專利名稱：一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測分析技術(shù)領(lǐng)域中的一種檢 測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑及方法。
背景技術(shù)：
氯霉素(chloramphenicol, CAP)是第一個采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的 抗生素，對多種病原菌具有較強的抑制作用。由于其效高價廉，曾被 廣泛應(yīng)用于各類家禽、家畜、蜜蜂和水產(chǎn)品的各種傳染病的防治。然 而，氯霉素存在著嚴重的毒副作用，能引起人的再生障礙性貧血、粒 狀白細胞缺癥以及新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等，對人類健康構(gòu)成巨 大的潛在威脅。因此，氯霉素殘留問題已引起國際組織和許多國家及 地區(qū)的高度重視。歐盟、美國等發(fā)達國家已相繼禁止氯霉素用于動物 源性食品，并明確規(guī)定氯霉素殘留限量為不得檢出。
目前國內(nèi)外的氯霉素檢測技術(shù)方法主要有微生物法、放射免疫 法、氣相色譜法(GQ 、液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜分析等，這些方法 各有優(yōu)劣,而酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有特異性強、靈敏度高,樣品預(yù)處 理簡單，檢測時間短、檢測樣本量大等優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的檢測原理當包被原為氯霉素偶聯(lián)抗原時是將氯霉素半 抗原與牛丙種球蛋白偶聯(lián)物(CAP-BGG)吸附于固相載體上，加入樣本或氯霉素標準品，然后加氯霉素特異性抗體，待測樣品中殘留的 氯霉素和酶標板上包被的氯霉素抗原競爭氯霉素特異性抗體。再加入 酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光 度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得 出氯霉素的濃度。
包被原為抗抗體時是將抗抗體吸附于固相載體上，加入氯霉素特 異性抗體，再加入氯霉素酶標記抗原和樣本或氯霉素標準品溶液，待 測樣本中殘留的氯霉素和酶標記氯霉素抗原競爭氯霉素特異性抗體， 顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負 相關(guān)，與標準曲線比較即可得出氯霉素的濃度，與標準溶液顏色比較 則可判斷樣品中氯霉素的濃度范圍。
本發(fā)明提供了一種檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑 盒，它含有
(1) 包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；
(2) 酶標記物；
(3) 氯霉素特異性抗體；
(4) 氯霉素標準品溶液；
(5) 底物顯色液；
(6) 終止液；
(7) 濃縮洗滌液；
(8) 濃縮復(fù)溶液。
本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素包被抗原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白進行偶聯(lián)得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或 羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊 進行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊
進行免疫得到。制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為批pH值9.6、 0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被氯霉素抗原或抗抗體的載體物質(zhì)可 為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、 玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板 凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為去離子水或三蒸水；所用的 封閉液是含有8%-15%的馬血清和1%惰性蛋白的溶液。
本發(fā)明所述試劑盒中包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的 酶聯(lián)板的制備步驟為-
(1) 用包被緩沖液將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白(BGG)偶聯(lián)物 或抗抗體以0.02-0.08ng/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗抗體稀釋液；
(2) 向酶聯(lián)板的每孔中加入10(^1已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗 抗體稀釋液，37"C溫育2h，傾去包被液，用洗漆液洗滌4次，每次 15-30s，拍干；
(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150-200nl封閉液，37"C溫育l-2h， 傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
以上方法制備的酶聯(lián)板具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過冷熱穩(wěn)定性試 驗，酶聯(lián)板的相關(guān)技術(shù)參數(shù)均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。
本發(fā)明所述試劑盒中酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記氯霉素 抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發(fā)明優(yōu)選過氧化物酶;酶標記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；酶標記物工作液所用的 稀釋液為含有50%甘油(可防止放入-201:環(huán)境的酶標記物凍結(jié)，亦可 長時間保持酶標記物的生物活性)、1%的疊氮化鈉防腐劑(便于保存) 的溶液。
本發(fā)明所述試劑盒中酶標記抗抗體的制備步驟為
(1) 抗抗體的制備以鼠源性抗體為免疫原對無病原體山羊進行 免疫，得到羊抗鼠抗抗體；或以兔源性抗體為免疫原對無病原體山羊 進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
