酸序列，例如發(fā)夾。siRNA可以是dsRNA或shRNA。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“dsRNA”是指兩個(gè)RNA分子的構(gòu)建體，兩個(gè)RNA分子包含彼 此互補(bǔ)的序列，并通過(guò)互補(bǔ)序列退火在一起形成雙鏈RNA分子。兩條鏈的核苷酸序列可能不僅包括從靶基因序列蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義” RNA,還包括具有從靶基因非 編碼區(qū)選出的核苷酸序列的RNA分子。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“shRNA”是指具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA，包括彼此互補(bǔ)的第一 和第二區(qū)，即有義和反義鏈。所述區(qū)域的互補(bǔ)程度和方向足以使得兩個(gè)區(qū)域間形成堿基配 對(duì)，其中第一和第二區(qū)通過(guò)環(huán)區(qū)連接，該環(huán)是由于環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸(或核苷酸模擬物)之間缺 乏堿基配對(duì)產(chǎn)生的。shRNA的環(huán)區(qū)是介于有義和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱(chēng)作“間插單 鏈”。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“siD/R-NA”是指同時(shí)包含RNA和DNA的雙鏈多核苷酸分子， 包括RNA和DNA的雜交體和嵌合體，其可阻止靶mRNA的翻譯。這里，雜交體指示這樣的分 子，其中一個(gè)由DNA構(gòu)成的多核苷酸與一個(gè)由RNA構(gòu)成的多核苷酸彼此雜交形成雙鏈分子； 而嵌合體是指構(gòu)成雙鏈分子的一條鏈含有或兩條鏈都含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA引 入細(xì)胞內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。siD/R-NA包括PKIB或NAALADL2有義核酸序列(也稱(chēng)作“有義鏈”)、 PKIB或NAALADL2反義核酸序列(也稱(chēng)作“反義鏈”)或兩者。siD R-NA可以被構(gòu)建成使單 個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)具有靶基因的有義和互補(bǔ)核酸序列，例如發(fā)夾。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或 shD/R-NA。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“dsD/R-NA”是指由兩個(gè)包含彼此互補(bǔ)的序列的分子所成的 構(gòu)建體，兩個(gè)分子通過(guò)互補(bǔ)序列退火在一起從而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸 序列不僅包括從靶基因序列蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義”多核苷酸，還包括具有 從靶基因非編碼區(qū)選出的核苷酸序列的多核苷酸。構(gòu)成dsD/R-NA的兩個(gè)分子中的一個(gè)或 兩個(gè)都由RNA和DNA 二者構(gòu)成(嵌合分子)，或者，其中一個(gè)分子由RNA構(gòu)成，另一個(gè)由DNA 構(gòu)成(雜交雙鏈)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“dsD/R-NA”是指具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的siD/R-NA，包括彼此互補(bǔ) 的第一和第二區(qū)，即有義和反義鏈。所述區(qū)域的互補(bǔ)程度和方向足以使得兩個(gè)區(qū)域間形成 堿基配對(duì)，第一和第二區(qū)通過(guò)環(huán)區(qū)連接，環(huán)是由于環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸(或核苷酸模擬物)之間缺 乏堿基配對(duì)而形成的。siD/R-NA的環(huán)區(qū)是介于有義和反義鏈之間的單鏈區(qū)，可以稱(chēng)作“間 插單鏈”。如本文所使用的，“分離核酸”是指從其原始環(huán)境(例如其自然存在的天然環(huán)境) 被取出，因此從其自然狀態(tài)發(fā)生了人工改變(synthetically altered)的核酸。在本發(fā)明 中，分離核酸包括DNA、RNA和其衍生物。針對(duì)PKIB或NAALADL2的雙鏈分子，是與靶mRNA雜交的分子，可通過(guò)與基因的在 正常情況下為單鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合(associate)，干擾蛋白翻譯進(jìn)而抑制蛋白的表達(dá)， 從而降低或抑制由PKIB或NAALADL2基因編碼的PKIB或NAALADL2蛋白的產(chǎn)生。PKIB在前 列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)被1或2不同的dsRNA抑制(圖3) ；NAALADL2在前列腺癌細(xì)胞系中 的表達(dá)被dsRNA抑制(圖4)。因此，本發(fā)明提供了具有下述性質(zhì)的分離的雙鏈分子它們?cè)诒灰氲奖磉_(dá)PKIB 或NAALADL2基因的細(xì)胞內(nèi)時(shí)可抑制該基因的表達(dá)。雙鏈分子的靶序列通過(guò)下文提到的 siRNA設(shè)計(jì)算法加以設(shè)計(jì)。PKIB靶序列包括，例如，核苷酸SEQ ID NO 16,
SEQ ID NO 17NAALADL2靶序列包括，例如，核苷酸SEQ ID NO 19具體地，本發(fā)明提供了如下的雙鏈分子[1]_[16][1] 一種分離的雙鏈分子，其在被引入到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可抑制PKIB或NAALADL2基因 的表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)，該分子包括有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分 子，并且其中有義鏈包括從SEQ ID NO :16、17和19的組中選出的靶序列；[2] [1]所述的雙鏈分子，其長(zhǎng)度小于大約100個(gè)核苷酸；[3] [2]所述的雙鏈分子，其長(zhǎng)度小于大約75個(gè)核苷酸；[4] [3]所述的雙鏈分子，其長(zhǎng)度小于大約50個(gè)核苷酸；[5] [4]所述的雙鏈分子，其長(zhǎng)度小于大約25個(gè)核苷酸；[6] [5]所述的雙鏈分子，其長(zhǎng)度為大約19-大約25個(gè)核苷酸；[7] [1]所述的雙鏈分子，其由單個(gè)多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò)間插單 鏈連接起來(lái)的有義鏈和反義鏈；[8] [7]所述的雙鏈分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]_3’，其中[A]是包含選自 SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3-23個(gè)核苷酸組成的間插單鏈，[A，]是 包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈；[9] [1]所述的雙鏈分子，其包含RNA ；[10] [1]所述的雙鏈分子，其包含DNA和RNA ；[11] [10]所述的雙鏈分子，其是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜交體；[12] [11]所述的雙鏈分子，其中有義鏈和反義鏈分別由DNA和RNA構(gòu)成；[13] [10]所述的雙鏈分子，其是DNA和RNA的嵌合體；[14] [13]所述的雙鏈分子，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA構(gòu)成，或者有義鏈 5’端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA構(gòu)成；[15] [14]所述的雙鏈分子，其中側(cè)翼區(qū)域由9-13個(gè)核苷酸組成；和[16] [1]所述的雙鏈分子，其包含3’突出端。
下面將更詳細(xì)地介紹本發(fā)明的雙鏈分子。具有抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)的能力的雙鏈分子的設(shè)計(jì)方法是已知的。(見(jiàn)例如，美 國(guó)專(zhuān)利No. 6，506，559，本文援引并入其全部?jī)?nèi)容)。例如，可以從Ambion網(wǎng)站訪(fǎng)問(wèn)一種用于 設(shè)計(jì) siRNA 的計(jì)算機(jī)程序(http //www, ambion. com/techlib/misc/siRNA finder, html)。該計(jì)算機(jī)程序根據(jù)如下方案選擇雙鏈分子的靶核苷酸序列。靶位點(diǎn)的選擇1.從轉(zhuǎn)錄本的AUG起始密碼子開(kāi)始，向下游搜尋AA 二核苷酸序列。記錄每個(gè)AA 的出現(xiàn)以及3’毗鄰的19個(gè)核苷酸，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。Tuschl等推薦避免在5’和 3’非翻譯區(qū)(UTR)以及臨近起始密碼子的區(qū)域(75個(gè)堿基內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)檫@些區(qū)域 可能更富含調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，并且UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合體可能干擾siRNA 內(nèi)切酶復(fù)合體的結(jié)合。2.比較潛在靶位點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人、小鼠、大鼠等)，將任何與其它 編碼序列具有顯著同源性的靶序列排除在考慮之外?；旧鲜褂肂LAST，其可通過(guò)NCBI服各器訪(fǎng)問(wèn)www. ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997S印 1,25(17) 3389-402)3.選擇合格的靶序列用于合成。典型地，沿著基因的長(zhǎng)度選擇數(shù)個(gè)靶序列進(jìn)行評(píng) 估。通過(guò)這個(gè)方案，本發(fā)明分離雙鏈分子的靶序列設(shè)計(jì)如下SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO 17 用于 PKIB 基因；核苷酸SEQ ID NO 19 用于 NAALADL2 基因；核苷酸對(duì)于靶定上述靶序列的雙鏈分子，分別檢查它們抑制表達(dá)所述靶基因的細(xì)胞的生 長(zhǎng)的能力。因此，本發(fā)明提供了以選自下組的任何序列為靶標(biāo)的雙鏈分子SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO 17 用于 PKIB 基因；核苷酸SEQ ID NO 19 用于 NAALADL2 基因；核苷酸本發(fā)明的雙鏈分子針對(duì)單個(gè)靶標(biāo)PKIB或NAALADL2基因序列，或者可以針對(duì)多個(gè) PKIB或NAALADL2基因序列。所謂PKIB或NAALADL2靶序列，意思是與PKIB基因或NAALADL2基因的一部分 (即PKIB或NAALADL2基因內(nèi)的多核苷酸，其與siRNA長(zhǎng)度相等并且與之互補(bǔ))相同的 核苷酸序列。靶序列可包括人PKIB或NAALADL2基因的5’非翻譯(UT)區(qū)、開(kāi)放閱讀框 (0RF)或3’非翻譯(UT)區(qū)?；蛘撸瑂iRNA是與PKIB或NAALADL2基因表達(dá)的上游或下游調(diào) 節(jié)子(modulator)互補(bǔ)的核酸序列。上游和下游調(diào)節(jié)子的實(shí)例包括與PKIB或NAALADL2 基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，與PKIB或NAALADL2多肽相互作用的激酶或磷酸酶，PKIB或 NAALADL2啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。以上述的PKIB或NAALADL2基因靶序列為靶標(biāo)的本發(fā)明雙鏈分子包括這樣的分離 的核苷酸，它們包括靶序列的任何核酸序列和/或與靶序列互補(bǔ)的序列。靶定PKIB基因的 多核苷酸的實(shí)例包括含有SEQ ID NO 16或17的序列和/或這些核苷酸的互補(bǔ)序列的多 核苷酸；靶定NAALADL2基因的多核苷酸包括含有SEQ ID NO 19的序列和/或這些核苷酸 的互補(bǔ)序列的多核苷酸。然而，本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)例，前述核酸序列的微小修飾也是 可以接受的，只要經(jīng)過(guò)修飾的分子仍保持抑制PKIB或NAALADL2基因表達(dá)的能力即可。這 里，核酸序列中的“微小修飾”是指對(duì)序列進(jìn)行1、2或數(shù)個(gè)核酸的替換、刪除、添加或插入。 典型地，微小修飾是對(duì)序列進(jìn)行4個(gè)或者更少，有時(shí)是3個(gè)或者更少，經(jīng)常是2個(gè)或者更少 核酸的替換、刪除、添加或插入。根據(jù)本發(fā)明，可以用實(shí)施例中采用的方法對(duì)本發(fā)明雙鏈分子的能力進(jìn)行測(cè)試。在 實(shí)施例中，對(duì)于包含PKIB或NAALADL2基因不同部分的有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈的雙鏈 分子，根據(jù)常規(guī)方法體外測(cè)試了它們降低前列腺癌細(xì)胞系(例如使用22Rvl、LNCaP(HP)和 C4-2B)中PKIB或NAALADL2基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的能力。而且，例如，與不存在候選分子時(shí)培養(yǎng) 的細(xì)胞相比，與候選雙鏈分子接觸的細(xì)胞中PKIB或NAALADL2基因產(chǎn)物的減少，可以通過(guò)例 如RT-PCR方法，使用實(shí)施例1，題目“半定量RT-PCR”中提到的PKIB或NAALADL2mRNA引物 進(jìn)行檢測(cè)。然后，對(duì)于可在體外細(xì)胞測(cè)定中降低PKIB或NAALADL2基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的序列， 測(cè)試它們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。然后，對(duì)于在體外細(xì)胞測(cè)定中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的序列，用患 有癌癥的動(dòng)物，例如裸鼠異種移植模型，測(cè)試它們?cè)隗w內(nèi)的能力，以確認(rèn)PKIB或NAALADL2 產(chǎn)物生成的減少和癌細(xì)胞生長(zhǎng)的降低。
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當(dāng)分離的多核苷酸是RNA或其衍生物時(shí)，核苷酸序列中的堿基“t”應(yīng)當(dāng)用“U”代 替。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指多核苷酸的核苷酸單位之間的Watson-Crick或 Hoogsteen堿基配對(duì)，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”的意思是兩個(gè)多核苷酸之間的物理或化學(xué)相互作用。當(dāng) 多核苷酸包含經(jīng)過(guò)修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯聯(lián)結(jié)時(shí)，這些多核苷酸也可以用相同的 方式彼此結(jié)合。一般地，互補(bǔ)多核苷酸序列在合適的條件下雜交，形成穩(wěn)定的、含有極少錯(cuò) 配或沒(méi)有錯(cuò)配的雙鏈體。而且，本發(fā)明的分離多核苷酸的有義鏈和反義鏈可以通過(guò)雜交形 成雙鏈分子或者發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種雙鏈體每10個(gè)配對(duì)含有不超過(guò)1個(gè) 錯(cuò)配。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈體的鏈完全互補(bǔ)，這種雙鏈體不含有錯(cuò)配。多核苷酸的長(zhǎng)度，對(duì)于PKIB小于1909個(gè)核苷酸，對(duì)于NAALADL2小于4912個(gè)核苷 酸。例如，對(duì)于所有這些基因，多核苷酸的長(zhǎng)度小于500、200、100、75、50或25個(gè)核苷酸。本 發(fā)明的分離多核苷酸可用于形成針對(duì)PKIB或NAALADL2基因的雙鏈分子，或用于制備編碼 這樣的雙鏈分子的模板DNA。當(dāng)使用所述多核苷酸形成雙鏈分子時(shí)，多核苷酸的長(zhǎng)度可以超 過(guò)19個(gè)核苷酸，優(yōu)選地超過(guò)21個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地，長(zhǎng)度為大約19-大約25個(gè)核苷酸。本發(fā)明的雙鏈分子可以含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯聯(lián) 結(jié)。本領(lǐng)域中眾所周知的化學(xué)修飾能夠提高雙鏈分子的穩(wěn)定性、利用度和/或細(xì)胞攝取。技 術(shù)人員知道可用于本發(fā)明分子的其它類(lèi)型的化學(xué)修飾(W003/070744 ；W02005/045037)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，可利用修飾來(lái)提高對(duì)降解的抵抗性或者改善攝取。這些修飾的實(shí)例包括 硫代磷酸酯聯(lián)結(jié)(phosphorothioate linkage), 2' _0_甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分 子的有義鏈上)，2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸，2’ -脫氧-核糖核苷酸，“通用堿基”核苷酸 ("universal base”nucleotide)，5，_C_甲基核苷酸，和倒置脫氧堿基殘基摻入(inverted deoxyabasic residue incorporation) (US20060122137)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾可 用于提高雙鏈分子的穩(wěn)定性或提高靶定效率。修飾包括雙鏈分子兩條互補(bǔ)鏈之間的化學(xué) 交聯(lián)，雙鏈分子一條鏈的3’或5’末端化學(xué)修飾，糖基化修飾，核苷堿基修飾和/或骨架修 飾，2-氟修飾的核糖核苷酸和2’ -脫氧核糖核苷酸(W02004/029212)。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，修飾可用于增加或降低互補(bǔ)核苷酸在靶mRNA和/或在互補(bǔ)雙鏈分子鏈內(nèi)的親和性 (W02005/044976)。例如，非修飾的嘧啶核苷酸可以被2-硫，5-炔基，5-甲基，或5-丙炔基 嘧啶代替。此外，非修飾的嘌呤可以被7-脫氮，7-烷基，或7-烯基嘌呤代替。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，當(dāng)雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子時(shí)，可以把3’末端核苷酸的懸置核苷酸 替換為脫氧核糖核苷酸(ElbashirSM et al. ,Genes Dev 2001 Jan 15，15(2) :188_200)。更 詳細(xì)的內(nèi)容可以參見(jiàn)已公開(kāi)的文獻(xiàn)，例如US20060234970。本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例， 任何已知的化學(xué)修飾均可用于本發(fā)明的雙鏈分子，只要所得的分子仍保持抑制靶基因表達(dá) 的能力即可。而且，本發(fā)明的雙鏈分子可以同時(shí)包括DNA和RNA，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體地，DNA鏈和RNA鏈的雜交多核苷酸或DNA-RNA嵌合多核苷酸顯示更高的穩(wěn)定性?？?形成DNA和RNA的混合，即由一條DNA鏈(多核苷酸)和一條RNA鏈(多核苷酸)的雜交 型雙鏈分子，在一條或兩條單鏈(多核苷酸)上同時(shí)包含DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，或 諸如此類(lèi)，以提高雙鏈分子的穩(wěn)定性。DNA鏈和RNA鏈的雜交體可以是有義鏈為DNA，反義 鏈為RNA，或者相反，只要其在引入到表達(dá)靶基因的細(xì)胞內(nèi)時(shí)具有抑制靶基因表達(dá)的能力即 可。優(yōu)選地，有義鏈多核苷酸是DNA，反義鏈多核苷酸是RNA。另外，嵌合型雙鏈分子可以是
14兩條有義和反義鏈都由DNA和RNA構(gòu)成，或者是有義鏈和反義鏈中的任何一個(gè)由DNA和RNA 構(gòu)成，只要其在引入表達(dá)該基因的細(xì)胞內(nèi)時(shí)具有抑制靶基因表達(dá)的活性即可。為了提高雙 鏈分子的穩(wěn)定性，分子優(yōu)選地含有盡可能多的DNA，而為了誘導(dǎo)靶基因表達(dá)的降低，分子需 要有一定范圍的RNA，以誘導(dǎo)充分的表達(dá)抑制。作為嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實(shí)例，雙鏈分子 的上游部分區(qū)域(即有義或反義鏈內(nèi)位于靶序列或其互補(bǔ)序列之側(cè)翼的區(qū)域)是RNA。優(yōu) 選地，上游部分區(qū)域是指有義鏈的5’側(cè)(5’端)和反義鏈的3’側(cè)(3’端)?；蛘?，將位于 有義鏈5’端側(cè)翼和/或反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域稱(chēng)作上游部分區(qū)域。也就是說(shuō)，在優(yōu)選實(shí) 施方案中，位于反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域包含RNA，或者位于有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域和反義 鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均包含RNA。例如，本發(fā)明的嵌合或雜交型雙鏈分子包括如下組合有義鏈5，-[DNA]_3，3，~ (RNA) - [DNA] _5，反義鏈有義鏈5，_(RNA)-[DNA]-3，3，~ (RNA) - [DNA] _5，反義鏈，和有義鏈5，_(RNA)-[DNA]-3，3’ -(RNA)-5’ 反義鏈。上游部分區(qū)域優(yōu)選地是由雙鏈分子有義或反義鏈內(nèi)從靶序列或其互補(bǔ)序列的末 端數(shù)起的9-13個(gè)核苷酸組成的區(qū)域。而且，這種嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實(shí)例包括鏈長(zhǎng)為 19-21個(gè)核苷酸，其中多核苷酸的至少上游一半(對(duì)于有義鏈而言為5’側(cè)區(qū)域，對(duì)于反義鏈 而言是3’側(cè)區(qū)域)是RNA，另一個(gè)半?yún)^(qū)是DNA。在這種嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達(dá) 的效果比整個(gè)反義鏈都是RNA時(shí)的效果高得多(US20050004064)。在本發(fā)明中，雙鏈分子可以形成發(fā)夾，例如短發(fā)夾RNA(shRNA)和由DNA和RNA組 成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是一段RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其 形成緊密的發(fā)夾轉(zhuǎn)角(turn)，可用于通過(guò)RNA干擾來(lái)沉默基因表達(dá)。shRNA或shD/R-NA包 含位于一條鏈上的有義靶序列和反義靶序列，其中所述序列被一個(gè)環(huán)序列分開(kāi)。一般地，發(fā) 夾結(jié)構(gòu)被細(xì)胞機(jī)制切割成dsRNA或dsD/R-NA，它進(jìn)而結(jié)合RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。 該復(fù)合體結(jié)合并切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的靶序列匹配的mRNA。有義和反義序列之間可以有由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列，以形成發(fā)夾環(huán)結(jié) 構(gòu)。因此，本發(fā)明還提供了一種雙鏈分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包 含靶序列的有義鏈，[B]是間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。靶序列可 從例如如下核苷酸的組中選出SEQIDN0:16，或SEQ ID NO 17 用于 PKIB ；核苷酸SEQ ID NO 19 用于 NAALADL2 ；核苷酸本發(fā)明不僅限于這些實(shí)例，[A]中的靶序列可以是這些實(shí)例的修飾序列，只要該 雙鏈分子保留抑制靶定PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)的能力即可。區(qū)域[A]與[A’ ]雜 交，形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。間插單鏈部分[B]，即環(huán)序列，的長(zhǎng)度優(yōu)選地為3-23個(gè)核苷 酸。環(huán)序列可以從例如包含如下序列的組中選出(http://www. ambion. com/techlib/tb/tb 506. html)。進(jìn)一步，由23個(gè)核苷酸構(gòu)成的環(huán)序列也可提供活性siRNACJacque JM et al.， Nature 2002Jul25,418 (6896) :435_8，電子形式公布于 2002 年 6 月 26 日)
CCC、CCACC、或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8，電子形式公布于2002年6月26日；UUCG :Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002May, 20 (5) 500-5 ；FruscoloniP et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 2003Feb 18，100 (4) : 1639-44，電子形式公布于 2003 年 2 月 10日；和UUCAAGAGA :Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003Jun，4(6) 457-67。作為舉例，下面顯示了優(yōu)選的本發(fā)明具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈分子。在下面的結(jié)構(gòu) 中，環(huán)序列可以選自 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA ；然而， 本發(fā)明并不僅限于此gauaugccaucccagauuu-[B]_aaaucugggauggcauauc (用于革巴序列 SEQ ID NO 16)；gucaaauuccccaaauuaa-[B]_uuaauuuggggaauuugac (用于革巴序列 SEQ ID NO 17)； 禾口guguccagaggccaauauu-[B]_aauauuggccucuggacac (用于革巴序列 SEQ ID NO 19)；進(jìn)一步，為了提高雙鏈分子的抑制活性，可以向靶序列反義鏈的3’端添加核苷酸 “u”，作為3’突出端。添加的“u”的數(shù)目至少為2個(gè)，一般為2-10個(gè)，優(yōu)選地為2-5個(gè)。添 加的“11”在雙鏈分子反義鏈的3’端形成單鏈。制備雙鏈分子的方法沒(méi)有特殊限制，但優(yōu)選地使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成方法。 根據(jù)化學(xué)合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后通過(guò)合適的方法將它們退火 在一起，以獲得雙鏈分子。退火的具體實(shí)例包括，其中合成的單鏈多核苷酸以?xún)?yōu)選地至少大 約3 7;更優(yōu)選地大約4 6，最優(yōu)選地基本上等摩爾量(即大約5 5的摩爾比)的比 例混合。接著，將混合物加熱到雙鏈分子會(huì)解離的溫度，然后緩慢冷卻下來(lái)。經(jīng)退火的雙鏈 分子可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的通常使用的方法加以純化。純化方法的實(shí)例包括使用瓊脂糖凝 膠電泳的方法，或者視情況除去剩余的單鏈多核苷酸(例如通過(guò)用合適的酶降解)的方法。PKIB或NAALADL2序列的側(cè)翼調(diào)節(jié)序列可以是相同或不同的，從而它們的表達(dá)可 以獨(dú)立地接受調(diào)節(jié)，或者按照時(shí)間(temporal)或空間(spatial)的方式接受調(diào)節(jié)?？梢?通過(guò)將PKIB或NAALDADL2基因模板克隆到載體內(nèi)，例如含有來(lái)自小核RNA (snRNA) U6或人 H1RNA啟動(dòng)子的RNA pol III轉(zhuǎn)錄單元的載體內(nèi)，來(lái)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出雙鏈分子。含有雙鏈分子的載體本發(fā)明還包括含有一個(gè)或多個(gè)本文所述雙鏈分子的載體，和含有該載體的細(xì)胞。 本發(fā)明的載體優(yōu)選地以可表達(dá)的形式編碼本發(fā)明的雙鏈分子。這里，術(shù)語(yǔ)“以可表達(dá)的形 式”是指載體在被引入到細(xì)胞內(nèi)時(shí)會(huì)表達(dá)所述分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包括雙鏈分 子表達(dá)必需的調(diào)節(jié)元件。本發(fā)明的這些載體可用于產(chǎn)生本發(fā)明的雙鏈分子，或者直接作為 用于癌癥治療的活性成分。本發(fā)明載體的產(chǎn)生可以通過(guò)例如將PKIB或NAALADL2序列克隆到表達(dá)載體內(nèi)，使 調(diào)節(jié)序列與PKIB或NAALADL2序列以允許兩條鏈表達(dá)(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄)的方式操作 連接(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002May, 20 (5) :500_5)。例如，相對(duì)于 mRNA 為反 義的RNA分子被第一個(gè)啟動(dòng)子(例如所克隆DNA的3’端側(cè)翼的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄，相對(duì)于 mRNA為有義的RNA分子則被第二個(gè)啟動(dòng)子(例如所克隆DNA 5’端側(cè)翼的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄。有義鏈和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默基因的雙鏈分子構(gòu)建體?；蛘撸褂脙蓚€(gè)載 體構(gòu)建體，它們分別編碼雙鏈分子有義和反義鏈，來(lái)分別表達(dá)有義鏈和反義鏈，然后形成雙 鏈分子構(gòu)建體。而且，所克隆的序列可以編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體；即載體 的單個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)含有靶基因的有義序列和互補(bǔ)反義序列。還可以為本發(fā)明的載體提供必要的裝備，以實(shí)現(xiàn)在靶細(xì)胞的基因組中的穩(wěn)定插 入(同源重組盒載體的描述見(jiàn)例如Thomas KR&Capecchi MR，Celll987，51 :503_12)。見(jiàn) 例如 Wolff et al.，Science 1990，247 1465-8 ；US PatentNos. 5，580，859 ；5，589，466 ； 5，804，566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；和 W098/04720?；?DNA 的遞送技術(shù)的實(shí) 例包括“裸DNA”，協(xié)助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導(dǎo)的)遞送、陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù) 合體和顆粒介導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的遞送(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5，922，687)。本發(fā)明的載體可以是，例如，病毒或細(xì)菌載體。表達(dá)載體的實(shí)例包括減毒病毒宿 主，例如牛痘或禽痘(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No. 4，722，848)。這種方法涉及使用痘苗病毒，例 如作為載體來(lái)表達(dá)編碼該雙鏈分子的核苷酸序列。在被引入到表達(dá)靶基因的細(xì)胞內(nèi)時(shí)，重 組牛痘病毒表達(dá)該分子，借此抑制細(xì)胞的增殖?？墒褂玫妮d體的另一個(gè)實(shí)例包括卡介苗 (BCG)。BCG 載體在 Stover et al.，Nature 1991，351 :456_60 中有記載。多種其它載體也 可用于雙鏈分子的治療性施用和產(chǎn)生；實(shí)例包括腺病毒載體和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等。見(jiàn)例如Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66_71 ；Shedlock et al.，J LeukocBiol 2000,68 :793_806 ； 和 Hipp et al. ， In Vivo 2000，14 :571_85。用雙鏈分子治療癌癥的方法在本發(fā)明中，為PKIB構(gòu)建了 3種不同的dsRNA，為NAALADL2構(gòu)建了 3種不同的 dsRNA，測(cè)試它們抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。PKIB的兩種dsRNA有效敲低了基因在兩種前列腺癌 細(xì)胞系中的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞增殖被抑制(圖3A、B和C)。NAALADL2的一個(gè)dsRNA顯著降低 了前列腺細(xì)胞系中的表達(dá)水平和細(xì)胞生長(zhǎng)能力(圖4A-E)。因此，本發(fā)明提供了通過(guò)抑制PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)，誘導(dǎo)PKIB或 NAALADL2基因的功能障礙，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，即前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。PKIB或 NAALADL2基因的表達(dá)可以被任何前述的特異性靶定PKIB或NAALADL2基因的本發(fā)明雙鏈分 子所抑制，或者被能夠表達(dá)任何該雙鏈分子的本發(fā)明載體所抑制。本發(fā)明雙鏈分子和載體的這種抑制癌性細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)的能力提示它們能夠用 于癌癥治療方法。因此，本發(fā)明提供了治療前列腺癌患者的方法，所述方法施用針對(duì)PKIB 或NAALADL2基因的雙鏈分子或表達(dá)該分子的載體，而沒(méi)有不良作用，因?yàn)檫@些基因在正常 器官中幾乎未檢出(圖1和2)。術(shù)語(yǔ)“特異性抑制”，在抑制性多核苷酸和多肽的語(yǔ)境中，是指試劑或配體抑制 PKIB或NAALADL2的表達(dá)或生物學(xué)功能的能力。特異性抑制通常導(dǎo)致PKIB或NAALADL2的 表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄或翻譯)或測(cè)得的生物學(xué)功能(例如細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖，細(xì)胞凋亡的抑制)與 背景相比至少有大約2倍的抑制，優(yōu)選地大于大約10倍，最優(yōu)選地大于100倍的抑制。表 達(dá)水平和/或生物學(xué)功能可以通過(guò)比較經(jīng)過(guò)處理的和未經(jīng)處理的細(xì)胞或者處理之前和之 后的細(xì)胞群體加以測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，PKIB或NAALADL2的表達(dá)或生物學(xué)功能被完 全抑制。典型地，特異性的抑制，是利用合適的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，顯示PKIB或NAALADL2的表達(dá)或
