專利名稱：一種對蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種對蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的分子檢測方法，屬于微生物生態(tài)學領域。

背景技術：
微生物在許多國民經濟生產部門中具有重要地位，如生物醫(yī)學工程(動物、人體保健)、生物農藥(植物內生菌)、輕工業(yè)和環(huán)境保護、水產養(yǎng)殖等領域都利用微生物進行生產活動。多數情況下，這些部門的生產活動依賴的是多種微生物所組成的微生物菌群整體功能。長期以來，這些利用微生物生態(tài)系統(tǒng)進行生產活動的許多行業(yè)部門，由于受到傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術的限制，無法全面、客觀地認識系統(tǒng)中的群落成員，更無法動態(tài)跟蹤系統(tǒng)成員種群數量變化對系統(tǒng)功能的影響，生產效率低，而且不穩(wěn)定。
水產養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)也是與微生物菌群有著密切聯系，水中微生物的生態(tài)情況直接影響水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，包括對魚蝦等疾病防治及其生長發(fā)育的影響。近年，國內外在水產養(yǎng)殖中對水的生態(tài)環(huán)境，特別是微生物生態(tài)環(huán)境和水生動物(魚蝦等)體的微生物情況(微生態(tài)環(huán)境)，因致病性細菌和病毒等引起魚蝦等疾病的流行，而受到重視。但是多側重于有害微生物研究，特別是病原菌的研究，并且傳統(tǒng)的分離菌種方法有其局限性，只有一部分能被培養(yǎng)，進行微生物多樣性分析時其結果往往是局限的，不能準確地反映混合菌群的組成和多樣性，對于一些培養(yǎng)條件較苛刻或許多不可培養(yǎng)微生物都無法預知，因此用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所得到的調查結果不能準確反應微生物菌群的組成情況，建立和發(fā)展一種不依賴微生物培養(yǎng)的方法進行微生物菌群結構研究是必要。
近年，隨著分子生物學技術如分子雜交、PCR、核酸測序等的發(fā)展，微生物學研究領域發(fā)生了深刻的變革，靈敏的檢測和精確的細菌鑒定成為可能。借助分子生物學方法進行特異微生物的快速檢測和鑒定已成為現代微生物診斷和生態(tài)學研究的重要手段。上世紀80年代末至90年代以來，分子生物學技術開始被廣泛應用于微生物菌群結構分析，且發(fā)展迅速，研究熱點主要集中于具有保守序列的16S rRNA上。研究方法包括分子雜交法、PCR法、SSCP法、DGGE法、RFLP和克隆文庫法等，具有很高的靈敏性，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法或其它不依賴培養(yǎng)技術的方法相比有明顯的優(yōu)越性，推動了微生物菌群結構研究的快速發(fā)展。但是，這些基于PCR的方法可能會在擴增反應中引入誤差，降低所得到信息的精確度，并且實際工作中，用單一的分子生態(tài)學方法并不能完全達到預期的目的，并且每一種方法都有自身的不足，常常要結合運用多種分子生態(tài)學方法，有時甚至要結合傳統(tǒng)方法，才能夠對復雜環(huán)境的微生態(tài)系統(tǒng)進行全面的分析。
微生物生態(tài)學和微生態(tài)學研究結果，使人們認識到水體中有益微生物對改善水質、防治魚蝦疾病和提高產量有著重要作用。Susan E，Pryde，Anyhony J.Richardson，Colin S.Stewart，and Harry J.Flint.1999.Molecular Anyalysia of the Microbial Diversity Present in the Colonic Wall，Colonic Lumen，and Cecal Lumen of a Pig.Appl.Environ.Microbiol，655372-5377用于微生物菌群結構分析的基因組DNA信息包括16SrDNA(核糖體小亞基基因)，包含了相應細菌種類的系統(tǒng)分類地位信息，以16S rDNA為對象可以準確地分析微生物菌群的結構組成。一種常用的就是構建基因文庫，通過分析一定數量的克隆子的序列以及它們的出現頻率，可以在一定程度上了解環(huán)境樣品中的主要菌群及其出現豐度等種群結構信息。但這種方法需要進行克隆、測序等水平的工作，耗費人力、財力和時間都較大，難以用于實際生產需要。另外，又發(fā)現了常用的依賴16S rDNA-DGGE技術Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complexmicrobial population by denaturing gradient gel electrophoresia analysis of polymerase chainreaction-amplified genes encoding for 16S rRNA..Applied Environmental Microbiology，1993，59(3)695-700。但這種分子檢測方法一般只能分析500bp個堿基對以下的DNA片段，得到的系統(tǒng)進化相關信息很少，其圖譜一般只有一二十個條帶，系統(tǒng)中弱勢菌不能被檢測到，條件要求相對苛刻，DGGE電泳條件不一樣，即使相同的樣品所得到的圖譜也有差異，到后期切割回收膠建立基因克隆文庫，然后進行測序，因此也不是快捷，耗費人力、物力，并且當微生物種類過多時，同一條帶可以包含多個種類的DNA信息，因此，不能做到在較高的分辨率下分析比較微生物菌群結構的差異。