專利名稱：利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè) 定的方法。
二背景技術(shù)：
納米結(jié)構(gòu)氧化鋅除了獨(dú)特的半導(dǎo)體光電特性之外，還具有對(duì)生物安全無(wú)毒、 具有優(yōu)良的生物兼容性、能與蛋白質(zhì)等生物分子以氫鍵或其他方式螯合并能很好 的保持其生物活性、具有較高等電點(diǎn)等優(yōu)異的性能，這使其在生物/化學(xué)傳感器方 面具有重要的應(yīng)用。
目前，低濃度抗原的檢測(cè)是臨床醫(yī)學(xué)和診斷學(xué)面臨的重要課題。能成功檢測(cè) 低濃度的抗原，可以為相應(yīng)的疾病早期診斷和治療提供科學(xué)的依據(jù)。抗原濃度檢 測(cè)的傳統(tǒng)手段是先進(jìn)行病毒培養(yǎng)以提高疾病抗原的濃度，然后輔以光化學(xué)檢測(cè)法 或其他檢測(cè)方法確定抗原濃度并推算出原始濃度。這種方法的局限性在于其周期 長(zhǎng)，精確度差等，可能延誤疾病的發(fā)現(xiàn)和最佳治療時(shí)機(jī)。利用納米材料構(gòu)建生物/ 化學(xué)傳感器進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)抗原的方法因其檢測(cè)限低、檢測(cè)快速、選擇性好等優(yōu) 點(diǎn)正逐漸受到越來(lái)越多的重視，但由于早期疾病期相應(yīng)抗原的濃度極低，因此如 何使低濃度的抗原產(chǎn)生明顯的檢測(cè)信號(hào)是這種方法亟待解決的重要問題之一 。
三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)缺陷，提供一種利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫 測(cè)定的方法。該方法利用多層組裝的生物化學(xué)傳感器4全測(cè)低濃度抗原，對(duì)相應(yīng)抗 原的檢測(cè)限低、選擇性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好。
技術(shù)方案在本發(fā)明中，利用簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)把氧化鋅納米棒直接生長(zhǎng)在經(jīng) 過處理的金電極表面，得到了形貌均勻，尺度均一且與電極材料結(jié)合牢固的納米 氧化鋅電極，在氧化鋅納米棒上組裝抗體。同時(shí)在氧化鋅量子點(diǎn)上多層組裝辣根 過氧化物酶，并在最外層組裝相應(yīng)抗體。在特定濃度的待測(cè)抗原溶液中，使量子 點(diǎn)上的抗體和氧化鋅納米棒上的抗體均與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，把組裝有辣根過 氧化物酶的量子點(diǎn)連接到電極上的氧化鋅納米棒上，形成生物/化學(xué)傳感器。然后檢測(cè)辣根過氧化物酶對(duì)過氧化氫催化的電化學(xué)信號(hào)建立抗原濃度與電化學(xué)信號(hào)之 間的關(guān)系，從而確定待測(cè)抗原濃度。本發(fā)明的技術(shù)解決方案為
一種利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法，測(cè)定步驟為
第一步將直徑0.3-0.7毫米的電才及金屬絲一端燒熔成一個(gè)直徑0.8 1.2毫米 的小球，再在小球表面蒸鍍一層100~300納米厚的鋅，；改在管式爐里在 250 350。C氧化30~60分鐘，取出后用L5 2.5M KOH溶液煮沸1~3小時(shí)，取出 后用去離子水清洗，再放置于含&02體積百分?jǐn)?shù)為10% 30%的H2S04中30~60 分鐘后取出，再用去離子水清洗，室溫干燥；