17生物學(xué)功能的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的降低(例如P ^ 0. 05)。具體地，本發(fā)明提供了如下的方法[1]_[23][1] 一種用于治療前列腺癌的方法，包括施用至少一種分離的雙鏈分子的步驟，所 述雙鏈分子抑制PKIB或NAALADL2在過(guò)表達(dá)該基因的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和細(xì)胞的增殖，該分子 包括有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。[2] [1]所述的方法，其中該有義鏈包含與從SEQ ID NO :16，17和19的組中選出 的靶序列對(duì)應(yīng)的序列。[3] [1]所述的方法，其中待治療的前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢(shì)抵抗性 前列腺癌；[4] [1]所述的方法，其中施用多種雙鏈分子；[5] [4]所述的方法，其中所述多種雙鏈分子靶定相同的基因；[6] [1]所述的方法，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度小于約100個(gè)核苷酸；[7] [6]所述的方法，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度小于約75個(gè)核苷酸；[8] [7]所述的方法，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度小于約50個(gè)核苷酸；[9] [8]所述的方法，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度小于約25個(gè)核苷酸；[10] [9]所述的方法，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度為大約19-大約25個(gè)核苷酸；[11] [1]所述的方法，其中雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過(guò) 間插單鏈連接起來(lái)的有義鏈和反義鏈；[12] [11]所述的方法，其中雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]_3’，其中[A]是 包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組成的間插單 鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈；[13] [1]所述的方法，其中雙鏈分子包含RNA ；[14] [1]所述的方法，其中雙鏈分子包含DNA和RNA ；[15] [14]所述的方法，其中雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜交體；[16] [15]所述的方法，其中所述有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸分別由DNA和 RNA構(gòu)成；[17] [14]所述的方法，其中所述雙鏈分子是DNA和RNA的嵌合體；[18] [17]所述的方法，其中位于反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA構(gòu)成，或者位于有 義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA構(gòu)成；[19] [18]所述的方法，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9-13個(gè)核苷酸組成；[20] [1]所述的方法，其中所述雙鏈分子含有3’突出端；[21] [1]所述的方法，其中所述雙鏈分子由載體編碼；[22] [21]所述的方法，其中所述由載體編碼的雙鏈分子具有通式 5，_[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A]是包含選自SEQ ID N0:16、17和19的序列的有義鏈，[B] 是由3-23個(gè)核苷酸組成的間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈；和[23] [1]所述的方法，其中雙鏈分子包含在組合物中，該組合物除了該分子之外還 包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和藥學(xué)上可接受的載體。下文中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的方法。通過(guò)使表達(dá)PKIB或NAALADL2基因的細(xì)胞與針對(duì)PKIB或NAALADL2基因的雙鏈分
18子、表達(dá)該分子的載體、或包含它(們)的組合物接觸，可抑制該細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步使細(xì) 胞與轉(zhuǎn)染劑接觸。合適的轉(zhuǎn)染劑是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語(yǔ)“抑制細(xì)胞生長(zhǎng)”表示與沒(méi)有暴露 于該分子的細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖速度更低或者生存力降低。細(xì)胞生長(zhǎng)可以用本領(lǐng)域已知的 方法測(cè)量，例如使用MTT細(xì)胞增殖測(cè)定。任何類(lèi)型細(xì)胞的生長(zhǎng)均可根據(jù)本發(fā)明加以抑制，只要該細(xì)胞表達(dá)或過(guò)表達(dá)本發(fā)明 雙鏈分子的靶基因即可。示例細(xì)胞包括前列腺癌細(xì)胞。因此，對(duì)于患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上與PKIB或NAALADL2相關(guān)的疾病的患者，可以通過(guò)施 用至少一種本發(fā)明的雙鏈分子、至少一種表達(dá)至少一種該分子的載體、或至少一種含有至 少一種該分子的組合物加以治療。例如，前列腺癌患者可以根據(jù)本發(fā)明的方法加以治療。癌 癥的類(lèi)型可以利用與待診斷腫瘤的具體類(lèi)型相應(yīng)的常規(guī)方法加以鑒定。前列腺癌可以用例 如前列腺特異抗原(PSA)或直腸指檢(digital rectal exam)進(jìn)行診斷。更優(yōu)選地，通過(guò) RT-PCR或免疫測(cè)定檢測(cè)來(lái)自患者的活檢物中的PKIB或NAALADL2的表達(dá)，據(jù)此選擇可通過(guò) 本發(fā)明方法治療的患者。優(yōu)選地，在用本發(fā)明治療之前，通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，例如免疫 組織化學(xué)分析或RT-PCR，確認(rèn)來(lái)自受試者的活檢樣本中PKIB或NAALADL2基因的過(guò)表達(dá)。根據(jù)該抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以治療癌癥的方法，在施用多種雙鏈分子(或表達(dá)這些分子 的載體或含有這些分子的組合物)時(shí)，每種分子可以針對(duì)PKIB和/或NAALADL2的相同靶 序列或者不同靶序列。例如，所述方法可以采用針對(duì)PKIB或NAALADL2的雙鏈分子。或者， 例如，所述方法可以采用針對(duì)從PKIB和NAALADL2選出的1種、2種或多種靶序列的雙鏈分 子。為了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，可以將本發(fā)明的雙鏈分子以該分子與相應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn) 錄本相結(jié)合的形式直接導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)?；蛘?，如上文所述，可將編碼該雙鏈分子 的DNA作為載體導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。為了將雙鏈分子和載體導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，可以采用轉(zhuǎn) 染增強(qiáng)齊U，例如 FuGENE(Rochediagnostices)， Lipofectamine 2000(Invitrogen)、 Oligofectamine (Invitrogen)、禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)。如果治療可導(dǎo)致臨床利益，例如患者體內(nèi)PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)降低，或癌 癥的大小、普遍性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力下降，則治療可被確定有效。當(dāng)治療是預(yù)防性 施用時(shí)，“有效”的意思是它可阻止或預(yù)防癌癥形成，或者預(yù)防或減輕癌癥的臨床癥狀。有效 性的確定可以和任何已知的用于診斷或治療特定腫瘤類(lèi)型的方法結(jié)合進(jìn)行。預(yù)防(prevention和prophylaxis)包括任何可以減輕疾病所致的死亡率或發(fā)病 率負(fù)擔(dān)的活動(dòng)。預(yù)防可以在“一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)預(yù)防水平”上進(jìn)行。一級(jí)預(yù)防是避免疾病的 發(fā)生，而二級(jí)和三級(jí)水平的預(yù)防包括旨在預(yù)防疾病進(jìn)展和癥狀出現(xiàn)、以及通過(guò)恢復(fù)功能和 減少疾病相關(guān)并發(fā)癥來(lái)減輕已成形的疾病的負(fù)面影響的活動(dòng)。或者，預(yù)防包括廣泛的旨在 減輕特定疾病嚴(yán)重性的預(yù)防性治療，例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，減少血管新生。癌癥的治療和/或防治，和/或術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)防包括任何如下步驟，例如手術(shù)除去 癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞的生長(zhǎng)、腫瘤的消退或衰退，誘導(dǎo)癌癥的減輕和抑制癌癥的發(fā)生、腫 瘤衰退、和減少或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或防治可降低患癌個(gè)體的死亡率，改善患 癌個(gè)體的預(yù)后，降低血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，和減輕可檢測(cè)的癌癥伴隨癥狀。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的雙鏈分子以亞化學(xué)計(jì)量的方式降解靶mRNA (PKIB或 NAALADL2)。不希望受限于任何理論，我們相信，本發(fā)明的雙鏈分子是以催化的方式降解靶mRNA的。因此，與常規(guī)的癌癥治療相比，為發(fā)揮治療效果而需要在癌癥部位或其附近遞送的 雙鏈分子顯著較少。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)考慮如下因素，例如受試者的體重、年齡、性別、疾病類(lèi)型、 癥狀和其它條件；施用途徑；施用是局部性還是全身性的等，能夠容易地確定施予給定受 試者的本發(fā)明雙鏈分子的有效量。一般地，本發(fā)明雙鏈分子的有效量包括癌癥部位或附近 的細(xì)胞內(nèi)濃度，為大約1納摩爾(nM)-大約lOOnM，優(yōu)選地大約2nM_大約50nM，更優(yōu)選地大 約2. 5nM-大約lOnM。我們意圖可以施用更大或更小量的雙鏈分子。本方法可用于抑制癌癥的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移；例如前列腺癌，特別是激素難治性前列腺 癌或去勢(shì)抵抗性前列腺癌。特別地，包含PKIB靶序列(即SEQ IDN0:16和17)的雙鏈分子 是治療前列腺癌特別優(yōu)選的；包含NAALADL2靶序列(即SEQ ID NO 19)的雙鏈分子是治療 前列腺癌特別優(yōu)選的。為了治療癌癥，還可以將本發(fā)明的雙鏈分子和與該雙鏈分子不同的藥劑組合施用 給受試者?；蛘?，可以將本發(fā)明的雙鏈分子和另一種設(shè)計(jì)用于治療癌癥的治療方法組合施 用給受試者。例如，本發(fā)明的雙鏈分子可以和目前用于治療癌癥或防止癌癥轉(zhuǎn)移的治療方 法(例如放射治療，手術(shù)和使用化療劑例如順鉬、卡鉬、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、亞德里亞霉 素、柔紅霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)的治療)組合施用。在本方法中，雙鏈分子可以作為裸雙鏈分子施用、與遞送劑聯(lián)合施用、或者作為表 達(dá)雙鏈分子的重組質(zhì)粒或病毒載體施用給受試者。用于和本發(fā)明雙鏈分子聯(lián)合施用的合適遞送劑包括Mirus Trans it TKO 親脂試 劑；lipofectin ；lipofectamine ；cellfectin ；或多聚陽(yáng)離子(例如多聚賴(lài)氨酸)；或脂質(zhì) 體。優(yōu)選地遞送劑是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體能夠輔助將雙鏈分子遞送到特定組織，例如前列腺腫瘤組織，并且還能 夠增加雙鏈分子的血液半衰期。適于用在本發(fā)明的脂質(zhì)體由常規(guī)的囊泡形成性脂質(zhì) (vesicle-forming 1 ipids)形成，它們一般包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂和甾醇，例如膽 固醇。一般通過(guò)考慮期望的脂質(zhì)體大小和脂質(zhì)體在血流中的半衰期等因素來(lái)指導(dǎo)脂質(zhì)的 選擇。已知有多種方法用于制備脂質(zhì)體，例如在下列文獻(xiàn)中記載的Szoka et al. , Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ；和 US Pat. Nos. 4, 235, 871；4, 501, 728 ；4, 837, 028 -M 5，019，369，本文援引并入它們的全部公開(kāi)內(nèi)容。優(yōu)選地，封裝本發(fā)明雙鏈分子的脂質(zhì)體包括能夠?qū)⒅|(zhì)體遞送到癌癥部位的配體 分子。與普遍存在于腫瘤或血管內(nèi)皮細(xì)胞中的受體結(jié)合的配體，例如與腫瘤抗原或內(nèi)皮細(xì) 胞表面抗原結(jié)合的單克隆抗體，是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是對(duì)封裝本發(fā)明雙鏈分子的脂質(zhì)體加以修飾，以避免被單核巨噬細(xì)胞 和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system)所清除，例如通過(guò)使結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合有調(diào) 理作用抑制部分(moieties)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時(shí)包括調(diào)理作用 抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大型親 水性聚合物。如在本說(shuō)明書(shū)中所使用的，例如，當(dāng)調(diào)理作用抑制部分化學(xué)地或物理地搭接 在膜上時(shí)，例如通過(guò)脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過(guò)與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié) 合，則調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護(hù)性表層，顯著地減少單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(“匪S”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(”RES”)對(duì)脂質(zhì)體的攝 入；在例如美國(guó)專(zhuān)利第4，920，016號(hào)中對(duì)此有記載，后者的全部公開(kāi)內(nèi)容援引并入本說(shuō)明 書(shū)。因此，與未修飾的脂質(zhì)體相比，被調(diào)理作用抑制部分修飾過(guò)的脂質(zhì)體能夠保留在血液循 環(huán)中的時(shí)間顯著更長(zhǎng)。出于以上理由，上述脂質(zhì)體有時(shí)也被稱(chēng)為“隱形”(stealth)脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統(tǒng)供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統(tǒng)缺損為特征的靶組織，例如實(shí)體瘤中，這些脂質(zhì)體會(huì)高效率地蓄積。 參見(jiàn) Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，由于 RES 的攝入的減 少，防止隱形脂質(zhì)體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào) 理作用抑制部分修飾的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠?qū)⒈景l(fā)明的雙鏈核酸分子輸送至腫瘤細(xì)胞。適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選為分子量約500 約40，000道爾 頓、更優(yōu)選約2，000 約20，000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二 醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹(shù)狀聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，諸如化學(xué)結(jié)合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖 醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GMlt) PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共 聚體也是適合的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚 亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物還可以是含有 氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神 經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類(lèi)或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或 寡糖，例如，與碳酸的衍生物反應(yīng)而生成了羧基結(jié)合的羧基化多糖類(lèi)或寡糖。優(yōu)選地，調(diào)理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的 脂質(zhì)體有時(shí)稱(chēng)作“PEG化脂質(zhì)體”。調(diào)理作用抑制部分可以通過(guò)許多公知技術(shù)中的任何一種結(jié)合到脂質(zhì)體膜上。例 如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結(jié) 合，然后再結(jié)合到膜上。相似地，可以通過(guò)還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來(lái)將右旋糖 酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水 的30 12比例混合物。上文討論了表達(dá)本發(fā)明的雙鏈核酸分子的載體。這樣的表達(dá)至少一種本發(fā)明的雙 鏈核酸分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑，包括Mirus Transit LT1 脂 溶性試劑、lipofectin, lipofectamine, cellfectin、聚陽(yáng)離子(例如聚賴(lài)氨酸)或脂質(zhì)體 等組合施用。將表達(dá)本發(fā)明的雙鏈核酸分子的重組病毒載體投遞到患者的癌癥區(qū)域的方法 在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的雙鏈核酸分子可以通過(guò)適于將雙鏈核酸分子投遞到癌癥區(qū)域的任何手 段來(lái)施用給受試者。例如，雙鏈核酸分子可以通過(guò)基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化 道或腸內(nèi)施用途徑來(lái)施用。合適的腸內(nèi)施用途徑包括口服、直腸或鼻內(nèi)投遞。合適的非消化道施用途徑包括靜脈內(nèi)施用(例如靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈 內(nèi)推注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和向血管網(wǎng)絡(luò)中的導(dǎo)管滴注)，組織周?chē)徒M織內(nèi)注射(例如腫瘤周?chē)?和腫瘤內(nèi)注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥區(qū)
21域或其附近，例如借助導(dǎo)管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的 視網(wǎng)膜片劑(retinal pellet)或栓劑或植入物)，和吸入。優(yōu)選通過(guò)注射或輸注將雙鏈核 酸分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發(fā)明的雙鏈核酸分子可以以單一劑量或分多個(gè)劑量來(lái)施用。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈核 酸分子通過(guò)輸注方式施用時(shí)，輸注可以是單個(gè)持續(xù)劑量，或者通過(guò)多次輸注來(lái)輸送。優(yōu)選的 是將藥劑直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優(yōu)選的是將藥劑多次注射到癌癥部 位或其附近的組織中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定合適的劑量方案來(lái)給受試者施用本發(fā)明的雙鏈 核酸分子。例如，可以將雙鏈核酸分子一次施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式 施用到癌癥部位或其附近?；蛘撸p鏈核酸分子可以在約3 約28日、更優(yōu)選約7 約10 日的期間內(nèi)施用給受試者，每日一次或二次。在優(yōu)選的劑量方案中，在7日期間內(nèi)每日一次 地將雙鏈核酸分子注射到癌癥部位或其附近。當(dāng)劑量方案包括多次施用時(shí)，應(yīng)該理解的是， 給受試者施用的雙鏈核酸分子的有效量，可以包含在整個(gè)劑量方案中施用的該雙鏈核酸分 子的總量。包含雙鏈分子的組合物進(jìn)一步，本發(fā)明提供了包含至少一種本發(fā)明雙鏈分子或編碼這些分子的載體的藥 物組合物。具體地，本發(fā)明提供了如下的組合物[1]_[23][1] 一種用于治療前列腺癌的組合物，包括至少一種分離的雙鏈分子，該雙鏈分子 抑制PKIB或NAALADL2的表達(dá)和細(xì)胞增殖，該分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，它們彼 此雜交形成該雙鏈分子。[2] [1]所述的組合物，其中該有義鏈包含與從SEQ ID NO 16，17和19中選出的 靶序列對(duì)應(yīng)的序列。[3] [1]所述的組合物，其中待治療的前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢(shì)抵抗 性前列腺癌；[4] [1]所述的組合物，其中該組合物含有多種所述的雙鏈分子；[5] [4]所述的組合物，其中所述多種雙鏈分子靶定相同的基因；[6] [1]所述的組合物，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度少于約100個(gè)核苷酸；[7] [6]所述的組合物，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度少于約75個(gè)核苷酸；[8] [7]所述的組合物，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度少于約50個(gè)核苷酸；[9] [8]所述的組合物，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度少于約25個(gè)核苷酸；[10] [9]所述的組合物，其中雙鏈分子的長(zhǎng)度為約19-大約25個(gè)核苷酸；[11] [1]所述的組合物，其中雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通 過(guò)間插單鏈連接起來(lái)的有義鏈和反義鏈；[12] [11]所述的組合物，其中雙鏈分子具有通式5’ _[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A] 是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組成的間插 單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈；[13] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子包含RNA ；[14] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA ；[15] [14]所述的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜
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[16] [15]所述的組合物，其中所述有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸分別由DNA 和RNA構(gòu)成；[17] [14]所述的組合物，其中雙鏈分子是DNA和RNA的嵌合體；[18] [17]所述的組合物，其中位于反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA構(gòu)成，或者位于 有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA構(gòu)成；[19] [18]所述的組合物，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9-13個(gè)核苷酸構(gòu)成；[20] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子含有3’突出端；[21] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子由載體所編碼，并且包含在組合物內(nèi)；[22] [21]所述的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5’-[幻-[8]-仏’]_3’，其中 [A]是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組成的間 插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈；和[23] [1]所述的組合物，其中該組合物包含轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的方法在下文將有更加詳細(xì)的記載。對(duì)于本發(fā)明的雙鏈核酸分子，在施用給受試者之前，優(yōu)選采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的 技術(shù)將其配制成藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物的特征在于至少是無(wú)菌和無(wú)熱源的。如 在本說(shuō)明書(shū)中使用的，“藥物制劑”包括人用和獸醫(yī)用的制劑。本發(fā)明的藥物組合物的制備 方法在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，例如如Remington' s Pharmaceutical Science, 17th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pa. (1985)所記載的，將其全部?jī)?nèi)容援引并入本說(shuō) 明書(shū)。本藥物制劑包含至少一種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它們的載體(例如重量比 0. 1-90% )，或者所述分子的生理可接受的鹽，與生理可接受的載體介質(zhì)相混合。優(yōu)選的生 理可接受的載體介質(zhì)是水、緩沖水(buffered water)、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、 透明質(zhì)酸等。根據(jù)本發(fā)明，該組合物可以含有多種類(lèi)型的雙鏈分子，每一種分子可以被導(dǎo)向到 PKIB和/或NAALADL2的相同靶序列或不同靶序列。例如，所述組合物可以含有針對(duì)PKIB 或NAALADL2的雙鏈分子?；蛘?，例如，所述組合物可以包含針對(duì)從PKIB或NAALADL2選出 的一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)靶序列的雙鏈分子。進(jìn)一步，本組合物可以含有編碼一個(gè)或多個(gè)雙鏈分子的載體。例如，載體可以編碼 一種、兩種或多種本發(fā)明雙鏈分子?；蛘?，本組合物可以包含多種類(lèi)型的載體，每一種載體 編碼一種不同的雙鏈分子。而且，本雙鏈分子可以作為脂質(zhì)體包含在本發(fā)明組合物中。關(guān)于脂質(zhì)體的細(xì)節(jié)，見(jiàn) 條目“使用雙鏈分子治療癌癥的方法”。此外，本發(fā)明的藥物組合物中還可以包含常規(guī)的藥用賦形劑和/或添加劑。合適 的藥用賦形劑包括穩(wěn)定化劑、抗氧化劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加 劑包括生理學(xué)上生物相容性的緩沖液(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補(bǔ)加螯合劑(例如DTPA 或DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復(fù)合物(例如、鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選地， 補(bǔ)加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發(fā)明的藥物組合物可 以進(jìn)行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。