目前基于16S rRNA擴增的還有RFLP技術，從環(huán)境樣品中提取總的DNA，用通用引物擴增16S rDNA，用各種限制性內切酶對擴增產物進行酶切分析，由于不同的菌群內微生物種類組成不同，其酶切圖譜不同，這樣就可以得到反映微生物菌群結構組成的DNA凝膠電泳圖譜，但這種方法需要多種酶切過程，克隆，比較費時，并且只是一種半定量或定性分析，對于圖譜相似的菌群，其組成不一定相同。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服以上現有技術的不足，提供一種改進T-RFLP-PCR結合熒光原位雜交技術對蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群結構快速的檢測分析方法，使其檢測更加具有快速、準確、特異性的特點，并且對定量檢測蝦塘水優(yōu)勢菌群亞硝酸鹽氧化菌的熒光原位雜交其條件進行優(yōu)化。
本發(fā)明將改進T-RFLP結合FISH技術應用到研究蝦養(yǎng)殖水體復雜環(huán)境樣品中，不經純培養(yǎng)直接提取蝦養(yǎng)殖水體樣品中微生物的總的基因組DNA，設計特異性T-RFLP-PCR通用引物(序列上游引物5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′、下游引物5′-CCG TCA ATT CCTTTR AGT TT-3′)，其5’端用6-fam熒光標記，RCR循環(huán)反應，擴增得到各種微生物目標DNA片段一端就帶有熒光標記，用特異性限制性酶HaeIII對DNA片段消化，不同微生物目標DNA片段因其核苷酸序列不同會導致酶切位點存在差異，產生了不同長度的限制性片段，電泳分離和熒光檢測，只有末端帶有熒光標記的片段會被檢測到。由于核苷酸序列具有多樣性，不同微生物的同一個基因的核苷酸序列存在差異，在相同酶切后可能得到不同長度的T-RF，反映在T-RFLP檢測中就是不同的熒光信號，通過生成T-RFLP圖譜的分析，揭示樣品中微生物的種類、數量和種群大小等，從而解析微生物菌群的結構、功能及其動態(tài)變化。但是單獨依賴T-RFLP技術，也有其缺陷，基于PCR擴增技術，就會受到菌群不同菌種DNA的差異性擴增、目標DNA在菌種間拷貝數的差異、PCR技術本身的偏差以及酶切后T-RF的長度分布也會造成復雜多樣性的低估等因素影響，而FISH技術是一種不依賴PCR的分子分析技術可以很好彌補以上的單一依賴PCR的分子檢測技術的不足，結合了分子生物學的精確性和顯微鏡的可視性信息，可以在自然或人工的微生物環(huán)境中監(jiān)測和鑒定不同微生物個體，同時對微生物菌落進行評價。因此運用T-RFLP結合FISH技術，很好結合各自的優(yōu)點和避免相互不足，定性和定量分析蝦養(yǎng)殖水體隨著時間變化微生物生態(tài)多樣性以及優(yōu)勢菌群組成結構的動態(tài)變化。
本發(fā)明對T-RFLP結合FISH分析技術條件進行了優(yōu)化，主要對樣品總DNA提取，對T-RFLP-PCR設計了特異性引物并確定了循環(huán)反應體系與反應參數，優(yōu)化HaeIII酶切體系，對優(yōu)勢菌群FISH條件優(yōu)化。
為了獲得高質量的總DNA，重復CTAB抽提和氯仿/異戊醇抽提，直到看不見界面為止，以出去多糖和其他污染的大分子，純化DNA，用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
對優(yōu)勢菌群FISH條件優(yōu)化，主要是對樣品的自發(fā)熒光進行了消弱，非特異性性雜交進行了消除，確定了合適的雜交時間與洗脫液濃度。
為了消除樣品自身熒光的干擾，獲得最佳效果，樣品優(yōu)勢菌亞硝酸鹽氧化菌用4％多聚甲醛固定后又46℃加熱固定，用0.2mol/L HCI進行處理，PH6.5，菌懸液稀釋倍數104，使其菌體分散程度更好，之后再進行雜交。
對于非特異性雜交的排除，采用了HEX標記探針來解決。實驗發(fā)現，可以很好的消除假陽性，在490nm激發(fā)光下發(fā)出橙紅色熒光。因此，樣品雜交后，并同時進行熒光鏡檢。
FISH檢測的準確性和可靠性主要依賴于寡核苷酸探針的特異性，因此實驗中對于與靶序列相似具有錯配堿基的探針，加入了競爭性探針，使得靶序列很快就可以被檢測。亞酸鹽氧化菌16SrRNA設計的通用探針NIT3，其5’端用HEX熒光標記，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’；其競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。CNIT探針與NIT探針同時使用，以確保NIT探針的特異性。
本發(fā)明的目的具體通過如下技術方案實現 一種檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，包括如下步驟和工藝條件 (1)蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提?。? (2)設計特異性T-RFLP-PCR通用引物，進行循環(huán)反應；所述特異性T-RFLP-PCR通用引物的上游引物為5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物為5′-CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT-3′，5’端用6-fam熒光標記；PCR反應體系是23mM MgCl2 