第二步將鋅粉末和去離子水混合超聲10~20分鐘，靜置30 60分鐘，傾去 水，把鋅粉末和水按質(zhì)量比0.5~1 : 100混合轉(zhuǎn)移至高壓釜中，靜置至無(wú)懸浮顆 粒，將第一步處理過的電極金屬絲浸入水中，不觸及沉在高壓釜底部的鋅粉，密 封，使其能承受最大壓力不小于1.5 x 105 Pa，加熱至80~95°C，保持6~15小時(shí)， 自然冷卻至室溫，取出，用去離子水清洗，得到生長(zhǎng)有納米氧化鋅的電極；
第三步利用氧化鋅PI = 9.4的高等電點(diǎn)把第二步制得的電極在中性條件下 浸入含有0.2~0.8 M NaCl的1 2mg/mL聚笨乙烯磺酸鈉溶液中1~4小時(shí)，取出用 去離子水清洗，再在30 37。C時(shí)浸入0.01 0.02mg/mL的抗體溶液中1~3小時(shí)，去 離子水清洗后即得組裝抗體的氧化鋅納米棒電極；
第四步配制0.01~0.1M醋S交鋅的乙醇溶液，攪拌加入聚乙烯吡咯烷酮，加 入量為0.1~1克聚乙烯吡咯烷酮/10mL溶液，得到量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液，40~60°C 時(shí)攪拌滴加與量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液等體積的0.05~0.5M氫氧化鈉乙醇溶液，添加完 畢后恒溫?cái)嚢?~2小時(shí)，離心分離，用乙醇和去離子水交替清洗得氧化鋅量子 點(diǎn)；
第五步按0.2~2mg/mL的比例將第四步制得的氧化鋅量子點(diǎn)分散到含 0.2~0.8 M NaCl的l~2mg/mL聚苯乙烯磺酸鈉溶液中，超聲分散30 60分鐘，離 心分離，用水清洗后加1 2mg/mL辣根過氧化物酶溶液200微升，搖振2~6小 時(shí)，離心分離，用水清洗；
第六步重復(fù)第五步3~5次，得多層修飾量子點(diǎn)，向量子點(diǎn)中加入 l~2mg/mL含0.2~0.8 M NaCl的的聚苯乙烯磺酸鈉溶液1毫升，搖振1 2小時(shí)， 用水清洗后加0.01~0.02mg/mL的抗體溶液200微升，30 37。C搖振1~3小時(shí)，離 心分離，用水清洗后得修飾有抗體的多層組裝辣根過氧化物酶的氧化鋅量子點(diǎn)；
第七步將第六步制得的量子點(diǎn)分散到1毫升0.1納克/毫升~1纟鼓克/毫升的 抗原溶液中，并將第三步制得的電極浸入此抗原溶液中，30 37。C溫育20~30分 鐘，^^出用水清洗得；第八步將第七步制得的電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，銀/氯化 銀電極作為參比電極，組成三電極體系，用pH = 7的0.01 ~0.1M磷酸氫鈉、磷 酸二氫鈉緩沖溶液作為電解液構(gòu)建生物/化學(xué)傳感器，連接電化學(xué)工作站，檢測(cè)得 到辣根過氧化物酶對(duì)雙氧水的催化電化學(xué)信號(hào)。
上述利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法，還包括;險(xiǎn)測(cè)得到辣根過氧化物 酶對(duì)雙氧水的催化電化學(xué)信號(hào)后，改變第七步中抗原的濃度，重復(fù)第七步和第八 步，建立修飾的工作電極對(duì)加入雙氧水前后的時(shí)間電流響應(yīng)曲線在200秒時(shí)的差 值與抗原濃度之間的線性關(guān)系，此線性關(guān)系可以為用此發(fā)明的方法進(jìn)行臨床檢測(cè) 提供濃度判定的參考依據(jù)，是本發(fā)明方法中的最重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)利用本發(fā)明 方法進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的臨床檢測(cè)有著極其重要的意義。
上述抗體為肝癌首選標(biāo)志物a-胎蛋白，所述抗原為肝癌補(bǔ)充標(biāo)志物癌胚抗 原或胰腺癌首選標(biāo)志物血清糖鏈抗原。