對(duì)于固體組合物，可以使用常規(guī)的無(wú)毒固態(tài)載體；例如，藥物級(jí)的甘露醇、乳酸、淀 粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于口服的固體藥物組合物可以包括任何上面列舉的載體和賦形劑，和 10-95%，優(yōu)選地25-75%的一種或多種本發(fā)明雙鏈分子。用于噴霧(吸入)施用的藥物組 合物可以包括重量比0. 01-20%，優(yōu)選地重量比1-10%的一種或多種如上所述地包被在脂 質(zhì)體中的本發(fā)明雙鏈分子，和推進(jìn)劑。還可以視需要包含載體；例如卵磷脂，用于鼻內(nèi)遞送。除了上述之外，本組合物可以含有其它的藥物活性成分，只要它們不抑制本雙鏈 分子的體內(nèi)功能即可。例如，組合物可以含有常規(guī)用于治療癌癥的化療劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的雙鏈核酸分子在制備用于治療表達(dá) PKIB和/或NAALADL2基因的癌癥的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明涉及下述雙鏈核酸 分子在制備用于治療表達(dá)PKIB和/或NAALADL2基因的癌癥的藥物組合物中的用途該雙 鏈核酸分子在細(xì)胞中抑制PKIB和/或NAALADL2基因的表達(dá)，該分子包含有義鏈和與之互 補(bǔ)的反義鏈，所述有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈彼此雜交而形成所述雙鏈核酸分子，且該分 子以選自SEQ ID NO 16、17和19中的序列為靶標(biāo)?；蛘?，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制造用于治療表達(dá)PKIB和/或NAALADL2基因的 癌癥的藥物組合物的方法或過(guò)程，其中該方法或過(guò)程包括將藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載 體與作為活性成分的、可抑制PKIB和/或NAALADL2基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的雙鏈核酸分子 一起配制的步驟，該分子包括有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，所述有義鏈和反義鏈彼此雜交 形成所述雙鏈核酸分子，并且該分子以選自SEQ ID N0:16、17和19的序列為靶標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于制造用于治療表達(dá)PKIB和/或 NAALADL2基因的癌癥的藥物組合物的方法或過(guò)程，其中該方法或過(guò)程包括混合活性成分與 藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體的步驟，其中該活性成分是抑制PKIB和/或NAALADL2基 因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的雙鏈核酸分子，該分子包括有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，所述有義鏈和 反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈核酸分子，并且該分子以選自SEQ ID N0:16、17和19的序列 為靶標(biāo)?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明雙鏈分子在制造用于治療前列腺癌的藥物組合 物方面的應(yīng)用。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了用于治療前列腺癌的本發(fā)明雙鏈分子。診斷前列腺癌的方法PKIB或NAALADL2的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)特異性地在前列腺癌細(xì)胞中變得更高(圖1A、B、 C、D、E、F和圖2A，B)。因此，本文鑒定的基因以及其轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物可作為標(biāo)志用于診斷前 列腺癌，并且，通過(guò)測(cè)量PKIB或NAALADL2在細(xì)胞樣品中的表達(dá)，可以診斷前列腺癌。具體 地說(shuō)，本發(fā)明提供了通過(guò)確定PKIB或NAALADL2在受試者中的表達(dá)水平來(lái)診斷前列腺癌的 方法?？梢酝ㄟ^(guò)本方法診斷的前列腺癌包括激素難治性前列腺癌或去勢(shì)抵抗性前列腺癌。本發(fā)明的方法可以為確定受試者狀況提供初始結(jié)果。這些初始結(jié)果可以和其他信 息結(jié)合，來(lái)幫助醫(yī)生、護(hù)士或其它從業(yè)人員診斷疾病?；蛘撸景l(fā)明可用于檢測(cè)受試者來(lái)源 組織中的癌性細(xì)胞，并為醫(yī)生提供診斷疾病的有用信息。具體地，本發(fā)明提供了如下方法[1]_[10][1] 一種用于診斷或檢測(cè)前列腺癌存在的方法，所述方法包括如下步驟(a)檢測(cè)生物樣品中編碼PKIB或NAALADL2氨基酸序列的基因的表達(dá)水平；和
(b)將該基因與正常對(duì)照水平相比的表達(dá)水平增加與疾病相關(guān)聯(lián)。[2] [1]所述的方法，其中表達(dá)水平比正常對(duì)照水平至少高10%。[3] [1]所述的方法，其中通過(guò)選自下組的任何一種方法檢測(cè)表達(dá)水平(a)檢測(cè)包含PKIB或NAALADL2的序列的mRNA，(b)檢測(cè)包含PKIB或NAALADL2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和(c)檢測(cè)包含PKIB或NAALADL2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性。[4] [1]所述的方法，其中前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢(shì)抵抗性前列腺 癌。[5] [3]所述的方法，其中通過(guò)檢測(cè)探針與基因轉(zhuǎn)錄本的雜交確定表達(dá)水平。[6] [3]所述的方法，其中表達(dá)水平的確定是通過(guò)檢測(cè)抗體與由基因編碼的蛋白質(zhì) 的結(jié)合作為基因的表達(dá)水平。[7] [1]所述的方法，其中生物樣品包括活檢物、痰、血液或尿。[8] [1]所述的方法，其中受試者來(lái)源的生物樣品包括上皮細(xì)胞。[9] [1]所述的方法，其中受試者來(lái)源的生物樣品包括癌細(xì)胞。[10] [1]所述的方法，其中受試者來(lái)源的生物樣品包括癌性上皮細(xì)胞。下文將更詳細(xì)地記載診斷或檢測(cè)前列腺癌存在的方法。本方法要診斷的受試者優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括，但不限于，例如 人、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛。優(yōu)選地從待診斷的受試者收集生物樣品來(lái)進(jìn)行診斷。任何生物材料均可用作供測(cè) 定的生物樣品，只要其包含PKIB或NAALADL2的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物即可。生物樣品 包括，但不僅限于，身體組織或體液，例如血液、痰和尿。優(yōu)選地，生物樣品含有細(xì)胞群體，包 括上皮細(xì)胞，更優(yōu)選地是癌上皮細(xì)胞或來(lái)自懷疑為癌性的前列腺組織的上皮細(xì)胞。進(jìn)一步， 如果需要，可以從所得身體組織和體液純化出細(xì)胞，然后用作生物樣品。根據(jù)本發(fā)明，測(cè)定PKIB或NAALADL2在受試者來(lái)源的生物樣品中的表達(dá)水平。表 達(dá)水平可以在轉(zhuǎn)錄本(核酸)產(chǎn)物水平上加以確定，使用本領(lǐng)域已知的方法。例如，PKIB或 NAALADL2的mRNA可以通過(guò)雜交方法(例如Northern雜交)用探針進(jìn)行定量。檢測(cè)可以 在芯片或陣列上進(jìn)行。對(duì)于包括PKIB或NAALADL2在內(nèi)的多數(shù)個(gè)基因(例如各種癌特異基 因)的表達(dá)水平的檢測(cè)，陣列的使用是優(yōu)選的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用PKIB(SEQ IDN0 1 ；GenBank 登錄號(hào)匪 181795)或 NAALADL2 (SEQ ID NO 3 ；GenBank 登錄號(hào)匪 207015 或 SEQ ID NO 5;GenBank登錄號(hào)AK021754)的序列信息制備這些探針。例如，可以使用PKIB 或NAALADL2的cDNA作為探針。如果需要，可以用合適的標(biāo)簽，例如染料、熒光和同位素 等，來(lái)標(biāo)記探針，由此基因的表達(dá)水平可以作為雜交標(biāo)簽的強(qiáng)度加以檢測(cè)。進(jìn)一步，PKIB或 NAALADL2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過(guò)基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法(例如RT-PCR)用引物進(jìn)行定量。這 些引物還可以根據(jù)基因的可用序列信息加以制備。例如，實(shí)施例中使用的引物(SEQ ID NO 8-15)可以用來(lái)實(shí)施RT-PCR或Northern印跡檢測(cè)，但是本發(fā)明并不僅限于此。具體地，用于本方法的探針或引物在嚴(yán)格、中等嚴(yán)格或低嚴(yán)格條件下與PKIB或 NAALADL2的mRNA雜交。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該 條件下，探針或引物與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴(lài)于序列的，在 不同的環(huán)境下會(huì)不同。較長(zhǎng)序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。一般地，
25嚴(yán)格條件的溫度應(yīng)選擇比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。Tm 是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與靶序列互補(bǔ)的探針與靶 序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^(guò)量存在，因此在Tm下，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典 型地，嚴(yán)格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約1. 0M鈉離子，典型地大約0. 01-1. 0M鈉離子 (或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對(duì)于較短的探針或引物(例如10-50個(gè)核苷酸)是至少大約 30°C，用于較長(zhǎng)的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑，例如甲 酰胺，來(lái)實(shí)現(xiàn)。 或者，可以檢測(cè)翻譯產(chǎn)物以進(jìn)行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定PKIB或NAALADL2 蛋白的量。測(cè)定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測(cè)定法，此類(lèi)方法使用特異識(shí)別 PKIB或NAALADL2蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或 修飾(例如嵌合抗體、sCFV、Fab、F(ab，)2、Fv等)均可用于檢測(cè)，只要該片段保留對(duì)PKIB 或NAALADL2蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類(lèi)型的用于檢測(cè)蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域 眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。優(yōu)選地，結(jié) 合PKIB的抗體被制備為具有表位肽，所述表位肽包含SARAGRRNALPDIQSSAATD(SEQ ID NO 33)或 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK (SEQ ID NO 34)的氨基酸序列。而與 NAALADL2 結(jié)合的抗體 則被制備為具有含有胞外域(SEQ ID NO 32)的表位肽。作為根據(jù)翻譯產(chǎn)物檢測(cè)PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)水平的另一種方法，可以用 針對(duì)PKIB或NAALADL2蛋白的抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)分析觀(guān)察染色的強(qiáng)度。也就是說(shuō)，強(qiáng) 染色觀(guān)察結(jié)果表明蛋白存在量增加，同時(shí)表明PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)水平升高。而且，除了 PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)水平之外，還可以確定其它癌癥相關(guān)基因 的表達(dá)水平，例如已知在前列腺癌中差異表達(dá)的基因，以提高診斷的準(zhǔn)確度。如果PKIB或NAALADL2在生物樣品中的表達(dá)水平比PKIB或NAALADL2基因的對(duì)照 水平增加例如10 %、25 %或50 % ；或者增加到超過(guò)1. 1倍，超過(guò)1. 5倍，超過(guò)2. 0倍，超過(guò) 5. 0倍，超過(guò)10. 0倍或者更多，則可看作該表達(dá)水平升高。對(duì)照水平可以與測(cè)試生物樣品同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(患癌或未患癌) 已知的患者收集和保存的樣品?；蛘?，對(duì)照水平可以借助統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)通過(guò)分析先前測(cè)定 的來(lái)自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的PKIB或NAALADL2基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確 定。進(jìn)一步，對(duì)照水平可以是來(lái)自先前測(cè)試過(guò)的細(xì)胞的表達(dá)模式數(shù)據(jù)庫(kù)。而且，根據(jù)本發(fā)明 的一個(gè)方面，可以將生物樣品中PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)水平與從多個(gè)參考樣品確定 的多個(gè)對(duì)照水平比較。優(yōu)選地使用從來(lái)自與患者來(lái)源樣品組織類(lèi)型相似的組織類(lèi)型的參考 樣品確定的對(duì)照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中PKIB或NAALADL2 基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值士2S. D.或平均值士3S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的語(yǔ)境下，從已知非癌性的生物樣 品確定的對(duì)照水平稱(chēng)作“正常對(duì)照水平”。另一方面，如果對(duì)照水平從癌性生物樣品確定，則 稱(chēng)作“癌對(duì)照水平”。當(dāng)PKIB或NAALADL2基因的表達(dá)水平比正常對(duì)照水平增加或者與癌對(duì)照水平相似 時(shí)，可以診斷患者罹患或者具有發(fā)生癌癥的危險(xiǎn)。而且，當(dāng)比較多種癌癥相關(guān)基因的表達(dá)水 平時(shí)，樣品與癌參考樣品之間基因表達(dá)模式相似表明受試者罹患或具有發(fā)生癌癥的危險(xiǎn)。測(cè)試生物樣品的表達(dá)水平與對(duì)照水平間的差異，可以相對(duì)已知表達(dá)水平不會(huì)隨著細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對(duì)照核酸，例如管家基因，的表達(dá)水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例對(duì)照基 因包括，但不僅限于，肌動(dòng)蛋白、甘油醛_3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白P1。抗前列腺癌化合物的篩選在本發(fā)明的內(nèi)容中，待通過(guò)本篩選方法鑒定的治療劑可以是任何化合物或包含數(shù) 種化合物的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明篩選方法暴露于細(xì)胞或蛋白的測(cè)試劑可以是單個(gè)化 合物或多個(gè)化合物的組合。當(dāng)在方法中使用化合物組合時(shí)，化合物可以順次或同時(shí)加以接 觸。任何測(cè)試劑，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取 物、植物提取物、純化或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成小分子化合物以及天然化合物，均 可用于本發(fā)明的篩選方法中。也可使用本領(lǐng)域熟知的很多組合文庫(kù)方法中的任何途徑來(lái) 獲得測(cè)試化合物，包括(1)生物文庫(kù)，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(kù)(spatially addressable parallelsolid phase or solution phase libraries), (3) ■胃角軍 禾只 (deconvolution)的合成文庫(kù)法，(4)"一珠一化合物，，("one-bead one-compound，，)文 庫(kù)法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫(kù)法。使用親和色譜選擇的生物文庫(kù)法限于肽 文庫(kù)，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(kù)(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145_67)。合成分子文庫(kù)方法的例子可在本領(lǐng)域技術(shù)中找到(DeWitt et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 :6909_13 ；Erb etal.，Proc Natl Acad Sci USA 1994， 91 11422-6 ；Zuckermann et al. , J Med Chem37 :2678_85，1994 ;Cho et al. , Science 1993,261 1303-5 ；Carell et al. , AngewChem Int Ed Engl 1994,33 2059 ；Carell et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 2061 ；Gallop et al.，J Med Chem 1994,37 1233-51)。化合物文庫(kù)可提供于溶液中(見(jiàn) Houghten，Bio/Techniques 1992,13:412-21) 或珠子上(Lam, Naturel991，354 :82_4)、芯片上((Fodor, Nature 1993，364 :555_6)、細(xì)菌 上(美國(guó)專(zhuān)利5，223，409)、孢子上(美國(guó)專(zhuān)利5，571，698 ；5, 403，484和5，223，409)，質(zhì)粒上 (Cullet al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1992，89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Science 1990，249 :386_90 ；Devlin, Science 1990，249 404-6 ；Cwirla et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991，222 :301_10 ；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) 2002103360)。通過(guò)本發(fā)明任何篩選方法篩選到的化合物的一部分結(jié)構(gòu)通過(guò)添加、刪除、和/或 置換方式被轉(zhuǎn)換而得到的化合物，包括在通過(guò)本發(fā)明篩選方法鑒定的治療劑之內(nèi)。此外，當(dāng)所篩選的測(cè)試劑是蛋白質(zhì)時(shí)，為了獲得編碼該蛋白的DNA，可以確定蛋白 的全部氨基酸序列，以此推定編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸 序列，根據(jù)該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫(kù)，以獲得編碼該蛋白的 DNA。對(duì)所得的DNA進(jìn)行確認(rèn)，以其在制備治療或預(yù)防癌癥的候選物測(cè)試劑中的有用性為 準(zhǔn)?？捎糜诒疚乃龊Y選的測(cè)試劑還可以是這樣的抗體，它們特異結(jié)合PKIB或 NAALADL2蛋白或它們的在體內(nèi)缺乏原始蛋白生物活性的部分肽。盡管測(cè)試劑文庫(kù)的構(gòu)建是本領(lǐng)域眾所周知的，在下文中還是進(jìn)一步提供了鑒定測(cè) 試劑和構(gòu)建用于本篩選方法的這些治療劑文庫(kù)的指導(dǎo)。⑴分子建模
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對(duì)具有目標(biāo)性質(zhì)的化合物的分子結(jié)構(gòu)和/或?qū)Υ种瓢蟹肿蛹碢KIB和NAALADL2 的分子結(jié)構(gòu)的知識(shí)為人們構(gòu)建測(cè)試劑文庫(kù)提供了便利。預(yù)篩選適于進(jìn)一步評(píng)估的受試作用 劑的方法之一，是對(duì)受試作用劑與其靶標(biāo)的相互作用進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模。計(jì)算機(jī)建模技術(shù)為針對(duì)選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及會(huì)與該分子相互 作用的新化合物的合理設(shè)計(jì)提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴(lài)于從選定分子的x-射線(xiàn)晶 體分析或NMR成像而來(lái)的數(shù)據(jù)。分子動(dòng)力學(xué)需要力場(chǎng)數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)圖形系統(tǒng)為預(yù)測(cè)新化合 物如何連接靶分子，以及實(shí)驗(yàn)操作化合物和靶分子的結(jié)構(gòu)以?xún)?yōu)化結(jié)合特異性提供了可能。 為了預(yù)測(cè)當(dāng)分子和化合物之一或二者發(fā)生細(xì)小改變時(shí)分子-化合物相互作用是什么樣的， 需要分子力學(xué)軟件和計(jì)算密集型計(jì)算機(jī)，它們通常耦聯(lián)著分子設(shè)計(jì)程序和用戶(hù)之間的用戶(hù) 友好的、菜單驅(qū)動(dòng)的界面。上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, ffaltham, Mass。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu) 建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。利用QUANTA可進(jìn)行分子相互行為的互動(dòng)性構(gòu)建、修飾、和可 視化分析。有多篇文獻(xiàn)綜述了與特異蛋白相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97 :159—66 ;Ripka, NewScientist 1988,54—8; McKinlay&Rossmann,Annu Rev Pharmacol Toxicioll989, 29 111-22 ；Perry&Davies,Prog Clin Biol Res 1989,291 189-93 ；Lewis&Dean, Proc R Soc Lond 1989,236 :125-40, 141-62 ；以及綜述關(guān)于核酸組分模型受體的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111: 1082-90。其它可篩選并圖形描述化學(xué)物質(zhì)的計(jì)算機(jī)程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc.，Pasadena, Calif.，Allelix, Inc &司、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司獲取。見(jiàn)例如 Desjarlais et al. , JMed Chem 1988,31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992，13 :505_24；Meng et al.，Proteins 1993， 17 266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993，259 1445-50 (ii)組合化學(xué)合成測(cè)試劑的組合文庫(kù)可以作為合理藥物設(shè)計(jì)程序一其涉及有關(guān)已知化合物中存在 的核心結(jié)構(gòu)的知識(shí)一的一部分生成。該方法允許文庫(kù)保持合理的規(guī)模，便于高通量篩選。 或者，簡(jiǎn)單的、特別是短的聚合物分子文庫(kù)，可以通過(guò)直接合成構(gòu)成該文庫(kù)的分子家族的所 有排列來(lái)加以構(gòu)建。后一種方法的一個(gè)實(shí)例是全部由長(zhǎng)度為6個(gè)氨基酸組成的肽文庫(kù)。這 種肽文庫(kù)包含每一種6氨基酸序列組合。這種類(lèi)型的文庫(kù)稱(chēng)作線(xiàn)性組合化學(xué)文庫(kù)。組合化學(xué)文庫(kù)的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以通過(guò)化學(xué)或生物合成來(lái)產(chǎn) 生。組合化學(xué)文庫(kù)包括，但不僅限于，肽文庫(kù)(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5，010，175 ;Furka，Int J Pept Prot Res 1991,37 487-93 ；Houghten et al.，Naturel991，354 :84_6)。也可以使用 其它用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫(kù)的化學(xué)。這些化學(xué)包括，但不僅限于，肽(例如PCT申請(qǐng)?zhí)?W0 91/19735)，被編碼的肽(例如W0 93/20242)，隨機(jī)生物寡聚體(例如W0 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiaz印ines)(例如美國(guó)專(zhuān)利5，288，514)，diversomer如乙內(nèi)酰脲、 苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909_13)，插烯 化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽類(lèi)肽模擬物(Hirschmann et al.，J Amer ChemSoc 1992， 114 :9217-8)，小化合物文庫(kù)的模擬物有機(jī)合成(analogous organicsynthese) (Chen et al. , J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氨基甲酸鹽(Cho et al.，Science 1993， 261 :1303)，和 / 或Jj太酰膦酸酯(p印tidylphosphonates) (Campbell et al.，J Org Chem 1994,59:658),核酸文庫(kù)(見(jiàn) Ausubel, CurrentProtocols in Molecular Biology 1995supplement ；Sambrook et al. ,MolecularCloning :A Laboratory Manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory New York, USA)，肽核酸文庫(kù)(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利 5，539，083)， 抗體文庫(kù)(見(jiàn)例如 Vaughan etal.，Nature Biotechnology 1996，14(3) :309_14 禾口 PCT/ US96/10287)，碳水化合物文庫(kù)(見(jiàn)例如 Liang et al.，Science 1996,274 1520-22 ； 美國(guó)專(zhuān)利5，593，853)，和有機(jī)小分子文庫(kù)(見(jiàn)例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Op in Biotechnol. 1995Dec 1 ；6 (6) :624_31 ；類(lèi)異戊二烯(isoprenoids)，美國(guó)專(zhuān)利 5, 569, 588 ； 噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫雜氮雜環(huán)己烷(metathiazanone)，美國(guó)專(zhuān)利 5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)，美國(guó)專(zhuān)利5，525，735和5，519，134 ；嗎啉代化合物，美 國(guó)專(zhuān)利5，506，337 ；苯并二氮卓，5，288，514 ；等)。(iii)噬菌體展示另一種手段是使用重組噬菌體來(lái)產(chǎn)生文庫(kù)。使用“噬菌體方法”(Scott&Smith， Science 1990,249 386-90 ；Cwirla et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ； Devlin et al. , Science 1990，249 :404_6)，可以構(gòu)建非常大的文庫(kù)(例如106-108個(gè)化學(xué) 實(shí)體)。再一種手段主要使用化學(xué)方法，其實(shí)例包括Geysen方法(Geysen et al. ,Molecular Immunology 1986,23 709-15 ；Geysen etal.，J Immunologic Method 1987,102:259-74) 和Fodor 等的方法(Science 1991，251 :767_73)。Furka等(14th International Congress of Biochemistry 1988,Volume#5,Abstract FR 013 ；Furka,Int J Peptide Protein Res 1991,37 487-93)，Houghten(美國(guó)專(zhuān)利 4，631，211)和 Rutter 等(美國(guó)專(zhuān)利 5，010，175) 記載了產(chǎn)生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動(dòng)劑或拮抗劑加以測(cè)試。用于制備組合文庫(kù)的設(shè)備是可商購(gòu)的(見(jiàn)例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, ffoburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA，9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多種組合文庫(kù)本身也是商業(yè)可得 的(見(jiàn)例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,M0, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。PKIB或NAALADL2結(jié)合化合物的篩選在本發(fā)明中，盡管在正常器官中沒(méi)有表達(dá)，但在前列腺癌中檢測(cè)到了 PKIB或 NAALADL2的過(guò)表達(dá)(圖1和2)。因此，使用PKIB或NAALADL2基因、由該基因編碼的蛋白 質(zhì)、或該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，能夠篩選出可改變?cè)摶虻谋磉_(dá)或改變由該基因編碼的多肽 的生物學(xué)活性的化合物。這些化合物可用作治療或預(yù)防前列腺癌的藥物。本發(fā)明提供了篩選可結(jié)合PKIB或NAALADL2的作用劑的方法。因?yàn)镻KIB和 NAALADL2在前列腺癌中表達(dá)，所以與PKIB或NAALADL2結(jié)合的作用劑可用于抑制前列腺癌 細(xì)胞的增殖，從而可用于治療或預(yù)防前列腺癌。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制前列 腺癌細(xì)胞增殖的作用劑的方法，以及使用PKIB或NAALADL2多肽篩選可用于治療或預(yù)防前 列腺癌的作用劑的方法。具體地，該篩選方法的一個(gè)實(shí)施方案包括如下步驟