(2) 過氧化物酶標記抗抗體的制備將抗抗體與過氧化物酶(HRP) 進行偶聯(lián)，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗體與辣根
過氧化物酶的結(jié)合率升高，傳統(tǒng)GA—步法偶聯(lián)反應(yīng)不易控制，反應(yīng)
速度快的分子易發(fā)生自生聚合，且偶聯(lián)效率不高。為了解決這些問題， 我們將一步法進行了改進，克服了一步法的缺點。首先在被偶聯(lián)的兩 種分子中，與偶聯(lián)劑反映較弱的分子先用過量的偶連劑活化，然后去
處多余的偶連劑；第二步將一端與某種分子連接的偶連劑，通過改變 反應(yīng)條件而與另一種分子連接起來。二步法雖然操作較繁，但偶連效 率提高，而且形成的同分子聚合物減少。
本發(fā)明所述試劑盒中酶標記抗原是采用活性酯法將標記酶與氯 霉素半抗原進行偶聯(lián)得到。
本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔 源多克隆抗體，免疫原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍 蛋白進行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值8.2、 0.05mol/L、含有3%馬血清和596。明膠的磷酸鹽 緩沖液。
本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素特異性抗體可為單克隆抗體或多克 隆抗體，其制備方法如下
(1)氯霉素單克隆抗體制備的步驟為
a. 動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，免疫原(氯霉 素半抗原與鑰孔槭血藍蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為80-100嗎/只，首免 時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點 注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化， 加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞；
b. 細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5-10: 1 比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清 液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn) 定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；
c. 細胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液 制成1-5><106個/1111的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存， 復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37。C水浴中速融，離心去除凍存液后， 移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；
d. 單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠 (8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細 胞5xl0、l(^個/只，7-10天后采集腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹 水純化，小瓶分裝，-20°(:保存；e. 抗體凍干粉可將腹水在37'C環(huán)境下烘干，放入-2(TC保存；
f. 抗體工作液是用抗體稀釋液將抗體以0.02-0.08pg/ml濃度進行 稀釋。
(2)氯霉素多克隆抗體制備的步驟為
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，免疫原(氯霉素半抗原與鑰孔 槭血藍蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為lmg/kg，首免時將免疫原與等量的 弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3-4周取 相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共 免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10天后采血，測定血 清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
本發(fā)明所述試劑盒中當標記酶為過氧化物酶時底物顯色液為過 氧化氫或過氧化脲、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液、終止液為 0.1-0.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為半乳糖甘酶時，底物 顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液； 濃縮洗滌液為去離子水或三蒸水；濃縮復(fù)溶液為去離子水或三蒸水。
本發(fā)明所述試劑盒中氯霉素標準品溶液為六個濃度梯度的氯霉 素溶液，氯霉素稀釋液為去離子水或三蒸水。
本發(fā)明所述試劑盒中試劑的配制具體為
a. 氯霉素標準溶液氯霉素系列標準溶液6瓶，濃度為0pg/L、 0.025pg/L、 0.075pg/L、 0.225pg/L、 0.675|tig/L、 2.025|ug/L， l-3ml/瓶。
b. 包被緩沖液pH值為9.6， 0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
c. 封閉液8%-15%的馬血清和1%惰性蛋白的溶液。d. 濃縮洗滌液去離子水或三蒸水30-50ml/瓶，l瓶。
e. 酶標記物酶標記抗抗體工作液或酶標記氯霉素抗原工作液， 7-12ml/瓶，l瓶。
f. 底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲與鄰苯二胺(OPD)或四甲基 聯(lián)苯胺(TMB)的混合液；
g. 終止液l-2mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液，5-8ml/ 瓶，l瓶。
h. 抗體工作稀釋液為pH值8.2、 0.05mol/L、含有3%馬血清 和5%。明膠的磷酸鹽緩沖液。
i. 濃縮復(fù)溶液去離子水或三蒸水，30-50ml/瓶，l瓶。 本發(fā)明所述檢測動物源性食品中氯霉素的方法，包括了以下步驟.