上述電極金屬絲為金絲或鉑絲。
有益效果本方法中利用在量子點(diǎn)上層層組裝辣根過氧化物酶，然后在外層 組裝上抗體。同時(shí)在金電極上生長(zhǎng)氧化鋅納米棒，在氧化鋅納米棒上也組裝抗 體。然后通過抗體和抗原的特異結(jié)合使待測(cè)抗原和量子點(diǎn)上的抗體與氧化鋅納米 棒上的抗體結(jié)合，用極少量的抗原把組裝有大量辣根過氧化物酶的量子點(diǎn)連接到 納米氧化鋅金電極上，然后檢測(cè)辣根過氧化物酶對(duì)過氧化氫催化的電化學(xué)響應(yīng)， 建立起抗原濃度和辣根過氧化物酶對(duì)過氧化氫催化的電化學(xué)信號(hào)之間的關(guān)系。
通過這種檢測(cè)方法，使極低濃度的抗原即能產(chǎn)生明顯的電化學(xué)催化信號(hào)，起 到了信號(hào)放大的作用。這在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病早期檢測(cè)方面有著重要的意義。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明氧化鋅納米材料電極制備工藝及設(shè)備簡(jiǎn)單，只需要普通的100mL聚
四氟乙烯高壓釜即可。生長(zhǎng)溫度低，溫度低于95°C。沒有異種雜質(zhì)離 子，整個(gè)反應(yīng)體系只有鋅或氧化鋅和水，不會(huì)引入異種雜質(zhì)缺陷。
2. 本發(fā)明制備的納米氧化鋅棒與氧化鋅量子點(diǎn)尺寸均一，形貌均勻，條件可
控，可重復(fù)性強(qiáng)。
3. 本發(fā)明以所制備的氧化鋅量子點(diǎn)及納米氧化鋅電極為基礎(chǔ)，采用了生物分
子的多層組裝技術(shù)，構(gòu)建的生物化學(xué)傳感器對(duì)抗原濃度檢測(cè)靈敏度高， 檢測(cè)限低，時(shí)間響應(yīng)快，穩(wěn)定性好。
4. 本發(fā)明利用氧化鋅具有良好的生物兼容性等特點(diǎn)在氧化鋅量子點(diǎn)上多層組
裝辣根過氧化物酶，利用抗體和抗原的特異結(jié)合有效的把組裝大量酶的量子點(diǎn)連接到氧化鋅金電極上構(gòu)建生物/化學(xué)傳感器，成功的起到了增強(qiáng) 信號(hào)的作用。降低了抗原的檢測(cè)限，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
四

圖1本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2運(yùn)用本發(fā)明的測(cè)試技術(shù)利用四層HRP組裝的量子點(diǎn)進(jìn)行AFP抗原測(cè)試 得出的抗原濃度與加過氧化氫前后時(shí)間電流曲線在第200秒的電流差的線性關(guān)系 圖。橫坐標(biāo)為AFP抗原濃度，單位為ng/mL,縱坐標(biāo)為加過氧化氫前后時(shí)間電流 曲線在第200秒的電流差，單位pA。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
第一步在金絲或鉑絲一端燒熔成一個(gè)小球，再在小球表面蒸鍍一層約200 納米厚的鋅，放在管式爐里在30(TC左右氧化1小時(shí)，取出后用2M KOH煮沸2 小時(shí)，取出后用去離子水清洗，再放置于含30%(體積比)11202的H2S04中30分 鐘后取出，再用去離子水清洗，室溫千燥。
第二步將鋅粉末和去離子水混合超聲20分鐘，靜置30分鐘，傾去水，把 鋅粉末和水按i : ioo (質(zhì)量比)混合轉(zhuǎn)移至高壓釜中，靜置至無(wú)懸浮顆粒，將第 一步處理過的金或鉑浸入水中，不觸及高壓釜底部的鋅粉。密封，使其能承受最 大壓力不小于1.5 x 105 Pa,加熱至80。C 95。C,保持12小時(shí)。自然冷卻至室溫， 取出，用去離子水清洗，得到生長(zhǎng)有直徑60 200納米氧化鋅的電極。