a)使測(cè)試化合物與由PKIB或NAALADL2多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測(cè)所述多肽與測(cè)試化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇可結(jié)合所述多肽的測(cè)試化合物。本發(fā)明的方法在下文將有更詳細(xì)的記載。用于篩選的PKIB或NAALADL2多肽可以是重組多肽，或者是來(lái)自自然界的蛋白質(zhì)， 或其部分肽。與測(cè)試化合物接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合 的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。作為使用PKIB或NAALADL2多肽來(lái)篩選蛋白質(zhì)，例如與PKIB或NAALADL2多肽結(jié)合 的蛋白質(zhì)的方法，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的許多方法。這樣的篩選可以根據(jù)例如免 疫沉淀方法(例如，按照下文[實(shí)施例1]中“PKIB與PKA-C間的相互作用”)來(lái)進(jìn)行，具體 地說(shuō)以如下所述的方式。將基因插入到用于外源基因的表達(dá)載體(例如pSV2neo、pcDNAI， pcDNA3. 1，pCAGGS和pCD8)內(nèi)，在宿主(例如動(dòng)物)細(xì)胞中表達(dá)編碼PKIB或NAALADL2多 肽的基因。用于表達(dá)的啟動(dòng)子可以是任何能夠通用的啟動(dòng)子，包括例如SV40早期啟動(dòng)子 (Rigby in Williamson (ed. ), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141(1982))，EF-a 啟動(dòng)子(Kim et al.，Gene91 :217_23 (1990) )，CAG 啟動(dòng)子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991))，RSV LTR 啟動(dòng)子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))，SR a 啟動(dòng)子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8 :466 (1988))，CMV 立 即早期啟動(dòng)子(Seed andAruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987))，SV40 晚 期啟動(dòng)子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385_94 (1982))，腺病毒晚期啟動(dòng) 子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 =946(1989)), HSV TK 啟動(dòng)子等。將基因?qū)氲奖?達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞內(nèi)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何方法來(lái)進(jìn)行，例如電 穿孔方法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 15 :1311-26 (1987))，磷酸鈣方法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745_52 (1987))，DEAE 右旋糖酐法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12:5707-17(1984) ；Sussman andMilman, Mol Cell Biol 4:1641-3(1984))， Lipofectin轉(zhuǎn)染法(Deri jard B.，Cell76 :1025_37 (1994) ；Lamb et al. ,Nature Genetics 5 22-30(1993) :Rabindran etal.，Science 259 :230_4(1993))等。對(duì)于由 PKIB 基因或 NAALADL2基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)(表位)導(dǎo)入該多 肽的N或C端，從而將該多肽表達(dá)為包含該表位的融合蛋白?？梢允褂蒙唐坊谋砦籣抗體 系統(tǒng)(Experimental Medicine 13 :85_90 (1995))。可商購(gòu)的載體能夠利用其多克隆位點(diǎn)表 達(dá)與例如半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光蛋白(GFP)形成 的融合蛋白。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通過(guò)導(dǎo)入僅由數(shù)個(gè)到十余個(gè)(a dozen) 氨基酸構(gòu)成的小型表位加以制備，使融合不會(huì)改變PKIB或NAALADL2多肽的性質(zhì)?？梢?使用例如多組氨酸(His-標(biāo)簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標(biāo)簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)簽)、E-標(biāo)簽(多 克隆噬菌體上的表位)等表位，和識(shí)別它們的單克隆抗體作為篩選與PKIB或NAALADL2多 肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細(xì)胞裂解物內(nèi)形成免疫復(fù) 合體。免疫復(fù)合體由PKIB或NAALADL2多肽、具有與該多肽結(jié)合能力的多肽、和抗體組成。 除了使用針對(duì)上述表位的抗體之外，還可以使用針對(duì)PKIB或NAALADL2多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀，這樣的抗體的制備如下文所述。免疫復(fù)合體可以被沉淀，例如當(dāng)抗體是小鼠IgG抗 體時(shí)，可以通過(guò)蛋白A s印harose或蛋白G s印harose將其沉淀。如果將PKIB或NAALADL2 基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結(jié)合這些表位的底 物，例如谷胱甘肽-s印harose 4B,按照與使用針對(duì)PKIB或NAALADL2多肽的抗體的相同的 方式來(lái)形成免疫復(fù)合體。免疫沉淀可以根據(jù)下文所述實(shí)施，或者例如按照文獻(xiàn)中的方法(Harlowand Lane, Antibodies,511-52,Cold Spring Harbor Laboratory publications,NewYork(1988))實(shí) 施。普遍使用SDS-PAGE分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠，可以利用結(jié)合 蛋白的分子量來(lái)分析該蛋白。由于與PKIB或NAALADL2多肽結(jié)合的蛋白難以通過(guò)考馬斯蘭 染色或銀染色等普通染色方法檢測(cè)到，可以通過(guò)如下的方法提高蛋白的檢測(cè)靈敏度在含 有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白，并 檢測(cè)該蛋白。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r(shí)，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并 測(cè)定其序列。作為利用PKIB或NAALADL2多肽來(lái)篩選結(jié)合該多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印跡分析法(Skolnik et al.，Cell 65:83-90(1991))。具體地，PKIB 或 NAALADL2多肽結(jié)合蛋白可以通過(guò)如下方法獲得，從預(yù)期表達(dá)PKIB或NAALADL2多肽的培養(yǎng) 細(xì)胞(例如LNCaP,22Rvl, PC-3DU-145和C4-2B)利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA 文庫(kù)，在LB瓊脂糖上表達(dá)蛋白，將表達(dá)出的蛋白固定在膜上，使純化并且標(biāo)記的PKIB或 NAALADL2多肽與上述膜反應(yīng)，并依照標(biāo)記來(lái)檢測(cè)表達(dá)與PKIB或NAALADL2多肽結(jié)合的蛋 白的噬菌斑。本發(fā)明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結(jié)合，或者利用特異結(jié)合 PKIB或NAALADL2多肽或與PKIB或NAALADL2多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗體，來(lái) 進(jìn)行標(biāo)記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法。或者，在本發(fā)明篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交系 統(tǒng)(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻(xiàn)見(jiàn) “Dalton and Treisman, Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統(tǒng)中，例如，使本發(fā)明的多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵 母細(xì)胞中表達(dá)。從預(yù)期表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，從而使該文 庫(kù)，在被表達(dá)時(shí)，與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后，將cDNA文庫(kù)導(dǎo)入到上述酵母細(xì)胞 中，并從檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆(當(dāng)酵母細(xì)胞表達(dá)可與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白時(shí)，兩者的結(jié)合 可激活報(bào)告基因，使陽(yáng)性克隆可檢測(cè))分離源自該文庫(kù)的cDNA。通過(guò)將上面分離的cDNA導(dǎo) 入到大腸桿菌中并表達(dá)該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報(bào)告基因，除了 HIS3基 因之外，還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、熒光酶基因等。也可以用親和色譜來(lái)篩選與PKIB或NAALADL2基因編碼的多肽結(jié)合的化合物。例 如，可以把本發(fā)明多肽固定在親和柱的載體上，而將含有能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的蛋白的測(cè) 試化合物施加到該柱上。這里的測(cè)試化合物可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。在加 載測(cè)試化合物之后，沖洗柱子，從而可以制備得到結(jié)合于本發(fā)明多肽的化合物。當(dāng)測(cè)試化
31合物是蛋白質(zhì)時(shí)，對(duì)所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行分析，根據(jù)該序列合成寡DNA，并用該寡 DNA作為探針篩選cDNA文庫(kù)，從而獲得編碼該蛋白的DNA。利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以在本發(fā)明中用作檢測(cè)或定量結(jié)合 化合物的裝置。當(dāng)使用這種生物傳感器時(shí)，可以?xún)H使用微量并且沒(méi)有標(biāo)記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等離子體共振信號(hào)的形式對(duì)本發(fā)明多肽與測(cè)試化合物間的相 互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的觀(guān)察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，人們就有可能對(duì)本發(fā)明多肽 與測(cè)試化合物間的結(jié)合進(jìn)行評(píng)估。用于篩選當(dāng)固定的PKIB或NAALADL2多肽暴露于合成化合物或天然底物文庫(kù)或 隨機(jī)噬菌體多肽展示文庫(kù)時(shí)發(fā)生結(jié)合的分子的方法，以及使用基于高通量的組合化學(xué)技 術(shù)(ffrighton et al.，Science 273:458-64(1996) ；Verdine, Nature 384:11-13(1996)； Hogan, Nature 384 :17_9 (1996))，不僅分離與PKIB或NAALADL2蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，而且分 離與PKIB或NAALADL2蛋白結(jié)合化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人 員眾所周知的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法選出的測(cè)試化合物可以作為候選物，用于進(jìn) 一步篩選評(píng)估其治療作用。篩詵可抑制PKIB或NAALADL2牛物活件的化合物在本發(fā)明中，PKIB或NAALADL2蛋白已顯示具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖的活性(圖 3C，4C和6)。而且，PKIB顯示具有PKA-C細(xì)胞核積累活性(圖5D和E)。在本發(fā)明中，所謂 PKA-C細(xì)胞核積累，意思是抑制PKA-C從細(xì)胞核外排或者加速PKA-C轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核。利用 這些生物活性，可以篩選能夠抑制這些蛋白的活性的化合物，該化合物對(duì)于治療或預(yù)防前 列腺癌有用。因此，本發(fā)明還提供了篩選可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的化合物的方法，和篩選 治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法。因此，本發(fā)明提供了使用PKIB或NAALADL2基因表 達(dá)的多肽來(lái)篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟a)使測(cè)試化合物與由PKIB或NAALADL2的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測(cè)步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇與不存在測(cè)試化合物時(shí)所述多肽的生物活性相比，可抑制由PKIB或 NAALADL2多核苷酸編碼的多肽的生物活性的測(cè)試化合物。下文將更詳細(xì)地記載本發(fā)明的方法。任何多肽均可用于篩選，只要它們具有PKIB或NAALADL2蛋白的生物活性即可。例 如，可以使用PKIB或NAALADL2蛋白，也可以使用與這些蛋白功能上等同的多肽。這些多肽 可以由細(xì)胞內(nèi)源或外源表達(dá)。而且，這些生物活性包括PKIB或NAALADL2蛋白的細(xì)胞增殖 活性或PKIB蛋白的PKA-C細(xì)胞核積累活性。通過(guò)本篩選分離的化合物是PKIB或NAALADL2基因編碼多肽的拮抗劑的候選物。 術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指可以通過(guò)結(jié)合多肽而抑制多肽功能的分子。所述術(shù)語(yǔ)還指可降低或抑 制編碼PKIB或NAALADL2的基因的表達(dá)的分子。而且，通過(guò)本篩選分離的化合物是如下化 合物的候選物，所述化合物抑制PKIB或NAALADL2多肽與分子(包括DNA和蛋白)的體內(nèi)
相互作用。當(dāng)本方法中要檢測(cè)的生物活性是細(xì)胞增殖時(shí)，可以通過(guò)例如如下方法進(jìn)行檢測(cè) 制備表達(dá)PKIB或NAALADL2多肽的細(xì)胞，在測(cè)試化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，確定細(xì)胞增殖速度，測(cè)量細(xì)胞周期等，以及通過(guò)測(cè)量集落形成活性，例如圖3C和4C所示?！耙种粕锘钚浴?在本文中定義為，與不存在該化合物時(shí)相比，PKIB或NAALADL2的生物活性?xún)?yōu)選地至少被抑 制10 %，更優(yōu)選地，至少抑制25 %、50 %或75 %，最優(yōu)選地，抑制90 %。當(dāng)待在本方法中檢測(cè)的生物活性是PKA-C細(xì)胞核積累時(shí)，可以通過(guò)例如如下方法 進(jìn)行檢測(cè)，即通過(guò)制備表達(dá)PKIB多肽的細(xì)胞，在測(cè)試化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，并使用免 疫細(xì)胞化學(xué)或western印跡確定細(xì)胞核中PKA-C蛋白的量，例如圖5D和E所示?！耙种粕?活性”在此處定義為，與不存在該化合物時(shí)相比，PKIB的生物活性?xún)?yōu)選地至少被抑制10%， 更優(yōu)選地，至少抑制25 %、50 %或75 %，最優(yōu)選的，被抑制90 %。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法篩選的測(cè)試化合物可以作為候選物，進(jìn)行進(jìn) 一步篩選評(píng)估其治療作用。篩詵可改變PKIB或NAALADL2表汰的化合物在本發(fā)明中，已顯示利用siRNA降低PKIB或NAALADL2的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞增 殖(圖3、4)。因此，本發(fā)明提供了用于篩選可抑制PKIB或NAALADL2表達(dá)的作用劑的方法。 抑制PKIB或NAALADL2表達(dá)的作用劑可用于抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，因此可用于治療或 預(yù)防前列腺癌。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用劑的方法， 以及篩選可用于治療或預(yù)防前列腺癌的作用劑的方法。在本發(fā)明的內(nèi)容中，該篩選可以包 括例如如下步驟a)使侯選化合物與表達(dá)PKIB或NAALADL2的細(xì)胞接觸；和b)選擇與對(duì)照相比降低PKIB或NAALADL2的表達(dá)水平的候選化合物。
本發(fā)明的方法在下文將有更詳細(xì)的記載。表達(dá)PKIB或NAALADL2的細(xì)胞包括，例如，從前列腺癌建立的細(xì)胞系；這些細(xì)胞可 用于上文所述的本發(fā)明的篩選(例如LNCaP、22Rvl、PC-3、DU-145和C4-2B)。表達(dá)水平可以 通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行評(píng)估，例如RT-PCR、Northern印跡測(cè)定、Western 印跡測(cè)定、免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。“表達(dá)水平降低”在本文中定義為，與不存在該化 合物時(shí)相比，PKIB或NAALADL2的表達(dá)水平優(yōu)選地被降低至少10%，更優(yōu)選地，至水平少降 低25%、50%或75%，最優(yōu)選地，水平降低95%。本文的化合物包括化學(xué)化合物(chemical compound)、雙鏈核苷酸等。雙鏈核苷酸的制備如前述的記載。在篩選方法中，降低PKIB或 NAALADL2表達(dá)水平的化合物可以被選擇來(lái)作為用于治療或預(yù)防前列腺癌的候選作用劑?；蛘撸景l(fā)明的篩選方法可包括如下步驟a)使侯選化合物與導(dǎo)入了如下載體的細(xì)胞接觸，該載體包括PKIB或NAALADL2的 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)告基因；b)測(cè)量所述報(bào)告基因的表達(dá)或活性；和c)選擇可降低所述報(bào)告基因表達(dá)或活性的候選化合物。合適的報(bào)告基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，報(bào)告基因是熒光素酶、綠 色熒光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)紅色熒光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT)、lacZ和葡糖苷酸酶(⑶S)，而宿主細(xì)胞是C0S7、HEK293、HeLa等。篩選所需的報(bào) 告構(gòu)建體可以通過(guò)使報(bào)告基因序列與PKIB或NAALADL2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)相連接來(lái)加以制備。 這里，PKIB或NAALADL2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是從起始密碼子到上游至少500bp的區(qū)域，優(yōu)選地是 到上游1000bp，更優(yōu)選地是到上游5000或10000bp的區(qū)域。含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸區(qū)段可以從基因組文庫(kù)分離，或者可以通過(guò)PCR擴(kuò)增。用于鑒定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的方法以及測(cè)定 規(guī)程是眾所周知的(Molecular Cloningthird edition chapter 17，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press) 0將含有所述報(bào)告構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，并通過(guò)本領(lǐng) 域眾所周知的方法(例如使用照度計(jì)(luminometer)、吸收光譜儀、流式細(xì)胞儀等)檢測(cè)報(bào) 告基因的表達(dá)或活性。“表達(dá)或活性降低”在本文中定義為，與不存在該化合物時(shí)相比，報(bào)告 基因的表達(dá)或活性?xún)?yōu)選地被降低至少10%，更優(yōu)選地，至少降低25%、50%或75%，最優(yōu)選 地，降低95%。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法選出的測(cè)試化合物可以作為候選物，用于進(jìn) 一步篩選以評(píng)估其治療作用。篩詵降低PKIB和PKA-C間結(jié)合的化合物在本發(fā)明中，PKIB與PKA-C間的相互作用通過(guò)免疫沉淀顯示(圖5C)。而且，PKA-C 在沒(méi)有PKIB時(shí)從細(xì)胞核外排到細(xì)胞質(zhì)中(圖5D)。本發(fā)明提供了用于篩選可抑制PKIB和 PKA-C間結(jié)合的化合物的方法?？梢种芇KIB和PKA-C間結(jié)合的化合物可用于抑制前列腺癌 細(xì)胞的增殖，從而可用于治療或預(yù)防前列腺癌。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制前列 腺癌細(xì)胞增殖的化合物的方法，和用于篩選可用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法。更具體地，該方法包括如下步驟a)在測(cè)試化合物的存在下，使PKIB多肽或其功能等價(jià)物與PKA-C多肽或其功能等 價(jià)物接觸；b)檢測(cè)多肽間的結(jié)合；和c)選擇可抑制多肽間結(jié)合的測(cè)試化合物。這里，"PKIB多肽的功能等價(jià)物”是指包含PKA-C結(jié)合域氨基酸序列；假底物基序 (RRNA :SEQ ID NO 31)的多肽。類(lèi)似地，“PKA-C多肽的功能等價(jià)物”是指包含PKIB結(jié)合域 氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的方法將在下文有更詳細(xì)的記載。作為篩選可抑制PKIB和PKA-C間結(jié)合的化合物的方法，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人 員眾所周知的許多方法。這些篩選可以作為體外測(cè)定系統(tǒng)來(lái)實(shí)施。更具體地說(shuō)，首先，使 PKIB或PKA-C多肽與支持物結(jié)合，將另一多肽與測(cè)試化合物一起施加。接著，溫育混合物， 清洗，并檢測(cè)和/或測(cè)量與支持物結(jié)合的另一多肽。潛在的候選化合物能夠降低另一多肽 的檢測(cè)量(reduce the amount of detecting the other polypeptide)。這里，PKIB 或 PKA-C多肽不僅可以制備成天然蛋白質(zhì)，還可以作為通過(guò)基因重組技術(shù)制備的重組蛋白加 以制備。天然蛋白可以通過(guò)例如親和色譜制備。另一方面，重組蛋白的制備可以通過(guò)培養(yǎng) 用編碼PKA-C的DNA轉(zhuǎn)化的從而在其中表達(dá)該蛋白的細(xì)胞，然后回收該重組蛋白?？捎糜诮Y(jié)合蛋白的支持物的實(shí)例包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和右旋糖 酐；和合成樹(shù)脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅橡膠(silicon)；優(yōu)選地，使用由上述材料 制備的可商購(gòu)的珠子和板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當(dāng)使用珠子時(shí)，可以將它們 填充到柱中?；蛘?，磁珠的使用也是本領(lǐng)域已知的，借助磁珠能夠容易地通過(guò)磁性分離珠子 上結(jié)合的蛋白。蛋白與支持物的結(jié)合可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，例如化學(xué)鍵合和物理吸附?；蛘撸?白可以通過(guò)特異識(shí)別該蛋白的抗體與支持物結(jié)合。而且，蛋白與支持物的結(jié)合也可以通過(guò)