2.0-2.5uL，2.5mM的dNTP1-2uL；退火溫度為57-58℃； (3)產物純化，用特異性限制性內切酶HaeIII酶切DNA；酶切體系DNA≤1ug；產物純化是指PCR產物經DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產物經MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； (4)微生物菌群多態(tài)性結構分析；HaeIII酶切DNA片段與具熒光標記的標準DNA參照物混合后，經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標記的片斷被檢測，轉化為T-RFLP熒光圖譜中的各個峰，每一個峰作為一個OUT(末端熒光標記片段或操作分類單元)來進行物種豐度(S＝T-RFLP圖譜中顯著峰的總數，粗略認為一個峰對應一個不同的物種)、多樣性指數(Shannon-Weiner指數H＝-∑PilnPi和Simpson指數D＝1-∑Pi2，其中，Pi表示某個峰的峰高占總高峰的比例)和物種均度(E＝H′/Hmax，其中，Hmax＝ln S)分析；然后對DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列通過RDP數據庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數據庫中Classification進行比對確定分類，將鑒定的序列利用NCBA的Blast軟件與GenBank數據庫中的16S rDNA序列進行相似性比對，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹；所述1％瓊脂糖凝膠是指1g瓊脂糖溶于100ml蒸餾水； (5)優(yōu)勢菌熒光原位雜交技術定量檢測； a對實驗所需玻片進行處理 對玻片進行清洗，硅化處理，以及明膠涂片制備； b樣品采集及處理 取原始菌液，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1-2天，用去離子水稀釋至10-4，隨后離心，棄上清液，加入PBS，充分搖勻分散，調節(jié)pH至6.0-6.5，調節(jié)pH的目的是使聚集在一起的硝化細菌能更好的分散；再將玻片放置到烘箱內熱固定，時間為1-3h；再用4％多聚甲醛室溫下固定10-20min，沖洗風干；最后將固定后的樣品用乙醇脫水3-5min；所述1％瓊脂糖凝膠是指1g瓊脂糖溶于100ml蒸餾水； c雜交 將探針NIT3及探針CNIT3用HEX標記，將標記好的探針與雜交緩沖液混合于密閉雜交盒中；雜交溫度控制在46℃，雜交時間為2-3h，雜交后用洗脫液清晰探針，洗脫液中NaCl濃度為60mmol/L；按組分在雜交緩沖液的濃度計，所述雜交緩沖液由0.01％SDS、40％去離子甲酰胺、120mmol·L-1Tris-HC和900mmol·L-1NaCl組成，pH＝7.2； d熒光顯微鏡觀察 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數為10，物鏡放大倍數Mob為20； 為進一步實現本發(fā)明目的，所述步驟(1)的蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提取包括如下步驟 a用真空抽濾裝置將水樣過濾，濾液轉移到100ml的離心管，10000-13000rpm離心5-10min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉移到1.5ml離心管； b加入567μl TE，用吸管反復吹打使之重懸，.加入30-40μl 10％SDS和3-5μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80-100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10-15min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于4000-6000rpm下離心10-15min，將上清液轉入另一離心管中； d加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥10-15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀。
所述步驟(3)用特異限制性內切酶HaeIII酶切DNA是指酶切體系含HaeIII 1ul，10xMBuffer 2ul，DNA≤1ug，滅菌水up to 20ul，37℃水域酶切2-3h，識別序列GG|CC(G鳥嘌呤，C胞嘧啶)。
所述步驟(5)探針NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，在5’-端用HEX標記；所述探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。
相對于現有技術，本發(fā)明所改進的T-RFLP-PCR結合熒光原位雜交技術應用到研究微生物生態(tài)系統(tǒng)中微生物菌群多態(tài)性，具有簡便、快速、靈敏、全面的特點，可以有效地定性和定量分析蝦養(yǎng)殖水體隨著時間變化微生物生態(tài)多樣性以及優(yōu)勢菌群組成結構的動態(tài)變化。



圖1為實施例1(4月1號)取樣微生物菌群T-RFLP熒光圖譜； 圖2-5為實施例2蝦養(yǎng)殖苗場水體四次(4月1號，4月16號，5月1號，5月16號)取樣微生物菌群T-RFLP熒光圖譜； 圖6-7為實施例3蝦養(yǎng)殖苗場水體不同深度(40cm和150cm)取樣微生物菌群T-RFLP熒光圖譜。

具體實施例方式 以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，需要說明的是，這些實施例并不構成對本發(fā)明保護范圍的限制。