第三步利用氧化鋅的高等電點(diǎn)(PI = 9.4)把第二步制得的電極在中性條件 下浸入含有0.5 M NaCl的1毫克/毫升PSS溶液中50分鐘，取出用去離子水清 洗，再在30。C時(shí)浸入0.012毫克/毫升的抗體溶液中2小時(shí)，清洗。再在0.01毫 克/毫升的牛血清蛋白(BSA)溶液中浸30分鐘，清洗。即得組裝抗體的氧化鋅 納米棒電極，此電極在不用時(shí)放置冰箱中4。C保存。
第四步將醋酸鋅溶于乙醇溶液中制成20毫升0.1M溶液，攪拌加入2克聚 乙烯吡咯烷酮，得到量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液。40 60。C時(shí)劇烈攪拌滴加20毫升0.5M 氫氧化鈉乙醇溶液。滴加完畢衡溫?cái)嚢?~2小時(shí)。離心分離，用乙醇清洗三 次，水洗三次，得氧化鋅量子點(diǎn)。
第五步在1毫升含0.5 M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液中加入1毫克第 四步制得的氧化鋅量子點(diǎn)，超聲分散30分鐘，離心分離，用水洗兩次。再加200 微升1毫克/毫升的辣根過氧化物酶溶液，搖振2小時(shí)，離心分離，用水洗兩次。第六步重復(fù)第五步3~5次，得多層修飾量子點(diǎn)。向量子點(diǎn)中加入1毫升 含0.5 M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液，搖振2小時(shí)，用水洗兩次，力口 200微 升0.012毫克/毫升的抗體溶液30。C搖振2小時(shí)，離心分離，用水洗兩次，力口 200 微升0.01毫克/毫升BSA搖振30分鐘，離心分離，用水洗兩次。得修飾有抗體 的多層組裝#束#>過氧化物酶的氧化鋅量子點(diǎn)。
第七步將第六步制得的量子點(diǎn)分散到1毫升特定濃度的抗原溶液中，并將 第三步制得的電極浸入此抗原溶液中，35。C溫育30分鐘，取出用水清洗。
第八步將第七步制得的電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，銀/氯化 銀電極作為參比電極，利用電化學(xué)工作站檢測(cè)辣根過氧化物酶對(duì)雙氧水的催化電 化學(xué)信號(hào)。
第九步改變抗原濃度，重復(fù)第七步和第八步，建立辣才艮過氧化物酶對(duì)雙氧 水催化電化學(xué)信號(hào)與抗原濃度之間的關(guān)系。
實(shí)施例2:
第一步將直徑0.5毫米的金絲的一端燒熔成一個(gè)直徑約1.2毫米的小球， 在小球表面蒸鍍一層約200納米厚的鋅，放入管式爐里300'C氧化1小時(shí)，取出 后用2M KOH煮沐2小時(shí)，取出后用去離子水清洗，再放置于含30%H2O2的 H2S04(體積比)中30分鐘后耳又出，再用去離子水清洗。
第二步將鋅粉末和去離子水混合超聲20分鐘，靜置30分鐘，傾去水，把 鋅粉末和水按1 : 100 (質(zhì)量比)混合轉(zhuǎn)移至高壓釜中，靜置至無(wú)懸浮顆粒，將第 一步處理過的金絲浸入水中，不觸及高壓釜底部的鋅粉。密封，使其能承受最大 壓力不小于1.5 x 105 Pa,加熱至9(TC,保持12小時(shí)。自然冷卻至室溫，取出， 用去離子水清洗，得到生長(zhǎng)有直徑約IOO納米氧化鋅棒的電極。
第三步將上步所得電極浸入含有0.5 M NaCl的1毫克/毫升PSS溶液中50 分鐘，取出用去離子水清洗，再在30。C時(shí)浸入0.012毫克/毫升的肝癌首選標(biāo)志物 a-月臺(tái)蛋白(AFP)抗體溶液中2小時(shí)，清洗，再在O.Ol毫克/毫升BSA溶液中浸 泡30分鐘，清洗。即得組裝有AFP抗體的氧化鋅納米才奉電極，此電極在不用時(shí) 放置冰箱中4'C保存。