34抗生物素蛋白和生物素進(jìn)行。蛋白間的結(jié)合在緩沖液中進(jìn)行，緩沖液例如但不僅限于，磷酸 鹽緩沖液和Tris緩沖液，只要該緩沖液不抑制蛋白間的結(jié)合即可。在本發(fā)明中，利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測(cè)或定量結(jié)合蛋 白的裝置。當(dāng)使用這種生物傳感器時(shí)，蛋白間的相互作用可以作為表面等離子體共振信號(hào) 得以實(shí)時(shí)地觀(guān)察，僅使用微量的多肽，并且無(wú)需標(biāo)記(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，使 用生物傳感器例如BIAcore來(lái)評(píng)估PKA-C和PKIB間的結(jié)合是有可能的?；蛘?，可以標(biāo)記PKA-C或PKIB，利用多肽的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)或測(cè)量結(jié)合活性。具體地， 預(yù)標(biāo)記其中一個(gè)多肽，然后使標(biāo)記的多肽在測(cè)試化合物的存在下與另一多肽接觸，經(jīng)過(guò)清 洗后，根據(jù)標(biāo)記檢測(cè)或測(cè)量結(jié)合的多肽?？捎糜谠诒景l(fā)明中標(biāo)記蛋白的標(biāo)記物質(zhì)有例如放 射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物 酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶)、熒光底物(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、若丹明) 和生物素/抗生物素蛋白。當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記蛋白時(shí)，可以借助液體閃爍進(jìn)行檢測(cè)或 測(cè)量。或者，對(duì)于用酶標(biāo)記的蛋白，可以添加酶的底物，使用吸收測(cè)定儀檢測(cè)底物的變化，例 如顏色的產(chǎn)生，來(lái)檢測(cè)或測(cè)量。此外，當(dāng)使用熒光底物作為標(biāo)記時(shí)，用熒光光度計(jì)檢測(cè)或測(cè) 量結(jié)合蛋白。而且，PKA-C和PKIB間的結(jié)合還可以用針對(duì)PKA-C或PKIB的抗體進(jìn)行檢測(cè)或測(cè) 量。例如，使固定在支持物上的PKA-C多肽與測(cè)試化合物和PKIB接觸，然后溫育并清洗混 合物，然后可以用針對(duì)PKIB的抗體進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量?；蛘?，可以將PKIB固定在支持物上， 而使用針對(duì)PKA-C的抗體作為抗體。當(dāng)在本篩選中使用抗體時(shí)，抗體優(yōu)選地用上述標(biāo)記物 質(zhì)的其中一種加以標(biāo)記，并根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量。或者，可以用針對(duì)PKA-C或PKIB 的抗體作為第一抗體，用標(biāo)記底物標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行檢測(cè)。而且，在本發(fā)明篩選中與蛋白 結(jié)合的抗體可以用蛋白G或蛋白A柱進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)量?；蛘?，在本發(fā)明篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交系 統(tǒng)(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻(xiàn)見(jiàn) “Dalton and Treisman, Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統(tǒng)中，例如，使PKA-C多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母 細(xì)胞中表達(dá)。使能結(jié)合PKA-C多肽的PKIB多肽與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合，在測(cè)試化 合物的存在下，也在酵母細(xì)胞中表達(dá)?；蛘?，可以使PKIB多肽和SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū) 融合，而使PKA-C多肽與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。兩者的結(jié)合可激活報(bào)告基因，使陽(yáng) 性克隆可檢測(cè)。作為報(bào)告基因，除了 HIS3基因之夕卜，還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、 CAT基因、熒光素酶基因等。而且，本發(fā)明的篩選方法是檢測(cè)PKA-C的細(xì)胞核定位，因?yàn)镻KA-C在PKIB的存在 下定位于細(xì)胞核，而在沒(méi)有PKIB時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)。例如，使表達(dá)PKA-C和PKIB的細(xì)胞均與 測(cè)試化合物接觸并清洗。細(xì)胞用例如70%乙醇或4%多聚甲醛固定，并用抗PKA-C抗體檢 測(cè)。當(dāng)PKA-C基本上在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被檢測(cè)到時(shí)，使用測(cè)試化合物預(yù)防前列腺癌。這里，可通過(guò) 本領(lǐng)域眾所周知的方法在細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)(force-expressed)PKA-C和PKIB。因此，使表 達(dá)PKA-C和PKIB細(xì)胞均與測(cè)試化合物接觸，并通過(guò)眾所周知的方法制備細(xì)胞的細(xì)胞核提取物(例如使用 Merck Bioscience 生產(chǎn)的 SubcellularProteoExtract Kit(S-PEK))。用 western印跡測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞核提取物中PKA-C的量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法選出的測(cè)試化合物可以作為候選物，用于進(jìn) 一步評(píng)價(jià)其治療作用。也就是說(shuō)，上述篩選方法還包括如下步驟d)使步驟c)選出的侯選化合物與表達(dá)PKIB和PKA-C的細(xì)胞接觸；和e)選擇與不存在該侯選化合物時(shí)檢測(cè)到的表達(dá)水平相比，可降低Akt磷酸化水平 的侯選化合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的Akt磷酸化檢測(cè)方法。例如，可以使用在下 文實(shí)施例部分記載的western印跡分析。更具體地，在473位絲氨酸殘基處檢測(cè)Akt (SEQ ID NO 35)的磷酸化水平。篩詵可通過(guò)抑制PKIB功能降低Akt磷酸化的化合物在本發(fā)明中，Akt磷酸化被PKIB siRNA降低(圖7A)。而且，Akt磷酸化被PKIB和 /或PKA-C的過(guò)表達(dá)所提高(圖7B和C)。本發(fā)明提供了篩選可抑制PKIB和PKA-C間結(jié)合 的化合物的方法。Akt磷酸化很可能在HRPC進(jìn)展和其惡性表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Sellers， ff. R. &Sawyers, C. L. (2002)inSomatic Genetics of Prostate Cancer Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantoff,P. (Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia),Wang Y,Kreisberg JI,Ghosh PM. ,Curr Cancer Drug Targets. 2007Sep ；7(6) :591_604,Lin HK, Yeh S，Kang HY,Chang C,Proc Natl Acad Sci U S A 2001 ；98 (13) :7200-5，F(xiàn)eldman BJ, Feldman D, Nat Rev Cancer 2001 ；1(1) 34-45, Malik SN,Brattain M, Ghosh PM,Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI.，Clin Cancer Res. 2002 ；8 (4) :1168_71)，因此 我們預(yù)期，可通過(guò)抑制PKIB功能而降低Akt磷酸化的化合物可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增 殖，從而可用于治療或預(yù)防前列腺癌。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制前列腺癌細(xì)胞 增殖的化合物的方法，和用于篩選可用于治療或預(yù)防前列腺癌，優(yōu)選地HRPC，的化合物的方 法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明包括如下步驟a)使候選化合物與表達(dá)PKIB和PKA-C的細(xì)胞接觸；和b)選擇與不存在該侯選化合物時(shí)檢測(cè)到的表達(dá)水平相比，可降低Akt磷酸化水平 的候選化合物?；蛘?，通過(guò)本發(fā)明可以鑒定適于治療和/或預(yù)防前列腺癌的侯選化合物。這樣的 方法包括如下步驟a)在測(cè)試化合物的存在下，在適于PKIB磷酸化Akt的條件下，將PKIB或其功能等 價(jià)物與Akt與PKA-C或其功能等價(jià)物一起溫育，其中Akt是從下組中選出的多肽i.包含氨基酸序列SEQ ID NO 35 (Akt)的多肽；ii.包含氨基酸序列SEQ ID NO 35且其中替換、刪除或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸 的多肽，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO :35組成的多肽等價(jià)的生物活性；iii.由在嚴(yán)格條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO :36組成的多核苷酸雜交的多核 苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO :35組成的多肽等價(jià)的生物 活性；b)檢測(cè)Akt的磷酸化水平；
c)比較在步驟b)中測(cè)得的Akt磷酸化水平與對(duì)照水平；和d)選擇與對(duì)照水平相比，可降低Akt磷酸化水平的化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法選出的測(cè)試化合物可以作為候選物，用于進(jìn) 一步篩選評(píng)價(jià)其治療作用。優(yōu)選地，Akt的磷酸化水平可以在氨基酸序列SEQ ID NO 35的473位絲氨酸殘基 或該多肽的同源位置進(jìn)行檢測(cè)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員周知的Akt磷酸化檢測(cè)方法。例 如，可以使用在下文實(shí)施例部分記載的western印跡分析。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，適于PKIB磷酸化Akt的條件可以通過(guò)在磷酸供體例如ATP的 存在下溫育Akt和PKIB及PKA-C來(lái)提供。適于PKIB磷酸化Akt的條件還包括培養(yǎng)表達(dá) PKIB、PKA-C和多肽的細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞可以是攜帶有包含編碼該多肽的多核苷酸的表 達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在溫育之后，可以用識(shí)別磷酸化Akt的抗體檢測(cè)Akt的磷酸化水平。在檢測(cè)磷酸化Akt之前，可以將Akt與其它成分或Akt表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞裂解物分 離。例如，可利用凝膠電泳將Akt與其余組分分離?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)使Akt與具有抗Akt抗 體的載體接觸來(lái)捕獲Akt。當(dāng)使用標(biāo)記的磷酸供體時(shí)，可以通過(guò)追蹤該標(biāo)記來(lái)檢測(cè)Akt的 磷酸化水平。例如，當(dāng)放射性標(biāo)記的ATP (例如32P-ATP)用作磷酸供體時(shí)，分離的Akt的放 射活性與Akt的磷酸化水平相關(guān)?；蛘?，可以使用特異識(shí)別磷酸化Akt而不識(shí)別非磷酸化 Akt的抗體來(lái)檢測(cè)磷酸化Akt。優(yōu)選地，所述抗體識(shí)別在Ser-473殘基處磷酸化的Akt。用于制備與給定蛋白功能上等價(jià)的多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包 括在蛋白中導(dǎo)入突變的已知方法。一般地說(shuō)，已知蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不 會(huì)影響蛋白的功能(Mark DF et al. , Proc Natl AcadSci USA 1984,81 5662-6 ；Zoller MJ&Smith M,Nucleic Acids Res 1982，10 :6487_500 ；Wang A et al.，Science 1984，224 1431-3 ；Dalbadie-McFarland G etal. ,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。實(shí) 際上，突變的或經(jīng)過(guò)修飾的蛋白，具有通過(guò)在特定氨基酸序列中替換、刪除、插入和/或添 加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾的氨基酸序列的蛋白，已知可以保留原始的生物活性 (Mark et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 81 5662-6 (1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc NatlAcad Sci USA 79:6409-13(1982))。由此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行個(gè)別添加、 刪除、插入或替換以改變單個(gè)氨基酸或少數(shù)氨基酸，或者被認(rèn)為是“保守修飾”的那些修 飾一其中蛋白質(zhì)的改變的結(jié)果是產(chǎn)生具有相似功能的蛋白，這些都是本發(fā)明所預(yù)期的。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠通過(guò)在A(yíng)kt、PKA_C或PKIB中的任一個(gè)內(nèi)導(dǎo)入合適的 突變來(lái)制備與這些蛋白功能上等價(jià)的多肽，例如使用定點(diǎn)誘變(Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152:271-5(1995) ；Zoller and Smith,MethodsEnzymol 100:468-500(1983) ；Kramer et al. , Nucleic Acids Res. 12 :9441_56(1984) ；Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154:350-67(1987) ；Kunkel, ProcNatl Acad Sci USA 82:488-92(1985) ；Kunkel TA, et al.，Methods Enzymol. 1991 ；204 :125_39.)。本發(fā)明的多肽包括這樣的多肽，其具有Akt、 PKA-C或PKIB的氨基酸序列，且其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被突變，其中所得的突變多肽分別 與Akt、PKA-C或PKIB的功能等價(jià)。只要保留蛋白的活性，氨基酸突變的數(shù)目沒(méi)有具體限 制。然而，一般優(yōu)選地改變氨基酸序列的5%或者更少。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，在這樣的 變體中要突變的氨基酸的數(shù)目一般為30個(gè)氨基酸或者更少，典型地20個(gè)氨基酸或者更少，更典型地10個(gè)氨基酸或者更少，優(yōu)選地5-6個(gè)氨基酸或者更少，更優(yōu)選地1-3個(gè)氨基酸。要突變的氨基酸殘基優(yōu)選地被突變成氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)保守的不同氨基酸(這個(gè) 過(guò)程稱(chēng)作保守氨基酸替換)。氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)的實(shí)例包括疏水氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W， Y, V)，親水氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)，和具有如下共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈月旨 肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈 (D，N, E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳香基側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。注意，圓括號(hào)內(nèi)的字母指示 氨基酸的單字母編碼。而且，提供功能相似氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域眾所周知的。例 如，下面8組中每一組含有的氨基酸彼此之間是保守替換1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴(lài)氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(見(jiàn)例如 Creighton，Proteins 1984) 這樣的保守修飾的多肽包含在本Akt、PKA_C或PKIB蛋白內(nèi)。然而，本發(fā)明不僅限 于此，Akt、PKA-C和PKIB蛋白包含非保守修飾，只要保留原始蛋白的結(jié)合活性即可。而且， 修飾蛋白不排除多態(tài)變異體、種間同源物和由這些蛋白的等位基因編碼的蛋白。向Akt、PKA-C或PKIB氨基酸序列添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的多肽的實(shí)例是 分別含有Akt、PKA-C或PKIB的融合蛋白。因此，本發(fā)明包括Akt、PKA-C或PKIB與其它肽 或蛋白的融合蛋白，也就是融合物。融合蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)加 以制備，例如使編碼Akt、PKA-C或PKIB的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA相連，并使閱讀 框匹配，將融合DNA插入到表達(dá)載體內(nèi)，并在宿主中表達(dá)它。與本發(fā)明蛋白融合的肽或蛋白 沒(méi)有限制?？捎米髋cAkt、PKA_C或PKIB蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，F(xiàn)LAG(Hopp TP et al.，Biotechnology 19886 1204-10)，含 6 個(gè) His (組氨酸)殘基的 6xHis，lOxHis，流感凝 集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，pl8HIV片段，T7-標(biāo)簽，HSV-標(biāo)簽，E-標(biāo)簽，SV40T 抗原片段，lck標(biāo)簽，a -微管蛋白片段，B-標(biāo)簽，蛋白C片段等?？梢院捅景l(fā)明蛋白融合的 蛋白的實(shí)例包括GST(谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、半 乳糖苷酶、MBP (麥芽糖結(jié)合蛋白)等。融合蛋白的制備可以通過(guò)使編碼上面討論的融合肽或蛋白的商業(yè)可得DNA與編 碼Akt、PKA-C或PKIB蛋白的DNA融合，并表達(dá)所制備的融合DNA。另一種本領(lǐng)域已知可分離功能等價(jià)多肽的方法涉及，例如，雜交技術(shù)(Sambrook et al. ,Molecular Cloning 2nd ed. 9. 47-9. 58,Cold Spring Harbor Lab. Press(1989))。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地從分離的DNA分離與Akt (即SEQ ID NO 36) .PKA-C或PKIB 具有高同源性的DNA，并從所述分離的DNA分離出與Akt、PKA-C或PKIB功能上等價(jià)的多肽。 本發(fā)明的蛋白包括由與編碼Akt、PKA-C或PKIB的DNA序列的全部或一部分雜交的DNA編 碼，并且與Akt、PKA-C或PKIB功能上等價(jià)的蛋白。這些多肽包括對(duì)應(yīng)于人源蛋白的哺乳動(dòng)CN 物同源體(例如由猴、大鼠、家兔和?；蚓幋a的多肽)。在從動(dòng)物分離與編碼Akt、PKA_C 或PKIB的DNA高度同源的DNA時(shí)，特別優(yōu)選地使用前列腺癌組織。用于分離編碼與人Akt、PKA-C或PKIB蛋白功能上等價(jià)的蛋白的DNA的雜交條件 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地加以選擇。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在 該條件下核酸分子與其靶序列雜交，典型地在核酸復(fù)合體混合物中，但檢測(cè)不到與其它序 列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴(lài)的，并且在不同環(huán)境下會(huì)不同。序列越長(zhǎng)，特異雜交的溫度 越高。Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy Of nucleic acid assays" (1993)提供了關(guān)于核酸雜交的詳細(xì)指導(dǎo)。在本發(fā)明的語(yǔ)境中， 合適的雜交條件可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)地加以選擇。一般地說(shuō)，嚴(yán)格條件被選擇為在限定的離子強(qiáng)度pH下，比特定序列的熔點(diǎn)(TJ低 大約5-10°C。Tffl是如下的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)，其中50%的與靶分 子互補(bǔ)的探針在平衡狀態(tài)下與靶序列雜交(因?yàn)榘行蛄羞^(guò)量存在，所以在Tm下，在平衡時(shí) 50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件還可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了選 擇性或特異性的雜交，陽(yáng)性信號(hào)優(yōu)選地至少是背景的兩倍，更優(yōu)選地是背景雜交的10倍。示例性的嚴(yán)格雜交條件包括如下50%甲酰胺、5x SSC、和SDS，在42°C溫育， 或5x SSC、1% SDS、在65°C溫育，用0. 2x SSC和0. 1 % SDS在50°C下清洗。合適的雜交條 件還可以包括使用“快速雜交緩沖液(Rapid-hyb buffer) " (Amersham LIFE SCIENCE)在 68°C預(yù)雜交30分鐘或者更長(zhǎng)時(shí)間，添加標(biāo)記的探針，在68°C溫育lh或更長(zhǎng)時(shí)間。清洗步驟可以在例如低嚴(yán)格條件下進(jìn)行。因此，示例性的低嚴(yán)格條件可以包括例 如42°C、2x SSC、0. 1% SDS、或優(yōu)選地50°C、2x SSC、0. 1% SDS?；蛘撸纠缘母邍?yán)格條件 包括例如在室溫下用2x SSC、0. 01% SDS清洗三次各20分鐘，然后在37°C用lx SSC、0. 1% SDS清洗三次各20分鐘，和在50°C下用lx SSC、0. 1% SDS清洗兩次各20分鐘。然而，多種 因素，例如溫度和鹽濃度，會(huì)影響雜交的嚴(yán)格度，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠合適地選擇可實(shí)現(xiàn) 所需嚴(yán)格度的因素。優(yōu)選地，功能上等價(jià)多肽的氨基酸序列與本文公開(kāi)的天然Akt、PKA_C或PKIB序列 具有至少大約80%的同源性(也稱(chēng)作序列同一性)，更優(yōu)選地，至少大約85%、90%、95%、 96%、97%、98%、或99%同源性。多肽的同源性可以通過(guò)如下文獻(xiàn)中的算法加以確定 "Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80 :726_30 (1983) ”。在其它實(shí)施方案中，功 能上等價(jià)多肽可以由在嚴(yán)格條件下(如下文定義)與編碼這種功能上等價(jià)多肽的多核苷酸 雜交的多核苷酸編碼。除了雜交，可以使用基因擴(kuò)增方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，使用根據(jù) Akt或PKIB的序列信息合成的引物分離編碼與Akt、PKA-C或PKIB功能上等價(jià)的多肽的 DNA。可用于本發(fā)明語(yǔ)境下的Akt、PKA-C或PKIB功能上等價(jià)物在氨基酸序列、分子量、 等電點(diǎn)、是否存在糖鏈或形式方面可以有不同，這取決于用于產(chǎn)生它的細(xì)胞或宿主或者所 使用的純化方法。然而，只要它是Akt、PKA-C或PKIB多肽的功能上等價(jià)物，就包含在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。篩選與NAALADL2結(jié)合的抗體
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NAALADL2是一種新的II型膜蛋白，屬于谷氨酸羧肽酶II (GCPII)家族。著名的 前列腺癌標(biāo)記一前列腺特異膜抗原(PSMA)，也屬于GCPII家族(Rajasekaran AK et al.， Am J Physiol Cell Physiol 2005288 :C975_81.禾口Murphy GP et al. ,Prostate 200042 145-9.)。NAALADL2顯示與PSMA同源，具有一個(gè)跨膜區(qū)，并定位在細(xì)胞質(zhì)膜上(圖5B)。 PSMA是一種FDA批準(zhǔn)的前列腺癌顯像劑一mIn標(biāo)記的7E11單克隆抗體(Prostascint， Cytogen, Princeton, NJ)的靶標(biāo)，而且PSMA被單克隆抗體如J591靶定，J591在接受臨 床試驗(yàn)，用于將顯像劑或治療劑特異遞送到PSMA表達(dá)細(xì)胞(Murphy GP etal.，Prostate 200042 145-9.和 Holmes EH, Expert Op in Investig Drugs 200110 :511_9.)。因此，利用 NAALADL2在細(xì)胞表面的結(jié)合能力作為指征進(jìn)行篩選，可以鑒定用于診斷或預(yù)防前列腺癌的 抗NAALADL2抗體。該篩選方法的一個(gè)實(shí)施方案包括如下步驟a)使候選抗體與表達(dá)NAALADL2的細(xì)胞接觸；b)選擇可結(jié)合細(xì)胞表面上的NAALADL2的測(cè)試抗體。本發(fā)明的方法在下文將有更詳細(xì)的記載?；蛘?，NAALADL2的推定胞外域是SEQ ID NO :32。因此，篩選在細(xì)胞外與NAALADL2 結(jié)合的抗體的方法包括如下步驟a)使候選抗體與包含SEQ ID NO 32的多肽接觸；b)選擇與該多肽結(jié)合的測(cè)試抗體。通過(guò)檢測(cè)NAALADL2表達(dá)細(xì)胞(例如前列腺癌細(xì)胞)的親和性來(lái)選擇抗體或抗體 片段或非抗體結(jié)合蛋白(在下文中描述)。通過(guò)用含有3%BSA的PBS在室溫下處理30分 鐘，封閉與這些細(xì)胞的非特異結(jié)合。將細(xì)胞在室溫下與候選抗體或抗體片段溫育60分鐘。 用PBS清洗后，細(xì)胞在室溫下用FITC偶聯(lián)的第二抗體染色60分鐘，并用熒光計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。 或者，可以使用利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器作為檢測(cè)或定量本發(fā)明中抗體或 抗體片段的裝置。在本發(fā)明中，選擇能夠檢測(cè)細(xì)胞表面上的NAALADL2肽的抗體或抗體片 段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法選出的測(cè)試化合物可以作為候選物，用于進(jìn) 一步篩選評(píng)估其治療作用?？贵w 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”意圖包括可以和指定蛋白或其片段特異反應(yīng)的免疫 球蛋白或其片段。抗體可以包括人抗體、靈長(zhǎng)源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異 性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標(biāo)記融合的抗體和抗體片段。而且，本文中，抗體 使用其最廣泛的意義，具體地涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個(gè)完整抗體形成 的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示期望的生物學(xué)活性即可。 “抗體”指示所有類(lèi)型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。本發(fā)明使用針對(duì)PKIB或NAALADL2的抗體。更優(yōu)選地說(shuō)，可以使用針對(duì)包含氨基 酸序列SEQ ID NO :33或34的蛋白的抗體作為針對(duì)PKIB的抗體，并且可以使用針對(duì)包含氨 基酸序列SEQ ID N0:32的蛋白的抗體作為針對(duì)NAALADL2的抗體。這些抗體將通過(guò)已知的 方法提供。本文描述了用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的示例技術(shù)。(i)多克隆抗體單克隆抗體優(yōu)選地通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生?？梢允褂秒p功能或衍生化試劑將相關(guān)抗原與在待免疫物種體內(nèi)具有免疫原性的 蛋白相偶聯(lián)，所述具有免疫原性的蛋白例如鑰孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或 大豆胰蛋白酶抑制劑，雙功能或衍生試劑例如馬來(lái)酰亞胺苯甲酸硫代丁二酰亞胺酯(malei midobenzoylsulfosuccinimide ester)(通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N_羥基琥珀酰亞胺(通 過(guò)賴(lài)氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12或R' N = C = NR，其中R和R’是不同的烷基。用該抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物是通過(guò)，例如，組合100 ii g或5 ii g 蛋白或偶聯(lián)物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑，并在皮內(nèi)多點(diǎn)注射該 溶液。一個(gè)月后，用1/5-1/10原始量的肽或偶聯(lián)物與弗氏完全佐劑多點(diǎn)皮下注射來(lái)對(duì)動(dòng)物 加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行采血，并測(cè)定血清的抗體滴度。加強(qiáng)免疫動(dòng)物，直至滴度 達(dá)到高平臺(tái)。優(yōu)選地是，用于對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫的是相同抗原的偶聯(lián)物，但與不同的蛋白 偶聯(lián)和/或通過(guò)不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)。偶聯(lián)物還可以在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白融合物制備。另外，可以適當(dāng)?shù)厥褂?凝集劑，例如明礬，來(lái)提高免疫響應(yīng)。(ii)單克隆抗體單克隆抗體從基本上均質(zhì)的抗體構(gòu)成的群體獲得，即構(gòu)成該群體的單個(gè)抗體是 相同的，只是可能存在少量的天然發(fā)生的突變。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”是指抗體不是離散 (discrete)抗體的混合物這一特征。例如，單克隆抗體可以用雜交瘤方法制備，該方法首先在Kohler et al. ,Nature, 256:495(1975)中被記載，或者可以通過(guò)重組DNA方法制備(U. S. Patent No. 4，816，567)。在雜交瘤方法中，小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，例如倉(cāng)鼠，被如上文所述地免疫， 從而引發(fā)出淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或者能夠產(chǎn)生特異結(jié)合用來(lái)進(jìn)行免疫的蛋白的抗 體?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，用合適的融合劑，例如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞 與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press,1986))。將這樣制備的雜交瘤細(xì)胞接種并生長(zhǎng)于合適的培養(yǎng)基中，其優(yōu)選地含有一種或多 種可抑制未融合的母骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果母骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌 呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HRPT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型地可包含次黃嘌呤、氨甲 喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)可阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞具有如下特征融合效率高，支持所選抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定高水 平產(chǎn)生抗體，并且對(duì)某種培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓 瘤細(xì)胞系，例如從可以從Salk研究所細(xì)胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego), California USA 獲得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤和可以從美國(guó) HMJtlf^f^^^^ (American Type Culture Collection), Manassas, Virginia, USA ^t 得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞衍生的細(xì)胞系。人骨髓瘤和小鼠_人異源骨髓瘤細(xì)胞系也 有報(bào)道用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol.，133 3001(1984) ；Brodeur et al.， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc.，New York,1987))。對(duì)培養(yǎng)著雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基，測(cè)定其中針對(duì)抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地， 由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)加以確定，例如放射免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。