實施例1 養(yǎng)殖業(yè)是我國沿海地區(qū)的重要支柱產業(yè)，對蝦養(yǎng)殖業(yè)在其中重要的地位，我國的對蝦養(yǎng)殖面積達240萬畝。然而由于病害頻繁發(fā)生，近年我國的對蝦養(yǎng)殖產量低于低谷，越來越多的學者認為，蝦病的根本原因是養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化，污染的環(huán)境與養(yǎng)殖生物之間的惡性循環(huán)導致了病害的持續(xù)爆發(fā)。但是傳統(tǒng)的分離菌種方法只有一部分能被培養(yǎng)，進行微生物多樣性分析時，不能準確地反映混合菌群的組成和多樣性。本實驗以廣東省中山市東升鎮(zhèn)的蝦養(yǎng)殖苗場為研究對象，用T-RFLP結合FISH技術直接動態(tài)檢測微生物菌群變化，對蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的步驟和工藝條件如下 取1號池的水樣，1號池6米×10米，水深約2米。3月中旬投放南美白對蝦苗15萬尾，養(yǎng)殖期間管理同正常生產，4月1號采樣一次，多點采集表層30cm以內的水樣2000ml，帶回實驗室真空過濾，濾液-20℃保存。
(1)蝦養(yǎng)殖苗場水體樣品中微生物總DNA的提取 a.濾液轉移到100ml的離心管，10000rpm離心5min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉移到1.5ml離心管； b.加入567μl TE，用吸管反復吹打使之重懸，加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c.加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于4000rpm下離心15min，將上清液轉入另一離心管中； d.加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀。
(2)特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應 a.T-RFLP-PCR反應體系為25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.5uL，2.5mM的dNTP 1.5uL； b.反應參數94℃變性5min；94℃變性30s，58℃變性30s，72℃變性2min，28次循環(huán)；72℃延伸10min； (3)產物純化，用特異性限制性內切酶HaeIII酶切DNA a.PCR產物經DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產物經MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切體系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA0.5ug，滅菌水upto 20ul，37℃水域酶切3h； (4)微生物菌群多態(tài)性結構分析 a.HaeIII酶切DNA片段與具熒光標記的標準DNA參照物混合后，經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標記的片斷被檢測，轉化為T-RFLP熒光圖譜中的各個“峰”。每一個峰作為一個OUT來進行分析物種豐度(richness)、多樣性指數、物種均度(evenness)； b.DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列在RDP(ribosomal database project)數據庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數據庫中Classification進行比對確定分類，然后將鑒定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast軟件與GenBank數據庫中的16S rDNA序列進行相似性比對，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹； (5)優(yōu)勢菌FISH定量檢測 A玻片處理 a玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96％酒精浸泡，灼燒，然后在1％(質量分數)鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗多次，去離子水洗3次； b硅化處理玻片和蓋玻片在1％(質量分數)鹽酸中煮沸10min，去離子水洗3次，50℃烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆谩２Ｆ涍^硅化處理后具有束水性，能有效防止細胞丟失； B樣品的采集及預處理 a取原始菌液500ml，放置半小時使其沉淀，倒掉上層液體，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1d； b取菌液用去離子水稀釋，取5ml稀釋后樣品至10-4，4000r/min條件下離心，棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，調節(jié)pH至6.5； c熱固定將玻片放置到50℃烘箱內熱固定2h； d多聚甲醛固定熱固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定15min，用PBS室溫沖洗，自然風干； e脫水將固定后的樣品，在96％的乙醇中室溫下脫水4min，自然風干； C雜交反應 NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，探針在5’-端用HEX標記，競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探針各0.5μL與9.6μL的雜交液在雜交盒內進行雜交反應.。