第四步將醋S臾鋅溶于乙醇溶液中制成20毫升0.1M溶液，攪拌加入2克聚 乙烯吡咯烷酮，得到量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液。40 60。C時(shí)劇烈攪拌滴加20毫升0.5M 氫氧化鈉乙醇溶液。滴加完畢衡溫?cái)嚢?~2小時(shí)。離心分離，用乙醇清洗三 次，水洗三次，得直徑約IO納米的氧化鋅量子點(diǎn)。第五步在1毫升含0.5 M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液中加入1毫克第 四步制得的氧化鋅量子點(diǎn)，超聲分散30分鐘，離心分離，用水洗兩次。再加200 微升1毫克/毫升的辣根過氧化物酶溶液，搖振2小時(shí)，離心分離，用水洗兩次。
第六步分別重復(fù)第五步2 5次，得系列1~4層修飾量子點(diǎn)。向量子點(diǎn)中加 入1毫升含0.5 M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液，搖振2小時(shí)，用水洗兩次， 加200微升0.012毫克/毫升的AFP抗體溶液3(TC搖振2小時(shí)，離心分離，用水 洗兩次，再加200微升0.01毫克/毫升BSA溶液搖振30分鐘。離心分離，用水 洗兩次。得系列修飾有抗體的多層組裝l束根過氧化物酶的氧化鋅量子點(diǎn)。
第七步將第六步制得的量子點(diǎn)分別分散到1毫升濃度分別為100納克/毫升 AFP抗原溶液中，并將第三步制得的電極浸入此抗原溶液中，35。C溫育30分 鐘，取出用水清洗。
第八步將第七步制得的一系列電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極， 銀/氯化銀電極作為參比電極，利用電化學(xué)工作站(CHI660C)檢測(cè)辣根過氧化物 酶對(duì)5mM雙氧水的催化電化學(xué)信號(hào)，記錄加入過氧化氫前后的時(shí)間電流曲線在 200秒時(shí)的電流值的差值。
第九步建立量子點(diǎn)^"飾層數(shù)與加入5mM雙氧水前后時(shí)間電流曲線在200 秒時(shí)的差值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)修飾層數(shù)從1 4層時(shí)電流差值接近線性增加，大于 4層時(shí)增加趨勢(shì)減緩。
實(shí)施例3:
第一步將直徑0.5毫米的金絲的一端燒熔成一個(gè)直徑約1.2毫米的小球， 在小球表面蒸鍍一層約200納米厚的鋅，放入管式爐里30(TC氧化1小時(shí)，取出 后用2M KOH煮沸2小時(shí)，取出后用去離子水清洗，再放置于含30%H2O2的 H2S04(體積比)中30分鐘后耳又出，再用去離子水清洗。
第二步將鋅粉末和去離子水混合超聲20分鐘，靜置30分鐘，傾去水，把 鋅粉末和水按1 : 100 (質(zhì)量比)混合轉(zhuǎn)移至高壓釜中，靜置至無(wú)懸浮顆粒，將第 一步處理過的金絲浸入水中，不觸及底部的鋅粉。密封，加熱至90°C，保持12 小時(shí)。自然冷卻至室溫，取出，用去離子水清洗，得到生長(zhǎng)有直徑約100納米氧 化鋅棒的電極。
第三步將上步所得電極浸入含有0.5 M NaCl的1毫克/毫升PSS溶液中50 分鐘，取出用去離子水清洗，再在3(TC時(shí)浸入0.012毫克/毫升的肝癌首選標(biāo)志物 a-胎蛋白(AFP)抗體溶液中2小時(shí)，清洗，再在0.01毫克/毫升BSA溶液中浸泡30分鐘，清洗。即得組裝有AFP抗體的氧化鋅納米棒電極，此電極在不用時(shí) 放置冰箱中4。C保存。
第四步將醋酸鋅溶于乙醇溶液中制成20毫升0.1M溶液，攪拌加入2克聚 乙烯吡咯烷酮，得到量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液。40 60。C時(shí)劇烈攪拌滴加20毫升0.5M 氫氧化鈉乙醇溶液。滴加完畢衡溫?cái)嚢?~2小時(shí)。離心分離，用乙醇清洗三 次，水洗三次，得直徑約IO納米的氧化鋅量子點(diǎn)。