單克隆抗體的結(jié)合親和性可以通過(guò)例如Munson et al.，Anal. Biochem.，107 220(1980)的30Scatchard分析加以確定。在鑒定出可產(chǎn)生具有期望特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞之 后，可以通過(guò)有限稀釋程序?qū)寺∵M(jìn)行亞克隆，并通過(guò)常規(guī)方法來(lái)培育它們(Goding， Monoclonal Antibodies Principles and Practice,pp. 59-103(Academic Press,1986))。 用于此目的的合適培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPML-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以在 體內(nèi)作為動(dòng)物體內(nèi)的腹水瘤培育。通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化程序，例如蛋白A-s印harose凝膠、羥基磷灰石色譜、 凝膠電泳、透析或親和色譜，合適地將由亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水液或血清 分離。編碼單克隆抗體的DNA可以用傳統(tǒng)方法(例如通過(guò)使用能夠特異結(jié)合編碼鼠源抗 體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地加以分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞是這類(lèi)DNA的 優(yōu)選來(lái)源。一旦分離了 DNA，即可將DNA置于表達(dá)載體內(nèi)，然后將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，例如 大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞，或骨髓瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞本身不會(huì)產(chǎn) 生免疫球蛋白，從而在重組宿主細(xì)胞內(nèi)合成單克隆抗體。關(guān)于在細(xì)菌體內(nèi)重組表達(dá)編碼抗 體的 DNA 的綜述文獻(xiàn)見(jiàn) Skerra et al.，Curr. Opinion in Immunol.，5 :256_262 (1993)和 Pluckthun, Immunol. Revs.，130 :151—188(1992)。另一種產(chǎn)生與PKIB或NAALADL2特異反應(yīng)的抗體或抗體片段的方法，是用PKIB或 NAALADL2蛋白或肽對(duì)在細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)的、編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩 選。更優(yōu)選地，可以使用包含氨基酸序列SEQ ID NO :33或34的PKIB片段作為PKIB的替 代物，可以使用包含氨基酸序列SEQ ID N0:32的NAALADL2片段作為NAALADL2的替代物。 例如，可以用噬菌體表達(dá)文庫(kù)，在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)完整的Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)。見(jiàn)例如Ward et al. , Nature 341:544-546(1989) ；Huse et al.，Science 246 1275-1281(1989)；和 McCafferty et al.，Nature 348 :552_554 (1990)。用例如 PKIB肽、包含氨基酸序列 SEQ ID NO 33或34的PKIB片段、NAALADL2肽或包含氨基酸序列SEQ ID NO 32的NAALADL2片段 篩選這些文庫(kù)，能夠鑒定出與PKIB、PKIB片段、NAALADL2或NAALADL2片段反應(yīng)的免疫球蛋 白片段?；蛘?，可以使用SCID-hu小鼠(可以從Genpharm獲得)產(chǎn)生抗體或其片段。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體或抗體片段可以從抗體噬菌體文庫(kù)分離，抗體噬菌 體文庫(kù)用 McCafferty et al. , Nature, 348 :552_554 (1990)中記載的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。Clackson et al. ， Nature,352 :624_628(1991)和 Marks et al. ， J MoLBioL，222 :581_597(1991) 分別記載了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠源和人源抗體。隨后出版物記載了通過(guò)鏈重排產(chǎn)生高 親和性(nM 范圍)的人抗體(Marks et al.，BiolTechnology, 10 :779_783 (1992))，以及 使用組合感染(combinatorialinfection)和體內(nèi)重組作為構(gòu)建超大噬菌體文庫(kù)的策略 (ffaterhouse et al.，Nuc. Acids. Res. ,21 :2265_2266 (1993))。因此，這些技術(shù)都是傳統(tǒng)的 單克隆抗體雜交瘤法分離單克隆抗體的切實(shí)可行的替代方式。DNA還可以例如以下述方式進(jìn)行修飾針對(duì)編碼序列，用人重鏈和輕鏈恒定域替 換同源的鼠源序列(美國(guó)專(zhuān)利 4，816，567 ;Morrison，et al. , Proc. Natl Acad. ScL USA, 81 :6851 (1984))，或者將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分與免疫球蛋白的編碼序列共價(jià)連接。典型地，用這些非免疫球蛋白多肽替換抗體的恒定域，或者用它們替換抗體的一 個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域而生成嵌合二價(jià)抗體，其包含一個(gè)對(duì)抗原特異的抗原結(jié)合位點(diǎn)， 和另一個(gè)對(duì)不同抗原特異的抗原結(jié)合位點(diǎn)。(iii)人源化抗體用于將非人抗體人源化的方法在本領(lǐng)域中已有記載。優(yōu)選地，人源化抗體中 導(dǎo)入了一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基經(jīng)常稱(chēng)作“輸入 (import)，，殘基，通常取自某個(gè)“輸入”可變域。人源化可以基本上按照Winter及其合 作者的方法(Jones et al.，Nature, 321 :522_525 (1986) ； Reichmann et al.，Nature, 332:323-327(1988) ；Verhoeyen et al.，Science, 239 1534-1536 (1988))來(lái)進(jìn)行，用 高變區(qū)序列替換人抗體的相應(yīng)序列。因此，這些“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，816，567)，其中完整人可變區(qū)的一小部分(substantially less than intact)被來(lái) 自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體典型的是人抗體中一些高變區(qū)殘基 (可能還有一些FR殘基)被來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體中類(lèi)似位置上的殘基替代而得到的抗體。用于制造人源化抗體的人可變區(qū)，包括輕鏈和重鏈，的選擇對(duì)于減少抗原性是 非常重要的。根據(jù)所謂的“最佳匹配(best-fit)”方法，用嚙齒動(dòng)物抗體的可變域的序 列來(lái)篩選整個(gè)已知人可變區(qū)序列文庫(kù)。然后，選擇與嚙齒動(dòng)物序列最接近的人序列作為 用于人源化抗體的人框架區(qū)(FR) (Suns et al.，J. Immunol.，151 =2296(1993) ；Chothia et al.，J.Mol.Biol，196 :901(1987))。另一種方法使用來(lái)源于輕鏈或重鏈特定亞群中的 所有人抗體之共有序列的特定框架區(qū)。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285 (1992) ；Presta et al. , J. Immunol. , 151 2623(1993))。此外，人源化的抗體保留對(duì)抗原的高親和性和其它有利的生物學(xué)性質(zhì)是重要的。 為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，根據(jù)優(yōu)選的方法，人源化抗體的制備借助下述過(guò)程使用親本和人源化 序列的三維模型來(lái)分析親本序列和各種理論上的人源化產(chǎn)物。三維免疫球蛋白模型是常 用的，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉它們。有可用的計(jì)算機(jī)程序來(lái)圖解和顯示選定的候選免 疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)型結(jié)構(gòu)。通過(guò)檢查這些顯示結(jié)果，人們可以分析殘基在候選免 疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析殘基是否影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能 力。這樣，可以選擇FR殘基，并與受體序列和輸入序列組合，從而獲得期望的抗體特性，例 如增加對(duì)靶抗原的親和性。一般地說(shuō)，高變區(qū)殘基直接而且最實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原的結(jié)合。(iv)人抗體除人源化之外，還可以生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生產(chǎn)這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例 如小鼠)，它能夠在被免疫時(shí)產(chǎn)生完全的人抗體譜(repertoire)，而沒(méi)有內(nèi)源免疫球蛋白 產(chǎn)生。例如，已有記載，在嵌合和種系突變小鼠內(nèi)純合刪除抗體重鏈連接區(qū)(JH)，可導(dǎo)致內(nèi) 源抗體的產(chǎn)生完全被抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系的突變小鼠體 內(nèi)，可導(dǎo)致在抗原刺激時(shí)產(chǎn)生人抗體。見(jiàn)例如Jakobovits et al.，Proc. Mad. Acad. Sci. USA,90 2551 (1993) Jakobovits et al. , Nature, 362 255-258(1993) ；Bruggermann et al.，Year in immuno.，7 33 (1993)；和美國(guó)專(zhuān)利 5，591，669，5，589，369 和 5，545，807。McCaffertyet al.，Nature 348 :552_553 (1990))可用 于在體外從來(lái)自未被免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因譜(repertoire)產(chǎn)生人抗 體和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，將抗體V區(qū)基因閱讀框架一致地(in-frame)克隆到絲狀 噬菌體(例如M13或fd)的大或小衣殼蛋白基因內(nèi)，作為有功能的抗體片段在噬菌體顆粒 的表面上展示。因?yàn)榻z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以根據(jù)抗體的功能性 質(zhì)進(jìn)行選擇也可以選出編碼顯示這些性質(zhì)的抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些 性質(zhì)。噬菌體展示可以用多種形式進(jìn)行，關(guān)于它們的綜述，見(jiàn)例如Johnson，Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3:564—571(1993)。有多 種來(lái)源的V基因片段可用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature, 352 =624-628(1991)從經(jīng)免疫小鼠的脾臟來(lái)源的小型 隨機(jī)組合V基因文庫(kù)分離了多種系列的抗噁唑酮抗體?？梢詮奈幢幻庖叩娜斯w構(gòu)建V 基因譜，并基本上按照下列文獻(xiàn)中記載的技術(shù)分離針對(duì)多種系列抗原(包括自身抗原)的 抗體:Marks et al.，J. Mol. Biol, 222 :581_597 (1991)，或 Griffith et al.，EMB0 J. 12 725-734(1993)。另見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利 5，565，332 和 5，573，905。人抗體也可以由體外活化的B細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利205，567，610和 5，229，275)。在共有的共同未決申請(qǐng)中記載了用SCID小鼠產(chǎn)生人抗體的一個(gè)優(yōu)選手段。(v)抗體片段已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段是通過(guò)蛋白水解消化 完整的抗體產(chǎn)生的(見(jiàn)例如 Morimoto et al. , Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107—117(1992)和 Brennan et al.，Science, 229 :81 (1985))。然而，現(xiàn)在這 些片段也可以由重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生。例如，可以從上面討論的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗 體片段?；蛘?，可以直接從大腸桿菌回收Fab' _SH片段，并加以化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab' )2 片段(Carteret al.，Bio/Technology 10 163-167 (1992))。根據(jù)另一種方法，F(xiàn)(ab' )2 片段可以直接從重組宿主細(xì)胞分離。其它用于產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)是技術(shù)人員容易想到 的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見(jiàn)W093/16185;美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，571，894 ；和美國(guó)專(zhuān)利No. 5，587，458?？贵w片段還可以是“線(xiàn)性抗體”，例如在美國(guó)專(zhuān) 利5，641，870中記載的。這些線(xiàn)性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。(vi)非抗體結(jié)合蛋白術(shù)語(yǔ)“非抗體結(jié)合蛋白，，或“非抗體配體”或“抗原結(jié)合蛋白，，可互換使用，指使用 非免疫球蛋白骨架的抗體模擬物，包括adnectimavimers、單鏈多肽結(jié)合分子和類(lèi)抗體結(jié) 合肽模擬物，在下文中將更詳細(xì)地進(jìn)行討論。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了其它按照與抗體相似的方式靶定和結(jié)合靶標(biāo)的化合物。這些“抗體 模擬物”的一些使用非免疫球蛋白骨架作為抗體可變區(qū)的可替代蛋白框架。例如，Ladner et al.(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，260，203)記載了單多肽鏈結(jié)合分子，其具 有與抗體的聚集的、但分子水平上分離的輕鏈和重鏈可變區(qū)相似的結(jié)合特異性。單鏈結(jié)合 分子同時(shí)含有抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體結(jié)合位點(diǎn)，它們通過(guò)一段肽接頭連接，并會(huì)折 疊成與雙肽抗體相似的結(jié)構(gòu)。單鏈結(jié)合分子與傳統(tǒng)的抗體相比顯示有多種優(yōu)勢(shì)，包括尺寸 更小、穩(wěn)定性更高和更容易被修飾。Ku 等 Proc Natl Acad Sci USA 92(14) :6552_6556 (1995))公開(kāi)了一種基于細(xì)胞
44色素b562的抗體替代物。Ku等(1995)制成了一個(gè)文庫(kù)，其中細(xì)胞色素b562的兩個(gè)環(huán)被隨 機(jī)化，并從中選擇針對(duì)牛血清白蛋白的結(jié)合性。發(fā)現(xiàn)突變體們以與抗BSA抗體相似的方式 選擇性結(jié)合BSA。Lipovsek等(美國(guó)專(zhuān)利6，818，418和7，115，396)公開(kāi)了一種抗體模擬物，其特 征是具有一個(gè)纖連蛋白或纖連蛋白樣骨架和至少一個(gè)可變環(huán)。這些基于纖連蛋白的抗體模 擬物稱(chēng)作Adnectins，它們顯示出許多與天然或工程化抗體相同的特征，包括對(duì)任何靶配體 的高親和性和特異性。任何用于發(fā)展新的或改良的結(jié)合蛋白的技術(shù)均可用于這些抗體模擬 物。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)與IgG重鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)相似。因此，這 些模擬物的抗原結(jié)合性質(zhì)在性質(zhì)上與親和性上與天然抗體相似。而且，這些基于纖連蛋白 的抗體模擬物與抗體和抗體片段相比還表現(xiàn)出某些優(yōu)點(diǎn)。例如，這些抗體模擬物的天然折 疊穩(wěn)定性不依賴(lài)于二硫鍵，因此這些抗體模擬物在通常會(huì)破壞抗體的條件下仍然保持穩(wěn) 定。此外，因?yàn)檫@些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)與IgG重鏈的結(jié)構(gòu)相似，所以可以在 體外進(jìn)行環(huán)隨機(jī)化和重排處理，類(lèi)似于抗體的體內(nèi)親和力成熟過(guò)程。Beste 等(Proc Natl Acad Sci USA 96(5) : 1898-1903 (1999))公開(kāi)了一種基于 脂籠蛋白骨架的抗體模擬物(Anticalin )。脂籠蛋白包括蛋白末端由4個(gè)超變環(huán)構(gòu)成的
桶。Beste (1999)將這些環(huán)進(jìn)行隨機(jī)突變，并以例如對(duì)熒光素的結(jié)合為條件進(jìn)行選擇。 這些變異體顯示對(duì)熒光素的特異性結(jié)合，其中一個(gè)變異體顯示與抗_熒光素抗體相似的結(jié) 合。進(jìn)一步的分析顯示，所有隨機(jī)化位置均是可變的，表明Anticalin 可能適合于用作抗 體的替代物。Anticalin 是小的單鏈肽，典型地為160-180個(gè)殘基，與抗體相比具有多種優(yōu)勢(shì)，
包括生產(chǎn)成本低、保存穩(wěn)定性高和免疫反應(yīng)小。Hamilton等(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，770，380)公開(kāi)了一種合成抗體模擬物，其使用杯芳 烴(calixarene)剛性非肽有機(jī)骨架，骨架上搭接有多個(gè)可變肽環(huán)，作為結(jié)合位點(diǎn)。肽環(huán)相 對(duì)于彼此均從杯芳烴的幾何學(xué)上的同一側(cè)突出。由于這種幾何學(xué)構(gòu)型，所有的環(huán)均可供結(jié) 合，從而增加了與配體的結(jié)合親和性。然而，與其它的抗體模擬物相比，基于杯芳烴的抗體 模擬物不是純粹由肽構(gòu)成的，因此對(duì)蛋白酶攻擊的敏感性降低。骨架也不是僅由肽、DNA或 RNA構(gòu)成，這意味著該抗體在極端環(huán)境條件下相對(duì)穩(wěn)定，壽命較長(zhǎng)。而且，因?yàn)榛诒紵N的 抗體模擬物相對(duì)較小，其產(chǎn)生免疫響應(yīng)的可能性降低。Murali 等(Cell Mol Biol. 49 (2) :209_216 (2003))討論一種用于將抗體減 小為更小的模擬肽的方法，他們稱(chēng)之為“類(lèi)抗體結(jié)合模擬肽(antibody likebinding peptidomemetics) ” (ABiP)，也可以作用抗體的替代物。Silverman 等(Nat Biotechnol. (2005) ,23 :1556_1561)公開(kāi)了融合蛋白，它們是 包含多個(gè)域的單鏈多肽，稱(chēng)作“avimers”。avimers是通過(guò)體外外顯子重排和噬菌體展示 從人細(xì)胞外受體域發(fā)展而來(lái)的，是一類(lèi)在親和性和對(duì)各種靶分子的特異性方面與抗體相似 的結(jié)合蛋白。所得的多結(jié)構(gòu)域蛋白可以包括多個(gè)獨(dú)立的結(jié)合域，它們與單表位結(jié)合蛋白相 比顯示更高的親和性(在某些情況下是亞納摩爾級(jí))和特異性。關(guān)于avimers構(gòu)建和使 用的更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)Nos. 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 和 20050221384。
除了非免疫球蛋白蛋白框架之外，包含RNA分子和非天然寡聚體(例如蛋白酶抑 制劑、苯并二氮卓、嘌呤衍生物和轉(zhuǎn)角模擬物)的化合物也可以模擬抗體的性質(zhì)，所有 這些均適用于本發(fā)明。盡管測(cè)試劑文庫(kù)的構(gòu)建是本領(lǐng)域眾所周知的，但在下文中，還是提供了關(guān)于鑒定 測(cè)試劑和構(gòu)建這些試劑文庫(kù)用于本篩選方法的額外指導(dǎo)。(vii)抗體偶聯(lián)和其它修飾本方法中使用的或者本文制造商文獻(xiàn)中包含的抗體可以任意地與細(xì)胞毒性或治 療劑偶聯(lián)。本文也預(yù)期了抗體與一個(gè)或多個(gè)小分子毒素，如加利車(chē)霉素(calicheamicin)、 美登木素(maytansine)(美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，208，020)、trichothene、和 CC1065,的偶聯(lián) 物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體與一個(gè)或多個(gè)美登木素分子偶聯(lián)(例如每個(gè) 抗體分子與大約1-大約10個(gè)美登木素分子)。美登木素可以例如轉(zhuǎn)變?yōu)镸ay SS-Me，其 可被還原成May_SH3，進(jìn)而與經(jīng)過(guò)修飾的抗體反應(yīng)(Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992))，從而產(chǎn)生類(lèi)美登木素生物堿(maytansinoid)-抗體偶聯(lián)物?；蛘?，可以將抗體與一個(gè)或多個(gè)加利車(chē)霉素分子偶聯(lián)。加利車(chē)霉素抗生素家族 能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車(chē)霉素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物包括但不 限于 h1、a a/、N-乙?；?yJ、PSAG 禾口 0 \ (Hinmanet al. , Cancer Research 53: 3336-3342(1993)禾口 Lode et al. , Cancer Research 58:2925-2928(1998))?？墒褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、 外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒 蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、a -帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii) 毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋 白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹(shù)毒素(gelonin)、絲林霉素 (mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酷霉素(phenomycin)、依諾霉素(neomycin) 和單端孢菌毒素(tricothecenes)。還可參見(jiàn)例如1993年10月28日公開(kāi)的W093/21232。本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期了與多種放射性同位素偶聯(lián)的抗體。實(shí)例包括211At，mI，125I， 9°Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P 和放射性同位素 Lu?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體和胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如3_(2_吡啶 基二硫代)丙酸N-琥珀酰亞氨基酯(SPDP)、4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己胺-1-羧酸琥 珀酰亞氨基酯、亞氨基硫烷(iminothiolane) (IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺 酯)、活性酯類(lèi)(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(lèi)(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙 (對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲?；?己二胺)、二異氰 酸酯(諸如甲苯2，6- 二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)的 雙功能衍生物。例如，可如Vitetta et al. , Science 238 =1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋 白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是 用于將放射性核苷酸與拮抗劑或抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見(jiàn)W0 94/11026。接頭可以是 便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接 頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari et al. ,Cancer Research 52:127-131 (1992))。
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或者，可以通過(guò)例如重組技術(shù)或肽合成制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以和用于腫瘤預(yù)定位(pretargeting)的“受 體”(例如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，其中將抗體-受體偶聯(lián)物施用給患者，隨后用清除劑從 循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(例 如抗生物素蛋白)。本發(fā)明的抗體還可以和前體藥激活酶偶聯(lián)，其將前體藥物(例如肽?；焺?，見(jiàn) W081/01145)轉(zhuǎn)變成活性抗癌藥物。見(jiàn)例如W0 88/07378和美國(guó)專(zhuān)利No. 4，975，278。這些偶聯(lián)物的酶組分包括任何能夠作用于前體藥的酶，這些酶將前體藥轉(zhuǎn)變成更 有活性的細(xì)胞毒形式?？捎糜诒景l(fā)明方法的酶包括但不限于可用于將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)?游離藥物的堿性磷酸酶；可用于將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酯 酶；可用于將無(wú)毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榭拱┧幬?-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可用于將含 肽的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋 白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；可用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸替代的前體 藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可用于將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的碳水化合物切割酶 類(lèi)，諸如半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可用于將內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物 的旦-內(nèi)酰胺酶；及可用于將在其氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D(zhuǎn)變 成游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘?，可使用具有酶 活性的抗體，本領(lǐng)域也稱(chēng)作“抗體酶”(abzymes)，來(lái)將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x活性藥 物(參見(jiàn)例如Massey，Nature 328:457-458(1987))?？扇绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶 聯(lián)物，用于將抗體酶投遞至腫瘤細(xì)胞群?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將本發(fā)明的酶與抗體共價(jià)結(jié)合，諸如使用上文討論 的異雙功能交聯(lián)劑。或者，可使用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建包含與本發(fā)明酶 的至少功能活性部分連接的抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見(jiàn)例如Neuberger et al.，Nature 312 :604_608(1984))。本文還設(shè)想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物中的 一種連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。本文公開(kāi)的抗體還可以被配制為脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體可通過(guò)本領(lǐng)域眾 所周知的方法加以制備，例如下列文獻(xiàn)中所述Epstein et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 3688(1985) ；Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA，77 :4030 (1980)；美國(guó)專(zhuān) 利 Nos. 4，485，045 和 4，544，545 ；和 1997 年 10 月 23 日公開(kāi)的 W097/38731。美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，013，556公開(kāi)了具有更長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可以通過(guò)反相蒸發(fā)法用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化 磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物來(lái)產(chǎn)生。