反應時間為2h，雜交溫度46℃； D探針的清洗 雜交盒中取出載玻片放入50ml 48℃雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為60mmol/L； E鏡檢 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數為10，物鏡放大倍數Mob為20； 結果顯示水樣的genescan圖上出現了十幾個峰，每個略微突出的部分都可以被認為是一種T-RF，表明水樣中至少有十幾種類群的菌，分布在電泳進行到15min-30min的范圍內，其中在19min-25min出現的峰E、F、I、J占的面積最大，它們的面積之和超過了所有峰總面積的80％，為細菌菌群中的優(yōu)勢菌，其中尤以峰1面積最大，表明該T-RF代表的菌在菌落中的數量最多，優(yōu)勢條帶切膠回收測序，與GenBank數據庫中的16S rDNA序列進行系統(tǒng)學分析，沒有找到任何相似性高的已知序列，這些片段可能來源于我們還沒有了解的未知菌，這樣對于蝦養(yǎng)殖水體微生物的認識會更加全面，而傳統(tǒng)的分離富集培養(yǎng)方法只能培養(yǎng)可培養(yǎng)微生物，微生物的種類、數量和功能都無法反映蝦養(yǎng)殖水體的真實情況。
實施例2 用實施例1蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境進行不同時點的菌群檢測分析，4月至5月每兩周采樣一次(4月1號，4月16號，5月1號，5月16號)。多點采集表層30cm以內的水樣4×2000ml，帶回實驗室真空過濾，濾液-20℃保存，對蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的步驟和工藝條件如下 (1)蝦養(yǎng)殖苗場水體樣品中微生物總DNA的提取 a.濾液轉移到100ml的離心管，13000rpm離心10min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉移到1.5ml離心管； b.加入567μl TE，用吸管反復吹打使之重懸，.加入40μl 10％SDS和5μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c.加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入90μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于5000rpm下離心10min，將上清液轉入另一離心管中； d.加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥10min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀； (2)特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應 a.T-RFLP-PCR反應體系為25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.0uL，2.5mM的dNTP 1uL； b.反應參數94℃變性3min；94℃變性30s，57℃變性30s，72℃變性2min，28次循環(huán)；72℃延伸10min； (3)產物純化，用特異性限制性內切酶HaeIII酶切DNA a.PCR產物經DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產物經MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切體系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA1ug，滅菌水up to20ul，37℃水域酶切2h； (4)微生物菌群多態(tài)性結構分析 a.HaeIII酶切DNA片段與具熒光標記的標準DNA參照物混合后，經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標記的片斷被檢測，轉化為T-RFLP熒光圖譜中的各個“峰”。每一個峰可以作為一個OUT來進行分析物種豐度(richness)、多樣性指數、物種均度(evenness)； b.DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列在RDP(ribosomal database project)數據庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數據庫中Classification進行比對確定分類，然后將鑒定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast軟件與GenBank數據庫中的16S rDNA序列進行相似性比對，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹； (5)優(yōu)勢菌FISH定量檢測 A.玻片處理 a.玻片清洗 熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96％酒精浸泡，灼燒，然后在1％(質量分數)鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗多次，去離子水洗3次； b.硅化處理 玻片和蓋玻片在1％鹽酸中煮沸10min，去離子水洗3次，50℃烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆?。