第五步在1毫升含0.5 M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液中加入1毫克第 四步制得的氧化鋅量子點(diǎn)，超聲分散30分鐘，離心分離，用水洗兩次。再加200 微升1毫克/毫升的辣根過氧化物酶溶液，搖振2小時(shí)，離心分離，用水洗兩次。
第六步重復(fù)第五步4次，得4層修飾量子點(diǎn)。向量子點(diǎn)中加入1毫升含 0.5 M NaCl的1毫克/毫升的PSS溶液，搖振2小時(shí)，用水洗兩次，力口 200微升 0.012毫克/毫升的AFP抗體溶液30。C搖振2小時(shí)，離心分離，用水洗兩次，再加 200微升0.01毫克/毫升BSA溶液搖振30分鐘。離心分離，用水洗兩次。得修飾 有抗體的多層組裝辣根過氧化物酶的氧化鋅量子點(diǎn)。
第七步將第六步制得的量子點(diǎn)分別分散到1毫升濃度分別為0納克/毫升、 l納克/毫升、5納克/毫升、50納克/毫升、100納克/毫升、200納克/毫升、400納 克/毫升、600納克/毫升、800納克/毫升、1000納克/毫升AFP抗原溶液中，并將 第三步制得的電極浸入此抗原溶液中，35。C溫育30分鐘，取出用水清洗。
第八步將第七步制得的一系列電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極， 銀/氯化銀電極作為參比電極，利用電化學(xué)工作站(CHI660C )檢測(cè)辣根過氧化物 酶對(duì)5mM雙氧水的催化電化學(xué)信號(hào)，記錄加入過氧化氫前后的時(shí)間電流曲線在 200秒時(shí)的電流值的差值。
第九步建立抗原濃度與加入5mM雙氧水前后時(shí)間電流曲線在200秒時(shí)的 差值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算其線性范圍的線性斜率確定對(duì)抗原濃度^f企測(cè)的靈敏度。計(jì) 算結(jié)果其靈敏度為0.1微安/納克/毫升。檢測(cè)限為0.2納克/毫升。曲線在AFP抗 原濃度在5納克/毫升到600納克/毫升之間顯示良好的線性關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法，其特征在于測(cè)定步驟為第一步將直徑0.3～0.7毫米的電極金屬絲一端燒熔成一個(gè)直徑0.8～1.2毫米的小球，再在小球表面蒸鍍一層100～300納米厚的鋅，放在管式爐里在250～350℃氧化30～60分鐘，取出后用1.5～2.5M KOH溶液煮沸1～3小時(shí)，取出后用去離子水清洗，再放置于含H2O2體積百分?jǐn)?shù)為10％～30％的H2SO4中30～60分鐘后取出，再用去離子水清洗，室溫干燥；第二步將鋅粉末和去離子水混合超聲10～20分鐘，靜置30～60分鐘，傾去水，把鋅粉末和水按質(zhì)量比0.5～1∶100混合轉(zhuǎn)移至高壓釜中，靜置至無(wú)懸浮顆粒，將第一步處理過的電極金屬絲浸入水中，不觸及沉在高壓釜底部的鋅粉，密封，使其能承受最大壓力不小于1.5×105Pa，加熱至80～95℃，保持6～15小時(shí)，自然冷卻至室溫，取出，用去離子水清洗，得到生長(zhǎng)有納米氧化鋅的電極；第三步利用氧化鋅PI＝9.4的高等電點(diǎn)把第二步制得的電極在中性條件下浸入含有0.2～0.8M NaCl的1～2mg/mL聚苯乙烯磺酸鈉溶液中1～4小時(shí)，取出用去離子水清洗，再在30～37℃時(shí)浸入0.01～0.02mg/mL的抗體溶液中1～3小時(shí)，去離子水清洗后即得組裝抗體的氧化鋅納米棒電極；第四步配制0.01～0.1M醋酸鋅的乙醇溶液，攪拌加入聚乙烯吡咯烷酮，加入量為0.1～1克聚乙烯吡咯烷酮/10mL溶液，得到量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液，40～60℃時(shí)攪拌滴加與量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液等體積的0.05～0.5M氫氧化鈉乙醇溶液，添加完畢后恒溫?cái)嚢?