將脂質(zhì)體通過(guò)具有限定孔尺寸的濾膜擠出， 產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可以按照下列文獻(xiàn)所述通過(guò)二硫鍵 交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián):Martin et al. J ；Biol. Chem. 257 =286-288(1982) 脂質(zhì)體中可以 視需要包含化療劑。見(jiàn) Gabizon et al. ANational Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)。還預(yù)期了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，我們期望提高抗體的結(jié)合親和 性和/或其它生物學(xué)性質(zhì)。通過(guò)在編碼抗體的核酸中導(dǎo)入合適的核苷酸變化或通過(guò)肽合成制備抗體的氨基酸序列變異體。這些修飾包括，例如，從抗體氨基酸序列刪除、和/或插入、 和/或替換殘基。刪除、插入和替換的任意組合均可用于實(shí)現(xiàn)所得構(gòu)建體，使所得的構(gòu)建體 具有期望的性質(zhì)。氨基酸變化也可以改變抗體的翻譯后處理，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目 或位置。一種用于鑒定抗體中作為優(yōu)選突變位置的某些殘基或區(qū)域的有用方法稱(chēng)作“丙氨 酸掃描突變”，，如 Cunningham and Wells, Science 244 1081-1085 (1989)所述。這里，鑒 定了一個(gè)或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸和谷 氨酸)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與 抗原的相互作用。然后通過(guò)在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲那些對(duì)替代顯示功 能敏感性的氨基酸位置。因此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本 身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點(diǎn)處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域 進(jìn)行丙氨酸掃描誘變或隨機(jī)突變，并對(duì)所表達(dá)的抗體變體篩選所需活性。氨基酸序列插入包括氨基_和/或羧基_末端的融合，長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基至包 含上百或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包 括具有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入 變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶或提高抗體血清半衰期的多肽。另一類(lèi)變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用 不同殘基替換。最感興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)或CDR，但也考慮了 FR或Fc區(qū)改 變。對(duì)抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾通過(guò)選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的 替代來(lái)完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處 分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。天然發(fā)生的殘基可以根據(jù)共有的側(cè)鏈性質(zhì)分成如下幾組(1)疏水正亮氨酸，met, ala, val, leu, ile ；(2)中性親水:cys, ser, thr ；(3)酸性asp，glu ；(4)喊個(gè)生:asn, gin, his, lys, arg ；(5)影響鏈方向的殘基gly，pro ；和(6)芳香性:trp, tyr, phe.非保守替換需要用這些組中其中一個(gè)的成員交換另一個(gè)組的成員。任何不參與保持抗體的合適構(gòu)象的半胱氨酸殘基均可加以替換，一般是替換成絲 氨酸，以提高分子的氧化穩(wěn)定性，和防止異常交聯(lián)。相反，可以向抗體添加半胱氨酸鍵，以提 高其穩(wěn)定性(特別是抗體是片段例如Fv片段的情況)。特別優(yōu)選的一類(lèi)替代變體涉及替代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè) 高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改 進(jìn)的生物學(xué)特性。產(chǎn)生此類(lèi)替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。 簡(jiǎn)而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸 替代。如此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝 的M13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開(kāi)的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒 定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原_抗體復(fù)合物的晶體結(jié) 構(gòu)，以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文 詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選， 可選擇在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)?？贵w的另一類(lèi)氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。改變意味著刪除在抗 體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位 點(diǎn)o抗體的糖基化通?；蚴荖-連接的或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊搭 接于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X 是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促搭接于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。 因此，多肽中這些三肽序列其中任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。0-連接的糖基化指 將糖類(lèi)N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一搭接于羥基氨基酸，最常見(jiàn)的是絲氨酸或蘇氨 酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴(lài)氨酸。向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽 序列而便利的完成(對(duì)于N-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通過(guò)向原始抗體的序列中 添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)進(jìn)行(對(duì)于0-連接的糖基化位點(diǎn))。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方 法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過(guò)對(duì)早 期制備的變體或非變體型式的抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式 誘變來(lái)加以制備。理想的是修飾本發(fā)明中使用的抗體來(lái)改善效應(yīng)物功能，例如增強(qiáng)抗體的抗原依賴(lài) 性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過(guò)在抗體Fc區(qū) 中弓I入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代來(lái)實(shí)現(xiàn)。或者/另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而容 許在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提 高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴(lài)性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron et al.，J. Exp. Med. 176 1191-1195(1992)和 Shopes, B.，J. Immunol. 148=2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff et al.， CancerResearch 53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備?；蛘撸贵w可改 造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見(jiàn)Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219—230(1989)。為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國(guó)專(zhuān)利5，739，277中所述在抗體(尤其 是抗體片段)中加入補(bǔ)救受體結(jié)合表位。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG 分子(如IgA、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。本發(fā)明的多個(gè)方面將在下面的實(shí)施例中進(jìn)行描述，這些實(shí)施例并不意圖限制由權(quán) 利要求描述的本發(fā)明的范圍。除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普 通技術(shù)人員所普遍理解的相同的意思。盡管在實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明時(shí)可以使用與本文所述方 法和材料相似或等價(jià)的方法和材料，但是下文記載了合適的方法和材料。
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本發(fā)明在下文的實(shí)施例中將進(jìn)行進(jìn)一步的描述，它們并不限制由權(quán)利要求描述的 本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例本發(fā)明在下文的實(shí)施例中將進(jìn)行進(jìn)一步的記載，它們并不限制由權(quán)利要求描述的 本發(fā)明的范圍?！笇?shí)施例11通用方法細(xì)胞系C0S7細(xì)胞和PC細(xì)胞系LNCaP、22Rvl、PC-3、DU-145和C4-2B從美國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心(ATCC、Rockville、MD)購(gòu)買(mǎi)，LNCaP來(lái)源的HRPC細(xì)胞系C4-2B從ViroMed Laboratories (Minnetonka, MN)購(gòu)買(mǎi)。傳代超過(guò) 30 次的 LNCaP 被定義為 LNCaP (HP)， 其與傳代次數(shù)低的LNCaP細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上和基因表達(dá)模式方面有所不同。它們生長(zhǎng)于 Delbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，該培養(yǎng)基添加 了 10 % 胎牛血清(GeminiBio-Products，West Sacramento, CA)和抗生素/抗真菌劑溶液 (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)。將細(xì)胞保持在 37°C 5% C02 的濕潤(rùn)氣氛中。半定量RT-PCR如前人所述地(TamuraK et al.，Cancer Res 200767 :5117-25.)從冷凍PC組織 中純化PC細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞。在獲得了患者知情同意的前提下，從正在進(jìn)行前列 腺針吸活檢、骨活檢、TUR-P(經(jīng)尿道前列腺切除)和“溫?zé)帷笔瑱z的HRPC患者采取組織樣品。 同時(shí)，還從正在進(jìn)行根治性前列腺切除術(shù)的、未經(jīng)治療的可手術(shù)病例(untreated operable cases)獲得未經(jīng)激素處理的(hormone-naYve )前列腺癌(HNPC)樣品，從已確認(rèn)組織病理 學(xué)上無(wú)明顯前列腺癌或PIN的良性前列腺增生(BPH)患者和膀胱癌患者獲得了正常的前列 腺上皮細(xì)胞(NPEC)。如前所述(Tamura K et al.，Cancer Res 200767 :5117_25.)進(jìn)行 HRPC細(xì)胞、未經(jīng)激素處理的前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞的顯微解剖。對(duì)來(lái)自這些 樣品的RNA進(jìn)行兩輪基于T7的RNA擴(kuò)增(Epicentre Technologies,Madison, WI)，并隨后 合成單鏈cDNA。用Rneasy試劑盒(QIAGEN，Valencia, CA)根據(jù)制造商的推薦提取人HRPC 細(xì)胞系的總RNA。提取的RNA用無(wú)RNA酶的DNA酶套裝(QIAGEN)處理，然后利用d⑴12-18 引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。使用如下的引物序 列肌動(dòng)蛋白(ACTB)正向TTGGCTTGACTCAGGATTTA (SEQ ID NO. 6)肌動(dòng)蛋白(ACTB)反向ATGCTATCACCTCCCCTGTG (SEQ ID NO. 7)PKIB 正向GGCACATACTAGAAGCAAAATACG (SEQ ID NO. 8)PKIB 反向GATGGGCAAATCATTCTTGGTA (SEQ ID NO. 9)NAALADL2 正向GAAAGCATCTCACATTGGTTTTC (SEQ ID NO. 10)NAALADL2 反向GGGTTTCAAAGAGAAACTCTGCT (SEQ ID NO. 11)NAALADL2-2 正向GAAGCAAAATGCCAGATGGT (SEQ ID NO. 12)NAALADL2-2 反向TCCTGCACAGTGTTCTAGAAAGG (SEQ ID NO. 13)該EST與NAALADL2基因的聯(lián)系通過(guò)RT-PCR加以確認(rèn)。確定RT-PCR的指數(shù)期，以 容許對(duì)從相同反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行半定量比較。每個(gè)PCR體系包括98°C，30秒初始變性步驟，隨后98°C 10秒，55°C 5秒，和72°C 30秒進(jìn)行22個(gè)循環(huán)(對(duì)于A(yíng)CTB)，23個(gè)循環(huán)(對(duì) TPKIB, NAALADL2), ^ GeneAmp PCR system 9600 (PE Applied Biosystems, Foster, CA) 上進(jìn)行。Northern 印跡分析使用Rneasy試劑盒(QIAGEN)從7種PC細(xì)胞系提取總RNA，并進(jìn)行Northern印跡 分析。用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare)根據(jù)制造商的方案純化出mRNA。將1 P g等份 的來(lái)自PC細(xì)胞系以及從正常人心臟、肺、肝、腎、腦和前列腺(BD Biosciences,Palo Alto, CA)分離的每種mRNA在變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。261bp的PKIB 特異性探針通過(guò)用上述的引物組進(jìn)行PCR加以制備，706bp的NAALADL2特異性探針通過(guò)用 如下的引物組進(jìn)行PCR加以制備正向5’ -ccagtgcccagaaaccaata-3’ (SEQ ID NO. 14)和 反向 S'-tcaattcttcccatccaagacal'(SEQ ID NO. 15)。根據(jù) Megaprime DNA 標(biāo)記系統(tǒng)(GE bioscience,UK)的使用說(shuō)明，與隨機(jī)引發(fā)的a 32P-dCTP_標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。預(yù)雜交、雜交 和清洗根據(jù)供應(yīng)商的推薦進(jìn)行。印跡用光增感屏在-80°C放射自顯影7天。小干擾RNA(siRNA)表達(dá)構(gòu)建體和轉(zhuǎn)染為了敲低PKIB和NAALADL2在PC細(xì)胞中的表達(dá)，如前人所述地(Tamura K et al.， Cancer Res 200767 :5117_25.)使用psiU6BX3. 0載體表達(dá)針對(duì)靶基因的短發(fā)夾RNA。用于 PKIB siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下sil；GCCCTAAGCAGCATGTGTA (SEQ ID NO. 16),si2 ；GCAGTAGGCACTTAAGCAT (SEQ ID NO. 17)si3 ；GATGCAAAAGAGAAAGATG (SEQ ID NO. 18)用于NAALADL2siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下si#690 ；GACTCAGTGGACCTCTTTG (SEQ ID NO. 19)si#913 ；GTCATCGATGTGAGTTATG (SEQ ID NO. 20)si#1328 ；GAGTCGTCAGCATGCAAGT(SEQ ID NO. 21)和siEGFP ;GAAGCAGCACGACTTCTTC(SEQ ID NO. 22)(作為陰性對(duì)照)。將 PC 細(xì)胞 系22Rvl和LNCaP (HP)或C4-2B細(xì)胞鋪布在10_cm盤(pán)或6孔板上，并使用FuGENE6 (Roche) 根據(jù)制造商的說(shuō)明，用設(shè)計(jì)表達(dá)針對(duì)PKIB或NAALADL2的siRNA的質(zhì)粒(8 y g/盤(pán)，3 y g/ 孔)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞用0. 8mg/ml遺傳霉素(Sigma-Aldrich)選擇7天，然后收集細(xì)胞并分 析對(duì)PKIB或NAALADL2表達(dá)的敲低作用。用上述引物對(duì)PKIB或NAALADL2進(jìn)行RT-PCR。對(duì) 于集落形成試驗(yàn)，將表達(dá)siRNA的轉(zhuǎn)化體在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)20天。用100% 甲醇固定后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞用0. 結(jié)晶紫-H20染色以評(píng)估集落形成。細(xì)胞生存力的定量使用 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒_8(D0JIND0，Kumamoto, Japan) 0在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天 后，添加終濃度為10%的溶液。在37°C溫育2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀550(Bio-Rad，Hercules, CA)測(cè)量490nm吸光度，以630nm為參比。本發(fā)明人還合成了對(duì)應(yīng)于si#690的RNA雙鏈體 5，-GACUCAGUGGACCUCUUUGGG-3，(SEQ ID NO. 23)和 5，-CAAAGAGGUCCACUGA⑶CUU-3，(SEQ ID NO. 24)，或者陰性對(duì)照 siRNA 雙鏈體(GCAGCACGACUUCTUUCAAGTT(SEQ ID NO. 25)和 CUUGAAGAAGUC⑶GCUGCTT (SEQ ID NO. 26))，將它們的分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入另一種表達(dá)NAALADL2的 PC細(xì)胞系C4-2B細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)
通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼PKIB或NAALADL2開(kāi)放閱讀框的cDNA，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pcDNA3. l(+)/myc-HisA 載體(Invitrogen)或 pIRES/HA(Clontech/BD Bioscience)中。 用FuGENE6按照制造商推薦的程序(Roche)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入涂布在玻璃蓋玻片(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)上的 C0S7 中。溫育 48 小時(shí)后，用 4%多聚甲酸 固定細(xì)胞，并在室溫下用溶于PBS中的0. Triton X-100處理lmin使之通透化。用含 有3% BSA的PBS在室溫下處理30min，封閉非特異結(jié)合。用稀釋于含BSA的PBS中的 抗_Myc抗體(Santa Cruz)或抗-HA抗體(Sigma)在室溫下溫育細(xì)胞60min。用PBS清洗 后，用FITC偶聯(lián)第二抗體(Santa Cruz)在室溫下對(duì)細(xì)胞染色60min。用PBS清洗后，用含 有 4，，6，_ 二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的 VECTASHIELD (VECTOR Laboratories, Inc，Burlingame，CA)封固樣品，并用光譜共聚焦掃描系統(tǒng)(Leica，Bensheim，Germany)可 視化。PKIB與PKA-C間的相互作用將PKIB-Myc和HA-PKA-C表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)入22Rvl細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用裂 解緩沖液[50mM 撲18-11(1( 117.0)、2501111蔗糖、11111 DTTUOmM EDTAUmM EGTA、5mM MgCl2] 裂解這些細(xì)胞。細(xì)胞裂解物用抗_Myc抗體(Santa Cruz)或抗_HA抗體(Sigma)免疫沉淀， 用抗_Myc抗體或抗-HA抗體對(duì)這些免疫沉淀物進(jìn)行western印跡分析。PKA-C 定位本發(fā)明人合成了對(duì)應(yīng)于序列sil的RNA雙鏈體(5，-GCCCUAAGCAGCAUGUGUAUA-3， (SEQ ID NO. 27)和 5，-UACACAUGCUGCUUAGGGCUU-3，(SEQ ID NO. 28))，以更有效地敲低內(nèi) 源PKIB。用Lipofectamin 2000 (Invitrogen)根據(jù)制造商的推薦方法將這些RNA雙鏈體轉(zhuǎn) 染進(jìn)入PC-3細(xì)胞。溫育48小時(shí)后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并在室溫下用溶于PBS中的 0. 1% Triton X-100通透化lmin。用含有3% BSA的PBS在室溫下處理30min，封閉非特異 結(jié)合。用以1 200的比例稀釋于含1%BSA的PBS中的抗-PKA-C抗體(C-20，Santa Cruz) 在室溫下溫育細(xì)胞60min。用PBS清洗后，用FITC偶聯(lián)第二抗體(Santa Cruz)在室溫下對(duì) 細(xì)胞染色60min，并用光譜共聚焦掃描系統(tǒng)可視化。為了分級(jí)細(xì)胞裂解物，用Lipofectamin 2000 (Invitrogen)根據(jù)制造商的推薦方法將RNA雙鏈體轉(zhuǎn)染進(jìn)入LNCaP (HP)細(xì)胞。溫 育48小時(shí)后，收集細(xì)胞，并用NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑(PIERCE)將這些細(xì)胞裂 解物分級(jí)。用抗-PKA-C抗體和作為上樣和細(xì)胞核分級(jí)對(duì)照的抗-核纖層蛋白B抗體 (Calbiochem)，對(duì)30 i g蛋白的分級(jí)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行western印跡。PKIB過(guò)表達(dá)細(xì)胞的生成和體外/體內(nèi)生長(zhǎng)測(cè)定通過(guò)PCR擴(kuò)增了編碼PKIB開(kāi)放閱讀框的cDNA，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pIRES/ HA(Clontech/BD Bioscience)中。用FuGENE6 (Roche)根據(jù)制造商推薦的程序?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)染 進(jìn)入無(wú)PKIB的PC細(xì)胞系DU145。細(xì)胞群體用0. 6mg/ml遺傳霉素(Invitrogen)選擇，然后 通過(guò)有限稀釋對(duì)形成克隆的DU145細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。通過(guò)RT-PCR如上所述地確認(rèn)PKIB表 達(dá)，建立了三個(gè)組成型表達(dá)PKIB的克隆。還建立了用空pIRES/HA載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照DU145細(xì) 胞作為模擬細(xì)胞。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(D0JIND0)測(cè)量這些已建立的克隆的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。對(duì)于體內(nèi)生長(zhǎng)測(cè)定，將兩個(gè)穩(wěn)定克隆和兩個(gè)模擬克隆的2X106個(gè)細(xì)胞分別接種在 雄性裸鼠的右脅和左脅?？贵w生成和免疫組織化學(xué)
將兩種來(lái)自人PKIB 的肽(SARAGRRNALPDIQSSAATD(SEQ ID NO 33)和 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK(SEQ ID NO :34))免疫接種到家兔體內(nèi)，在親和柱上對(duì)免疫血清進(jìn) 行純化，其中親和柱裝填有通過(guò)基本方法與每種肽抗原偶聯(lián)的Affi-GellO活化親和介質(zhì) (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)的。PC 組織的常規(guī)切片(Conventional section) 從手術(shù)樣品獲得，HRPC組織通過(guò)尸檢和TUR-P獲得(Tamura et al. Cancer Res 67， 5117-25，2007)。將切片在 108°C 的 Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH(Dako，Carpinteria，CA)中處理15min，進(jìn)行脫蠟和高壓滅菌。在封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶和 蛋白質(zhì)之后，將切片與抗-PKIB抗體(按1 100稀釋)在室溫下溫育60min。用PBS清洗 后，用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗家兔免疫球蛋白(Envision kit,Dako)進(jìn)行免疫檢測(cè)。最后，用 3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(Dako)對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行顯影。用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。Akt磷酸化22Rvl, LNCaP或PC_3細(xì)胞如上面討論地用對(duì)應(yīng)于序列sil的PKIB寡siRNA或 PKIB表達(dá)載體(pcDNA3. 1/HA-PKIB)轉(zhuǎn)染，在48小時(shí)或24小時(shí)后收集。用含有蛋白酶抑制 劑(蛋白酶抑制劑合劑第III組；CALBI0CHEM)的RIPA緩沖液(50mM Tris-HCl [pH 8. 0]、 150mM NaClU%NP-40,0. 5%脫氧膽酸鈉、0. 十二烷基磺酸鈉[SDS])裂解細(xì)胞。蛋白樣 品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，并電印跡到PVDF轉(zhuǎn)移膜(GE Healthcare Bio-sciences) 上。將印跡與家兔單克隆抗-磷酸Aktl(Ser473)抗體(Cell signaling)、家兔單克隆 抗-Aktl抗體(Cell signaling)或小鼠單克隆3 -肌動(dòng)蛋白(ACTB)抗體(Sigma)溫育。 蛋白條帶通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)western印跡檢測(cè)試劑(GE HealthcareBio-sciences) 可視化?；|(zhì)膠(Matrigel)侵襲測(cè)定用表達(dá)PKIB的質(zhì)粒(pcDNA3. 1/HA-PKIB)或用模擬質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞在含 10% FBS的DMEM中生長(zhǎng)至接近匯合。通過(guò)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用未添加血清或蛋白酶 抑制劑的DMEM清洗，并以5X105/ml的濃度懸浮在DMEM中。在制備細(xì)胞懸液之前，將基質(zhì) 膠基質(zhì)(Becton DickinsonLabware)的干燥層用DMEM在室溫下復(fù)水2小時(shí)。向每個(gè)下部小 室(lowerchamber)中添加含有10% FBS的DMEM(0. 75ml)；侵襲通過(guò)人工基膜(Matrigel) 的細(xì)胞如上所述地固定，并用吉姆薩染色。「實(shí)施例21在PC細(xì)胞中PKIB和NAALADL2的過(guò)表達(dá) 在通過(guò)HRPC細(xì)胞的全基因組范圍cDNA微陣列分析篩選出的數(shù)十種反式激活基因 中(Tamura K et al. , Cancer Res 200767 :5117_25.)，本發(fā)明關(guān)注 PKIB 和 NAALDL2。在 9 個(gè)顯微解剖的HRPC細(xì)胞群體中的5個(gè)內(nèi)通過(guò)RT-PCR確認(rèn)有PKIB過(guò)表達(dá)(圖1A)，在9個(gè) 顯微解剖的HRPC細(xì)胞群體中的5個(gè)內(nèi)確認(rèn)有NAALADL2過(guò)表達(dá)(圖2A)。
這兩個(gè)基因在正常器官，包括心臟、肺、肝和腎中的表達(dá)微弱，與激素敏感型或未 處理型PC細(xì)胞相比，HRPC細(xì)胞顯示這兩個(gè)基因有更高表達(dá)。使用PKIB的cDNA片段作為 探針進(jìn)行Northern印跡分析，在胎盤(pán)和PC細(xì)胞系中特異地鑒定出了一個(gè)大約1. 3kb的 轉(zhuǎn)錄本，但是在任何其它器官中，包括肺、心、肝、腎和腦，沒(méi)有觀(guān)察到表達(dá)(圖1B)。使用 NAALADL2的cDNA片段作為探針進(jìn)行Northern印跡分析，在三個(gè)PC細(xì)胞系中特異性地鑒定 出了大約10kb、6kb和5kb的條帶，但是在任何其它器官中，包括肺、心、肝、腎和腦，沒(méi)有觀(guān) 察到表達(dá)(圖2B)。