玻片經過硅化處理后具有束水性，能有效防止細胞丟失； B.樣品的采集及預處理 a.取原始菌液500ml，放置半小時使其沉淀，倒掉上層液體，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1d； b.取菌液用去離子水稀釋，取5ml稀釋后樣品至10-4，4000r/min條件下離心，棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，調節(jié)pH至6.0； c.熱固定 將玻片放置到50℃烘箱內熱固定1h； d.多聚甲醛固定 熱固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定10min，用PBS室溫沖洗，自然風干； e.脫水將固定后的樣品，在96％的乙醇中室溫下脫水5min，自然風干； C.雜交反應 NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，探針在5’-端用HEX標記，競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探針各0.5μL與9.6μL的雜交液在雜交盒內進行雜交反應.。反應時間為2.5h，雜交溫度46℃； D.探針的清洗 雜交盒中取出載玻片放入50ml 48℃雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為60mmol/L； E.鏡檢 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數為10，物鏡放大倍數Mob為20。
結果顯示T-RFLP結合FISH技術動態(tài)監(jiān)測蝦養(yǎng)殖水體隨著時間變化，微生物的種類、數量和種群大小等變化，并且將T-RFLP熒光條帶對應的DNA切膠回收重新擴增，熒光圖譜具有很好的再現性和重復性，對比各個圖譜發(fā)現，峰I、II、III、IV在每個圖上都有，特別是峰II、III、IV的面積之和占有了所有峰總面積的80％，構成該菌群結構的主要種群(如表1)。
表1四種T-RF代表的菌數量
從表1中可以看出，每段片段代表的菌的絕對數量也處在動態(tài)變化中。就某一片段來看，片段I代表的菌在4月1號達最大值，而片段II、III和IV代表的菌在5月1號達最大值。片段II、IV代表的菌絕對數量變化幅度達到一個數量級，而片段I、III代表的菌的絕對數量則在同一個數量級上輕微波動。
實施例3 用實施例1蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境，T-RFLP結合FISH技術直接檢測蝦塘水體微生物菌群垂直(深度40cm和150cm)分布變化，2009年6月5號分別在表層(40cm)和深層(150cm)隨機多點取樣一次2×2000ml，帶回實驗室真空過濾，濾液-20℃保存，對蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的步驟和工藝條件如下 (1)蝦養(yǎng)殖苗場水體樣品中微生物總DNA的提取； a.濾液轉移到100ml的離心管，12000rpm離心8min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉移到1.5ml離心管； b.加入567μl TE，用吸管反復吹打使之重懸，.加入35μl 10％SDS和4μl的20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c.加100μl 5mol/LNaCl，充分混勻，再加入100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于6000rpm下離心15min，將上清液轉入另一離心管中； d.加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀； (2)特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應 a.T-RFLP-PCR反應體系為25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.0uL，2.5mM的dNTP 1uL； b.反應參數94℃變性5min；94℃變性30s，57℃變性30s，72℃變性2min，28次循環(huán)；72℃延伸10min； (3)產物純化，用特異性限制性內切酶HaeIII酶切DNA； a.PCR產物經DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產物經MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切體系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA0.8ug，滅菌水upto 20ul，37℃水域酶切3h； (4)微生物菌群多態(tài)性結構分析 a HaeIII酶切DNA片段與具熒光標記的標準DNA參照物混合后，經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標記的片斷被檢測，轉化為T-RFLP熒光圖譜中的各個“峰”。