～2小時(shí)，離心分離，用乙醇和去離子水交替清洗得氧化鋅量子點(diǎn)；第五步按0.2～2mg/mL的比例將第四步制得的氧化鋅量子點(diǎn)分散到含0.2～0.8M NaCl的1～2mg/mL聚苯乙烯磺酸鈉溶液中，超聲分散30～60分鐘，離心分離，用水清洗后加1～2mg/mL辣根過氧化物酶溶液200微升，搖振2～6小時(shí)，離心分離，用水清洗；第六步重復(fù)第五步3～5次，得多層修飾量子點(diǎn)，向量子點(diǎn)中加入1～2mg/mL含0.2～0.8M NaCl的的聚苯乙烯磺酸鈉溶液1毫升，搖振1～2小時(shí)，用水清洗后加0.01～0.02mg/mL的抗體溶液200微升，30～37℃搖振1～3小時(shí)，離心分離，用水清洗后得修飾有抗體的多層組裝辣根過氧化物酶的氧化鋅量子點(diǎn)；第七步將第六步制得的量子點(diǎn)分散到1毫升0.1納克/毫升～1微克/毫升的抗原溶液中，并將第三步制得的電極浸入此抗原溶液中，30～37℃溫育20～30分鐘，取出用水清洗得；第八步將第七步制得的電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀電極作為參比電極，組成三電極體系，用pH＝7的0.01～0.1M磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉緩沖溶液作為電解液構(gòu)建生物/化學(xué)傳感器，連接電化學(xué)工作站，檢測(cè)得到辣根過氧化物酶對(duì)雙氧水的催化電化學(xué)信號(hào)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法，其特征在于 還包括檢測(cè)得到辣根過氧化物酶對(duì)雙氧水的催化電化學(xué)信號(hào)后，改變第七步中抗 原的濃度，重復(fù)第七步和第八步，建立修飾的工作電極對(duì)加入雙氧水前后的時(shí)間 電流響應(yīng)曲線在200秒時(shí)的差值與抗原濃度之間的線性關(guān)系。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法，其特征在于 所述抗體為肝癌首選標(biāo)志物a-胎蛋白，所述抗原為肝癌補(bǔ)充標(biāo)志物癌胚抗原或 胰腺癌首選標(biāo)志物血清糖寺連抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化鋅量子點(diǎn)進(jìn)行免疫測(cè)定的方法，其特征在于 步驟一中所述電極金屬絲為金絲或鉑絲。
全文摘要
本方法中利用在量子點(diǎn)上層層組裝辣根過氧化物酶，然后在外層組裝上抗體。同時(shí)在金電極上生長(zhǎng)氧化鋅納米棒，在氧化鋅納米棒上也組裝抗體。然后通過抗體和抗原的特異結(jié)合使待測(cè)抗原和量子點(diǎn)上的抗體與氧化鋅納米棒上的抗體結(jié)合，用極少量的抗原把組裝有大量辣根過氧化物酶的量子點(diǎn)連接到納米氧化鋅金電極上，然后檢測(cè)辣根過氧化物酶對(duì)過氧化氫催化的電化學(xué)響應(yīng)，建立起抗原濃度和辣根過氧化物酶對(duì)過氧化氫催化的電化學(xué)信號(hào)之間的關(guān)系。通過這種檢測(cè)方法，使極低濃度的抗原即能產(chǎn)生明顯的電化學(xué)催化信號(hào)，起到了信號(hào)放大的作用。這在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的疾病早期檢測(cè)方面有著重要的意義。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101526531SQ200910030370
公開日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者劉松琴, 徐春祥, 朱光平, 谷保祥, 陳麗媛 申請(qǐng)人:東南大學(xué)