數(shù)據(jù)庫(kù)分析和跨NAALADL2編碼區(qū)的RT-PCR提示，這三個(gè)條帶反映了 3’ UTR的變 異。制成了特異針對(duì)人PKIB的多克隆抗體，并且為了確認(rèn)PKIB蛋白在PC細(xì)胞中的表達(dá)， 用41個(gè)臨床PC組織，包括32個(gè)激素敏感型或未經(jīng)激素處理型的PC和9個(gè)HRPC，進(jìn)行了免 疫組織化學(xué)分析。如Northern印跡分析和RT-PCR分析所示，PIN(圖1C)和正常前列腺上 皮細(xì)胞(圖1D，用N表示)顯示微弱的PKIB染色(+)，10/32(31% )的未經(jīng)激素處理型PC 也顯示微弱或無(wú)PKIB染色(+)(圖1D)。另一方面，22/32 (69%)的未經(jīng)激素處理型PC(圖 1E)和全部6個(gè)HRPC(圖1F)顯示PKIB強(qiáng)陽(yáng)性(++或+++)，這與RT-PCR分析的結(jié)果是一 致的。而且，全部(9/9)GleaS0n等級(jí)5級(jí)的未經(jīng)激素處理型PC(圖1E)以及HRPC都顯示 PKIB強(qiáng)陽(yáng)性，并且PKIB表達(dá)與Gleason等級(jí)強(qiáng)烈相關(guān)(表1，卡方檢驗(yàn)，P = 1.35X10—6)， 提示PKIB表達(dá)可以指示PC的惡性表型和不良預(yù)后。表1在臨床PC組織中PKIB表達(dá)與Gleason分?jǐn)?shù)(GS)相關(guān) 「實(shí)施例31PC細(xì)胞系中siRNA敲低PKIB為了研究PKIB異常表達(dá)的潛在促生長(zhǎng)作用構(gòu)建了數(shù)個(gè)siRNA表達(dá)載體，以檢查它 們對(duì)表達(dá)PKIB的PC細(xì)胞系22Rvl和LNCaP (HP)細(xì)胞的敲低作用。當(dāng)sil和si2構(gòu)建體被 轉(zhuǎn)染到22Rvl細(xì)胞(左)和LNCaP (HP)細(xì)胞(右)時(shí)，通過(guò)半定量RT-PCR觀(guān)察到了顯著 的敲低效果，但是#3si和陰性siRNA構(gòu)建體siEGFP沒(méi)有(圖3A)。在含有遺傳霉素的培 養(yǎng)基中選擇之后，MTT測(cè)定(圖3B)和克隆形成測(cè)定(圖3C)證明，在22Rvl細(xì)胞(左)和 LNCaP (HP)細(xì)胞(右)中導(dǎo)入sil和si2可顯著降低其細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力，而其它不影響 PKIB表達(dá)的siRNA則不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，表明PKIB很可能在PC細(xì)胞生存力中發(fā)揮重要作 用?！笇?shí)施例41 PC細(xì)胞系中通過(guò)siRNA敲低NAALADL2為了研究NAALADL2異常表達(dá)的潛在促生長(zhǎng)作用，構(gòu)建了數(shù)個(gè)siRNA表達(dá)載體，以 檢查它們對(duì)表達(dá)NAALADL2的PC細(xì)胞系一22Rvl細(xì)胞的敲低作用。當(dāng)si#690構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染 到22Rvl細(xì)胞時(shí)，通過(guò)半定量RT-PCR觀(guān)察到了顯著的敲低效果，但是其它構(gòu)建體沒(méi)有(圖 4A)。在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中選擇14天之后，MTT測(cè)定(圖4B)和克隆形成測(cè)定(圖 4C)證明，在22Rvl細(xì)胞中導(dǎo)入si#690可急劇降低其細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力，而其它沒(méi)有顯示對(duì) NAALADL2表達(dá)的敲低效果的siRNA則沒(méi)有影響細(xì)胞生長(zhǎng)，這表明NAALADL2很可能在癌細(xì)胞 生存力中發(fā)揮重要作用。將對(duì)應(yīng)于si#690的合成RNA雙鏈體或陰性對(duì)照siRNA雙鏈體轉(zhuǎn) 染進(jìn)入另一個(gè)NAALADL2表達(dá)PC細(xì)胞系C4-2B細(xì)胞。RT-PCR顯示，si#690RNA雙鏈體明顯地敲低了內(nèi)源NAALADL2在C4-2B細(xì)胞中的表達(dá)(圖4D)，并且MTT測(cè)定證明si#690RNA雙 鏈體還能抑制C4-2B細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖4E)?！笇?shí)施例51PKIB和NAALADL2蛋白的亞細(xì)胞定位使用構(gòu)建的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體表達(dá)帶標(biāo)簽的全長(zhǎng)PKIB和NAALADL2蛋白，用 抗_標(biāo)簽抗體通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)研究它們的亞細(xì)胞定位。如圖5所示，外源PKIB定位于細(xì) 胞質(zhì)(圖5A)，而外源NAALADL2蛋白定位于細(xì)胞膜(圖5B)。NAALADL2具有一個(gè)跨膜，被預(yù) 測(cè)作為II型膜蛋白定位于質(zhì)膜。我們的數(shù)據(jù)支持這一點(diǎn)，因此NAALADL2蛋白很可能是II 型膜蛋白?！笇?shí)施例51 PKIB與PKA-C的相互作用，和敲低PKIB所致的PKA-C轉(zhuǎn)位PKIB屬于PKI (蛋白激酶A抑制劑)家族，并且PKIA能夠敲低蛋白激酶A催化亞 基(PKA-C)的激酶活性，并通過(guò)其假底物基序(RRNA ；SEQ IDN0 31)與PKA-C直接結(jié)合從而 將 PKA-C 從細(xì)胞核外排到細(xì)胞質(zhì)(Glass DBet al.，J Biol Chem 1986261 :12166_71.和 Wen ff et al.，J Biol Chem 1994269 :32214_20.)。PKIB 也具有假底物基序(RRNA)，但其 抑制活性比 PKIA 小得多(Gamm DM et al. , J Biol Chem 1995270 :7227_32.)，并且其在細(xì) 胞中轉(zhuǎn)位PKA-C的活性未知。為了研究PKIB是否參與PKA-C定位，首先驗(yàn)證PKIB與PKA-C 間的直接相互作用。將PKIB-Myc和HA-PKA-C表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染22Rvl細(xì)胞，通過(guò)每種標(biāo)簽 抗體對(duì)它們的細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀。圖5C顯示，PKIB-Myc與PKA-C免疫共沉淀，反之 亦然，表明PKIB與PKA-C間有直接相互作用。接著，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)分析和細(xì)胞分級(jí)檢查在敲低了 PKIB的PC-3細(xì)胞或 LNCaP (HP)細(xì)胞中內(nèi)源PKA-C的亞細(xì)胞定位。免疫細(xì)胞化學(xué)分析觀(guān)察到，當(dāng)用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn) 染PC-3細(xì)胞時(shí)，大多數(shù)PKA-C定位于細(xì)胞質(zhì)，一些PKA-C蛋白細(xì)胞位于細(xì)胞核(圖5D，左)。 另一方面，當(dāng)在PC-3細(xì)胞中用siRNA敲低內(nèi)源PKIB時(shí)，免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示在細(xì)胞核中 沒(méi)有或者僅有非常小的PKA-C信號(hào)(圖5D，右)。在另一種PKIB表達(dá)PC細(xì)胞系LNCaP (HP) 細(xì)胞中觀(guān)察到了相同的現(xiàn)象。為了更加定量地分析細(xì)胞核PKA-C，對(duì)用PKIB siRNA處理過(guò) 的LNCaP (HP)細(xì)胞的裂解物進(jìn)行分級(jí)。如圖5E所示，與對(duì)照siRNA相比，PKA-C在細(xì)胞核中的量在PKIB敲低中被明顯降 低，而PKA-C在細(xì)胞質(zhì)中的量在PKIB敲低中則有微小增加。這些發(fā)現(xiàn)暗示，PKIB能夠幫助 PKA-C進(jìn)入細(xì)胞核，或者抑制PKA-C從細(xì)胞核外排，這與PKIA的細(xì)胞核外排功能不同?！笇?shí)施例71 PKIB過(guò)表達(dá)促進(jìn)PC細(xì)胞生長(zhǎng)為了研究PKIB的致癌功能，從DU145細(xì)胞(其不表達(dá)或僅表達(dá)很少量?jī)?nèi)源PKIB) 建立了三個(gè)組成性表達(dá)外源PKIB的克隆，將這些克隆的生長(zhǎng)與模擬DU145細(xì)胞進(jìn)行比較。 如圖所示，所有三個(gè)克隆均組成性表達(dá)外源PKIB(圖6A，圖6B)，并且它們?cè)隗w外(圖6C) 和體內(nèi)(圖6D)比模擬細(xì)胞生長(zhǎng)得更快，提示PKIB在前列腺癌中的促生長(zhǎng)作用。如本免疫 組織化學(xué)分析所示，PKIB過(guò)表達(dá)與高Gleason分?jǐn)?shù)強(qiáng)相關(guān)，這表明PKIB可能對(duì)前列腺癌細(xì) 胞的惡性和侵襲潛能有貢獻(xiàn)。然后，通過(guò)基質(zhì)膠侵襲測(cè)定考察了 PKIB在細(xì)胞侵襲中的可能 作用。如圖6E所示，用PKIB表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的OTH3T3細(xì)胞與用模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比， 顯著增強(qiáng)了其透過(guò)基質(zhì)膠的遷移?！笇?shí)施例81 PKIB參與PC內(nèi)的Akt磷酸化許多報(bào)道提示，PTEN的功能喪失和Akt的激活與前列腺癌的進(jìn)展顯著相關(guān)，并且PTEN-PI3K-Akt途徑很可能在HRPC進(jìn)展和其惡性表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Sellers， W. R. &Sawyers, C. L. (2002),《Somatic Genetics ofProstate Cancer Oncogenes and Tumor Suppressors)) Kantoff, P.編輯(Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia), Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM. , Curr Cancer Drug Targets. 2007S??；7(6) :591_604, Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci U S A 2001 ；98 (13) 7200-5, Feldman BJ, FeldmanD, Nat Rev Cancer 2001 ；1(1) :34_45，Malik SN, Brattain M,Ghosh PM, TroyerDA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI. ， Clin Cancer Res. 2002 ；8 (4) 1168-71)。于是，我們研究了 PKIB是否能夠影響Akt磷酸化。首先，用對(duì)應(yīng)于sil的RNA 雙鏈體敲低PKIB在PC細(xì)胞系(LNCaP和PC-3)中的表達(dá)，通過(guò)western印跡分析檢查Akt 在Ser 473位的Akt磷酸化。RNA雙鏈體對(duì)PKIB的敲低得到了 RT-PCR的驗(yàn)證(數(shù)據(jù)未顯 示)。結(jié)果，PKIB敲低顯著影響了 PC細(xì)胞中的Akt磷酸化(圖7A)。而且，如圖7B所示，還 觀(guān)察到，PKIB在PC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)顯著提高Akt在Ser473位的磷酸化。結(jié)果證明，PKIB 直接相互作用于PKA-C激酶，并可能修飾其功能，并且已經(jīng)確認(rèn)，PKA-C激酶過(guò)表達(dá)也會(huì)提 高Akt在Ser473的磷酸化(圖7A)。這些發(fā)現(xiàn)提示，PKIB可能參與PC細(xì)胞中的Akt磷酸 化(Ser473)，可能是通過(guò)修飾PKA-C激酶的功能。接著，如圖冗所示，我們觀(guān)察到，PKIB在PC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可提高Akt磷酸化。 結(jié)果證明PKIB與PKA-C激酶直接相互作用，并可能修飾后者的功能，并且已經(jīng)確認(rèn)，PKA-C 激酶過(guò)表達(dá)也會(huì)提高Akt磷酸化(圖7C)。這些發(fā)現(xiàn)提示，PKIB可能參與Akt磷酸化，可能 是通過(guò)修飾PKA-C激酶。此外，為了確認(rèn)Akt Ser473是否直接被PKA-C和/或PKIB磷酸化，使用重組PKIB、 PKA-C激酶和Akt蛋白進(jìn)行體外激酶測(cè)定。如圖7D所示，當(dāng)PKA-C激酶與重組Akt反應(yīng)時(shí) 磷酸化Ser473特異抗體可檢測(cè)到磷酸化的Akt，而且PKIB的添加顯著提高了 Akt (Ser473) 的磷酸化水平。這提示，PKA-C激酶和PKIB可以直接并且有效地磷酸化Akt Ser473，這有 助于PC細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)和進(jìn)展?！笇?shí)施例91 PC組織中的Akt磷酸化和PKIB過(guò)表汰最后，在臨床PC組織中檢查PKIB表達(dá)與Akt Ser473磷酸化的關(guān)聯(lián)。圖8顯示了 代表性的PC組織圖片，比較PC組織面對(duì)面切片(face-on-faceslide)中PKIB的染色模式 和pAkt (Ser473)的染色模式，表明在該P(yáng)C組織中PKIB表達(dá)和Akt磷酸化具有相關(guān)性。表 2總結(jié)了臨床PC組織中PKIB表達(dá)與Akt磷酸化間的相關(guān)性(P = 0. 0156，卡方檢驗(yàn))。表2臨床組織中PKIB表達(dá)與Akt Ser473磷酸化間的關(guān)聯(lián) (P = 0. 0156，卡方檢驗(yàn))討論
在本發(fā)明中，用臨床HRPC細(xì)胞的全基因組范圍基因表達(dá)譜分析鑒定了兩種前列 腺癌一特別是激素難治性前列腺癌一的分子靶標(biāo)。前列腺癌顯示相對(duì)良好的預(yù)后，激素 耗竭療法(hormone depletion therapy)在大多數(shù)復(fù)發(fā)或晚期PC中有效。但是一旦出現(xiàn) HRPC細(xì)胞，PC患者護(hù)理的選項(xiàng)就非常少了。結(jié)果，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，需要為HRPC患者 鑒定新的分子靶標(biāo)，并通過(guò)靶定這些新分子開(kāi)發(fā)HRPC的新療法。PKIB屬于PKI (蛋白激酶A抑制劑)家族，PKIA能夠抑制蛋白激酶A催化亞基 (PKA-C)的激酶活性，并通過(guò)與PKA-C直接結(jié)合將PKA-C從細(xì)胞核外排到細(xì)胞質(zhì)(Glass DB et al.，J Biol Chem 1986261:12166-71.和 Wen Wet al.，J Biol Chem 1994269 32214-20.)。蛋白激酶A(PKA)、cAMP-依賴(lài)的蛋白激酶A，多被認(rèn)為對(duì)于介導(dǎo)由cAMP引 發(fā)的廣泛的生理和病理作用和與G蛋白的偶聯(lián)至關(guān)重要，有多種配體和受體系統(tǒng)可激 活PKA信號(hào)途徑，并且其激活與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的控制有關(guān)(Tasken K et al. , Physol Review200484 137-67. and Stork PJ et al. , Trends Cell Biol 200212:258-66.)。在前列腺癌中，有多個(gè)報(bào)道提示，它涉及不依賴(lài)雄激素的生長(zhǎng)和神經(jīng)內(nèi)分泌性分 化(Cox ME et al.，J Biol Chem 2000275 :13812_8.)，還有人提出 HRPC細(xì)胞的雄激素非依 賴(lài)性生長(zhǎng)中涉及了 PKA途徑和AR途徑之間的對(duì)話(huà)(cross-talk) (Stork PJ et al.，Trends Cell Biol 200212:258-66.和 Sadar MD, JBiol Chem 1999274:7777-83.)。在本發(fā)明中，已經(jīng)證明PKIB能夠幫助PKA-C的細(xì)胞核定位并促進(jìn)PC細(xì)胞生長(zhǎng)，而 不是像PKI家族成員那樣抑制PKA-C活性或PKA途徑。先前的報(bào)道提示，PKIB在體外具有 一些PKA-C抑制活性，但是其Km比PKIA高得多，并且輔助PKA-C的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入或抑制其細(xì) 胞核導(dǎo)出是PKIB在PC細(xì)胞中的主要功能。而且，PKIB與在CRPC的侵襲和惡性表型中發(fā) 揮關(guān)鍵作用的Akt Ser473磷酸化強(qiáng)烈相關(guān)。NAALADL2是一種新的II型膜蛋白，屬于谷氨酸羧肽酶II (GCPII)家族。GCPII的 前列腺形式，稱(chēng)作前列腺特異膜抗原(PSMA)，在前列腺癌中表達(dá)，并且PSMA的表達(dá)水平增 加與 PC 進(jìn)展和 HRPC 相關(guān)(Rajasekaran AK et al.，Am J Physiol Cell Physiol 2005 288 :C975-81.和 Murphy GP et al.，Prostate200042 :145-9.)?？紤]到其與 PSMA 的同源 性和其相似的表達(dá)模式，這種新型分子NAALADL2應(yīng)當(dāng)稱(chēng)作“PSMA2”。PSMA是一種FDA批準(zhǔn) 的前列腺癌顯像劑一lllln-標(biāo)記的7E 11單克隆抗體(Prostascint，Cytogen，Princeton， NJ)-的靶標(biāo)，并且PSMA被單克隆抗體例如J591靶定，該抗體在臨床試驗(yàn)中用于將成像 劑或治療劑特異遞送到PSMA表達(dá)細(xì)胞(Murphy GP et al.，Prostate 200042 145-9.和 Holmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10:511-9.)。除了充當(dāng)腫瘤標(biāo)志物之外，PSMA具有GPC活性，其底物包括聚_、_谷氨酸葉酸 (Zhou J et al.，Nature Review Drug Disc 20054:1015-26.)。PSMA 的酶活性可用于設(shè) 計(jì)前體藥物，其中藥物的無(wú)活性谷氨酸化形式僅在表達(dá)PSMA的細(xì)胞中被選擇性切割并由 此激活(Denny WA et al.，Eur J Med Chem200136 :577_95.)。然而，PSMA 如何與前列腺 癌進(jìn)程相關(guān)則完全未知，并且靶定PSMA功能或其自身活性的可能性也尚未知曉。NAALADL2 在HRPC細(xì)胞中高表達(dá)，而其在正常成人器官中的表達(dá)則非常有限，如圖2B所示。除了其作 為腫瘤標(biāo)記的限制性表達(dá)之外，它很可能與PC生存力或生長(zhǎng)有關(guān)，這得到了 siRNA實(shí)驗(yàn)的 支持。因此，和腫瘤標(biāo)志一樣，針對(duì)PSMA2的特異單克隆抗體亦可用于通過(guò)阻斷PSMA2活性 進(jìn)行PC治療。
工業(yè)應(yīng)用性人基因PKIB和NAALADL2的表達(dá)在前列腺癌中，特別是激素難治性前列腺癌或去 勢(shì)抵抗性前列腺癌，比正常器官顯著提高。因此，這些基因可以方便地用作前列腺癌診斷標(biāo) 記，借此所編碼的蛋白可以用于前列腺癌的診斷試驗(yàn)。本發(fā)明人證明，細(xì)胞生長(zhǎng)被特異靶定PKIB和NAALADL2基因的雙鏈分子抑制。因 此，這些新的雙鏈分子可用于開(kāi)發(fā)抗癌藥物。例如，阻斷PKIB或NAALADL2蛋白表達(dá)或阻止 其活性的試劑可應(yīng)用為抗癌劑，特別是用于治療前列腺癌，尤其是激素難治性前列腺癌或 去勢(shì)抵抗性前列腺癌，的抗癌劑的治療用途。而且，無(wú)論是PKIB還是NAALADL2多肽均是開(kāi)發(fā)抗癌藥物的有用靶標(biāo)。例如，與 PKIB或NAALADL2結(jié)合、或阻斷PKIB或NAALADL2的表達(dá)或阻止其活性、或者抑制PKIB與 PKA-C結(jié)合的試劑，或者抗-NAALADL2抗體，可用作抗癌劑，特別是用于治療前列腺癌，尤其 是激素難治性前列腺癌或去勢(shì)抵抗性前列腺癌，的抗癌劑。盡管本文對(duì)于本發(fā)明參考其具體的實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)的記載，但是本領(lǐng)域的技 術(shù)人員顯然可以想到，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下可以在其中進(jìn)行各種改變和修 飾。
權(quán)利要求
一種分離的雙鏈分子，它在被導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，在體內(nèi)抑制PKIB或NAALADL2的表達(dá)和細(xì)胞增殖，該雙鏈分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。
2.權(quán)利要求1的雙鏈分子，其中該有義鏈包含與選自SEQID NO :16、17和19的靶序 列對(duì)應(yīng)的序列。
3.權(quán)利要求2的雙鏈分子，其長(zhǎng)度為大約19-大約25個(gè)核苷酸。
4.權(quán)利要求2的雙鏈分子，其由單一多核苷酸組成，該多核苷酸包含通過(guò)間插單鏈連 接在一起的有義鏈和反義鏈。
5.權(quán)利要求4的雙鏈分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’ ]-3’，其中[A]是包含選自 SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3-23個(gè)核苷酸組成的間插單鏈，[A，]是 包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。
6.一種載體，其表達(dá)權(quán)利要求1的雙鏈分子。
7.權(quán)利要求6的載體，其中該雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包 含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組成的間插單鏈， [A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。
8.一種用于治療癌癥的方法，包括施用至少一種分離的雙鏈分子的步驟，該雙鏈分子 抑制PKIB基因或NAALADL2基因在過(guò)表達(dá)該基因的細(xì)胞中的表達(dá)，該雙鏈分子包含有義鏈 和與之互補(bǔ)的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。
9.權(quán)利要求8的方法，其中該有義鏈包含與選自SEQID N0:16、17和19的靶序列對(duì) 應(yīng)的序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該雙鏈分子的長(zhǎng)度為大約19-大約25個(gè)核苷酸。
11.權(quán)利要求8的方法，其中該雙鏈分子由單一多核苷酸組成，該多核苷酸包含通過(guò)間 插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是 包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組成的間插單 鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。
13.權(quán)利要求8的方法，其中該雙鏈分子由載體編碼。
14.權(quán)利要求13的方法，其中由載體編碼的雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’， 其中[A]是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組 成的間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。
15.權(quán)利要求8的方法，其中待治療的癌癥是前列腺癌或激素難治性前列腺癌或去勢(shì) 抵抗性前列腺癌。
16.一種用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種抑制PKIB或NAALADL2的表達(dá)的分離 的雙鏈分子，該雙鏈分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中該有義鏈包括與選自SEQID NO :16、17和19的靶序 列對(duì)應(yīng)的序列。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中該雙鏈分子的長(zhǎng)度為大約19-大約25個(gè)核苷酸。
19.權(quán)利要求16的組合物，其中該雙鏈分子由單一多核苷酸組成，該多核苷酸包含通 過(guò)間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中該雙鏈分子具有通式5’-[幻-[8]-仏’]-3’，其中[A]是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈序列，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組成的 間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。
21.權(quán)利要求16的組合物，其中該雙鏈分子由載體編碼并包含在該組合物中。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中該雙鏈分子具有通式5’_[A]-[B]-[A’ ]_3’，其中[A] 是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個(gè)核苷酸組成的間插 單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。
23.權(quán)利要求16的組合物，其中待治療的癌癥是前列腺癌或激素難治性前列腺癌或去 勢(shì)抵抗性前列腺癌。
24.一種用于診斷前列腺癌的方法，所述方法包括如下步驟(a)通過(guò)選自下組的任何一種方法測(cè)定來(lái)自受試者的生物樣品中基因的表達(dá)水平 (i)檢測(cè)包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1、3或5的序列的mRNA，( )檢測(cè)包含SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和(iii)檢測(cè)包含SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性；和(b)將基因與正常對(duì)照水平相比的表達(dá)水平增加與前列腺癌相關(guān)聯(lián)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢(shì)抵抗性前列腺癌。
26.權(quán)利要求24的方法，其中表達(dá)水平比正常對(duì)照水平高至少10%。
27.權(quán)利要求24的方法，其中通過(guò)檢測(cè)探針與所述來(lái)自受試者的生物樣品的基因轉(zhuǎn)錄 本的雜交來(lái)測(cè)定表達(dá)水平。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該雜交步驟在DNA陣列上進(jìn)行。
29.權(quán)利要求24的方法，其中通過(guò)檢測(cè)抗體與包含氨基酸序列SEQID NO :2或4的蛋 白質(zhì)的結(jié)合來(lái)測(cè)定表達(dá)水平。
30.權(quán)利要求29的方法，其中該抗體與由SEQID NO :32、33或34組成的多肽結(jié)合。
31.權(quán)利要求24的方法，其中該來(lái)自受試者的生物樣品包括活檢物、痰、血液或尿。
32.—種抗體，其結(jié)合包含SEQ ID NO 33或34的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
33.一種用于檢測(cè)前列腺癌的組合物，其含有結(jié)合包含氨基酸序列SEQ IDNO :2或4的 蛋白質(zhì)的抗體。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中該抗體結(jié)合SEQID NO :32，33或34。
35.篩選可用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使測(cè)試化合物與由PKIB或NAALADL2多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測(cè)所述多肽與測(cè)試化合物之間的結(jié)合活性；和(c)選擇與所述多肽結(jié)合的測(cè)試化合物。
36.一種篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使測(cè)試化合物與由PKIB或NAALADL2多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測(cè)步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)選擇這樣的測(cè)試化合物與不存在該測(cè)試化合物時(shí)檢測(cè)到的由PKIB或NAALADL2 多核苷酸編碼的多肽的生物活性相比，該化合物可抑制所述多肽的生物活性。
37.權(quán)利要求36的方法，其中該生物活性是易化細(xì)胞增殖或PKA-C核積累活性。
38.一種篩選可用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使候選化合物與表達(dá)PKIB或NAALADL2的細(xì)胞接觸；(b)選擇如下的候選化合物，與不存在該測(cè)試化合物時(shí)檢測(cè)到的PKIB或NAALADL2表達(dá) 水平相比，該化合物可抑制所述表達(dá)水平。
39.一種篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使候選化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包括PKIB或NAALADL2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的控制下表達(dá)的報(bào)告基因；(b)測(cè)量所述報(bào)告基因的表達(dá)或活性；和(c)選擇與對(duì)照相比可降低所述報(bào)告基因的表達(dá)或活性水平的候選化合物。
40.一種篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)在測(cè)試化合物的存在下，使PKIB多肽或其功能等價(jià)物與PKA-C多肽或其功能等價(jià) 物接觸；(b)檢測(cè)所述多肽之間的結(jié)合；和(c)選擇可抑制所述多肽之間結(jié)合的測(cè)試化合物。
41.權(quán)利要求40的方法，其中PKIB多肽的功能等價(jià)物包括由SEQID NO 31組成的多肽。
42.權(quán)利要求40的方法，其中PKA-C多肽的功能等價(jià)物包含PKIB結(jié)合域的氨基酸序列。
43.一種篩選用于治療或預(yù)防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)在適合Akt被PKIB多肽磷酸化并有測(cè)試化合物存在的條件下溫育PKIB多肽或其 功能等價(jià)物、PKA-C多肽或其功能等價(jià)物、以及Akt ；(b)檢測(cè)Akt的磷酸化水平；和(c)將步驟(b)中測(cè)得的Akt的磷酸化水平與對(duì)照水平進(jìn)行比較；(d)選擇與對(duì)照水平相比降低Akt磷酸化水平的化合物。
44.權(quán)利要求43的方法，其中在SEQID NO 35氨基酸序列的第473位絲氨酸殘基處 檢測(cè)Akt的磷酸化水平。
45.權(quán)利要求43的方法，其中在細(xì)胞中表達(dá)PKIB多肽或其功能等價(jià)物、PKA-C多肽或 其功能等價(jià)物、以及Akt，并且通過(guò)使細(xì)胞或其裂解物與測(cè)試化合物接觸而將它們?cè)跍y(cè)試化 合物存在下進(jìn)行溫育。
46.權(quán)利要求35、36、38、39、40和43的方法，其中前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去 勢(shì)抵抗性前列腺癌。
全文摘要
本發(fā)明的特色是用于檢測(cè)前列腺癌，特別是激素難治性前列腺癌(HRPC)或去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)的方法，所述方法系通過(guò)檢測(cè)與正常器官相比PKIB或NAALADL2的過(guò)表達(dá)來(lái)檢測(cè)前列腺癌。還公開(kāi)了鑒定用于治療和預(yù)防前列腺癌(包括HRPC)的化合物的方法，所述方法系基于PKIB或NAALADL2在前列腺癌中的過(guò)表達(dá)、PKIB或NAALADL2的細(xì)胞增殖功能、PKIB或NAALADL2的細(xì)胞內(nèi)定位或PKIB與PKA-C之間的相互作用來(lái)鑒定化合物。另外，提供了通過(guò)施用針對(duì)PKIB或NAALADL2基因的雙鏈分子來(lái)治療前列腺癌的方法。本發(fā)明還提供了產(chǎn)品，包括雙鏈分子和編碼它們的載體，以及包含可用于本發(fā)明所提供方法的分子或載體的組合物。
文檔編號(hào)A61K31/70GK101855346SQ20088010985
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日
發(fā)明者中川英刀, 中村佑輔, 中鶴修一 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司