每一個峰可以作為一個OUT來進行分析物種豐度(richness)、多樣性指數、物種均度(evenness)； b DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列在RDP(ribosomal database project)數據庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數據庫中Classification進行比對確定分類，然后將鑒定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast軟件與GenBank數據庫中的16S rDNA序列進行相似性比對，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹； (5)優(yōu)勢菌FISH定量檢測 A玻片處理 a玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96％酒精浸泡，灼燒，然后在1％(質量分數)鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗多次，去離子水洗3次； b硅化處理玻片和蓋玻片在1％(質量分數)鹽酸中煮沸10min，去離子水洗3次，50℃烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆?。玻片經過硅化處理后具有束水性，能有效防止細胞丟失； B樣品的采集及預處理 a取原始菌液500ml，放置半小時使其沉淀，倒掉上層液體，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1d； b取菌液用去離子水稀釋，取5ml稀釋后樣品至10-4，4000r/min條件下離心，棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，調節(jié)pH至6.3； c熱固定將玻片放置到50℃烘箱內熱固定2h； d多聚甲醛固定熱固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定15min，用PBS室溫沖洗，自然風干； e脫水將固定后的樣品，在96％的乙醇中室溫下脫水3min，自然風干； C.雜交反應 NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3，，探針在5’-端用HEX標記，競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探針各0.5μL與9.6μL的雜交液在雜交盒內進行雜交反應.。反應時間為3h，雜交溫度46℃； D探針的清洗 雜交盒中取出載玻片放入50ml 48℃雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為60mmol/L； E鏡檢 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數為10，物鏡放大倍數Mob為20。
結果顯示T-RFLP圖譜6菌群多樣性計算物種豐度(richness)S＝4，Shannon-Weiner指數H＝1.26，物種均度(evenness)E＝0.07；T-RFLP圖譜7菌群多樣性計算物種豐度(richness)S＝9.05，Shannon-Weiner指數H＝3.36，物種均度(evenness)E＝0.47，不同深度的微生物有很大變化，這可能與養(yǎng)殖水體人工小生態(tài)系統(tǒng)，承載負荷的能力差，生物量多，生物種類少，環(huán)境因子易發(fā)生變化，容易引起細菌數量大幅波動，其中500bp大小的條帶含5種序列片斷，組成情況33％，25％，4％，28％和10％；其中800bp大小的條帶含有9種序列片斷，組成情況64％，23％，3％，3％，2％，1％，1％，1％和1％；其中1000bp大小的條帶含有4種序列片斷，組成情況是84.2％，10.2％，4.6％和0.9％，并計算了圖譜6與圖譜7中Sorenson配對比較相似性系數(pairwise similarity coefficient Cs)最低相似性為86％和83％，說明圖譜中的菌群具有很好的連續(xù)性和變化性。
以上實驗結果充分說明T-RFLP結合FISH方法，可用于監(jiān)測蝦養(yǎng)殖水體復雜微生物菌群的結構特征及優(yōu)勢亞硝酸鹽氧化菌群的動態(tài)變化。
權利要求
1.一種檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件
(1)蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提??；
(2)設計特異性T-RFLP-PCR通用引物，進行循環(huán)反應所述特異性T-RFLP-PCR通用引物的上游引物為5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物為5′-CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT-3′，5’端用6-fam熒光標記；PCR反應體系是23mM MgCl2 2.0-2.5uL，2.5mM的dNTP1-2uL；退火溫度為57-58℃；
(3)產物純化，用特異性限制性內切酶HaeIII酶切DNA酶切體系DNA≤1ug；產物純化是指PCR產物經DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產物經MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化；
(4)微生物菌群多態(tài)性結構分析HaeIII酶切DNA片段與具熒光標記的標準DNA參照物混合后，經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標記的片斷被檢測，轉化為T-RFLP熒光圖譜中的各個峰，每一個峰作為一個末端熒光標記片段或操作分類單元來進行物種豐度、多樣性指數和物種均度分析，然后對DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列通過RDP數據庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數據庫中Classification進行比對確定分類，將鑒定的序列利用NCBA的Blast軟件與GenBank數據庫中的16S rDNA序列進行相似性比對，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹；所述1％瓊脂糖凝膠是指1g瓊脂糖溶于100ml蒸餾水；
(5)優(yōu)勢菌熒光原位雜交技術定量檢測
a對實驗所需玻片進行處理
對玻片進行清洗，硅化處理，以及明膠涂片制備；
b樣品采集及處理
取原始菌液，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1-2天，用去離子水稀釋至10-4，隨后離心，棄上清液，加入PBS，充分搖勻分散，調節(jié)pH至6.0-6.5，調節(jié)pH的目的是使聚集在一起的硝化細菌能更好的分散；再將玻片放置到烘箱內熱固定，時間為1-3h，再用4％多聚甲醛室溫下固定10-20min，沖洗風干，最后將固定后的樣品用乙醇脫水3-5min；所述4％多聚甲醛為4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水；
c雜交
將探針NIT3及探針CNIT3用HEX標記，將標記好的探針與雜交緩沖液(0.01％SDS，40％去離子甲酰胺(DAF)，Tris-HCl(pH＝7.2)20mmol·L-1，NaCl 900mmol·L-1，pH＝7.2)混合于密閉雜交盒中，雜交溫度控制在46℃，雜交時間為2-3h，雜交后用洗脫液清晰探針，洗脫液中NaCl濃度為60mmol/L；按組分在雜交緩沖液的濃度計，所述雜交緩沖液由0.01％SDS、40％去離子甲酰胺、120mmol·L-1Tris-HC和900mmol·L-1 NaCl組成，pH＝7.2；
d.熒光顯微鏡觀察
玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數為10，物鏡放大倍數Mob為20；
2.根據權利要求1所述的檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于所述步驟(1)的蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提取包括如下步驟
a用真空抽濾裝置將水樣過濾，濾液轉移到100ml的離心管，10000-13000rpm離心5-10min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉移到1.5ml離心管；
b加入567μl TE，用吸管反復吹打使之重懸，加入30-40μl 10％SDS和3-5μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h；
c加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80-100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10-15min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于4000-6000rpm下離心10-15min，將上清液轉入另一離心管中；
d加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％冷乙醇中洗滌，空氣干燥10-15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀；
3.根據權利要求1所述的檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于所述步驟(3)用特異限制性內切酶HaeIII酶切DNA是指酶切體系含HaeIII 1ul，10x M Buffer 2ul，DNA≤1ug，滅菌水up to 20ul，37℃水域酶切2-3h，識別序列GG|CC(G鳥嘌呤，C胞嘧啶)；
4.根據權利要求1所述的檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于所述步驟(5)探針NIT3是Nitrobacter α-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，在5’-端用HEX標記；所述探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的方法，該方法包括以下步驟(1)蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提??；(2)設計特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應；(3)產物純化，用特異限制性內切酶HaeIII酶切DNA；(4)1％瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，熒光掃描；(5)微生物菌群多態(tài)性結構分析；(6)菌群優(yōu)勢菌熒光原位雜交技術定量檢測。本發(fā)明改進T-RFLP-PCR結合FISH檢測技術，并且用熒光標記特異性引物，與現代技術相比有重復性高、靈敏、快速、準確、穩(wěn)定等特點，可以定性和定量分析蝦養(yǎng)殖水體隨著時間變化微生物生態(tài)多樣性以及優(yōu)勢菌群組成結構的動態(tài)變化。
文檔編號G01N21/64GK101724690SQ20091004228
公開日2010年6月9日 申請日期2009年8月31日 優(yōu)先權日2009年8月31日
發(fā)明者林煒鐵, 高利海, 張星, 朱雅楠, 羅劍飛 申請人:華南理工大學