鄉(xiāng)
(1) 樣品前處理；
(2) 用本發(fā)明所述的試劑盒進行檢測；
(3) 分析檢測結(jié)果。
本發(fā)明中樣品前處理方法為
樣本前處理需配制
配液l: C液(牛奶樣本使用):
0.36M亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CNVNO2H20) 10.7g亞硝基鐵 氰化鈉加去離子水100ml溶解
配液2: D液(牛奶樣本使用)
1M硫酸鋅(ZnSCV7H20) 28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解配液3:(尿樣本使用)pH4.8 lOOmM醋酸鈉緩沖液，稱2.4g 醋酸鈉、1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合 配液4:乙腈-水溶液V乙臘VH20 = 84: 16
配液5:將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1: 1稀釋。(用于抗體
的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)
(a) 組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法
用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
稱3i0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加 入6ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫4000r/min以上，離心10min;
取出2ml上層液體(約相當于lg的樣本)在氮氣流50-6(TC水 浴中干燥；
加入l ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加lml稀釋后的復(fù)溶液 強烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上離心15min。 取50 pl下層相用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)1
(b) 血清血槳
取lml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩lmin; 靜置使水相與有機相分層或室溫4000r/min離心5min; 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流5(TC水浴中干燥； 殘留物用1 ml稀釋后的復(fù)溶液溶解； 取5(Hil用于分析。
(c) 尿液移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml 混合；
力口 40pl葡萄糖苷酸酶(Merck,AitNo.4114)到稀釋的尿液中，在 37"C水解至少2小時(或過夜)；
該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合lmin;
室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮氣下50 60°C 干燥；
用lml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物； 取5(Hd用于分析。
(d) 蜂蜜
取2i0.05g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解； 加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min; 室溫4000r/min以上離心10min;
移取lml上層乙酸乙酯(相當于0.5g樣本)到另一離心管中， 50-6(TC氮氣流下干燥；
用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解； 取50 )Lil用于分析。
(e) 腸衣
用均質(zhì)器均質(zhì)樣本注干樣本需剪碎(長度不超5mm)后再均 質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上(去除表面的鹽份)，瀝干后 再迸行均質(zhì)。
稱l土0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫4000r/min以上，離心10min。
取出5ml上層液體(相當于0.5g的樣本)在氮氣流下50-6(TC干燥。
加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml稀釋后的復(fù)溶液 強烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上，離心5min。 去上層相，取下層50^1用于分析。 (f)牛奶和奶粉 牛奶樣本處理方法一
牛奶樣本，10°C4000r/min以上離心10min，吸除上層脂肪； 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中，加入150^ilC液出現(xiàn)沉淀，短 暫振蕩后加入D液混合；
15°C4000r/min以上，離心10min，移取上層液；
用稀釋后的復(fù)溶液以等體積稀釋上層液；
取5(Hd用于分析。
注如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。
牛奶樣本處理方法二
取5ml去除脂肪奶樣至離心管中；
加入250pl C液和250W D液徹底混合，4-12°C4000r/min以上離 心10min。如果沒有冷凍離心機，請預(yù)先將樣本冷卻到8t:;
轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液(相當于2ml奶樣)至一個新的離心管中， 加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min;
室溫(20-25°C) 4000r/min以上離心10min ;轉(zhuǎn)移出2ml乙酸乙酯上層液體(相當于lml奶樣)，60。C氮氣流 下完全干燥；
用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物； 取50^1用于分析。
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾(在某些情況下干擾數(shù)值在 標準2到3之間)，所以推薦標準3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。 奶粉樣本處理方法
稱2士0.05g奶粉至離心管中，加入10ml去離子水，振蕩溶解；
力口 lml C液和lml D液徹底混合。4-12°C4000r/min以上離心 10min。若無冷凍離心機，請預(yù)先將樣本冷卻到8"C;
轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液(相當于0.6g奶粉)至一個新的離心管中， 加入6ml乙酸乙酯上下來回振蕩10min;
室溫(20-25°C) 4000r/min以上離心10min;
轉(zhuǎn)移出4ml乙酸乙酯上層液體(相當于0.4g奶粉)，6(TC氮氣流 下完全干燥；
用0.4ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物；
取50pl用于分析。
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾(在某些情況下干擾數(shù)值在 標準2到3之間)，所以推薦標準3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。 (g)蛋類
用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本(蛋黃或全蛋)；
稱取3±0.05 g均質(zhì)過的樣本，與9ml乙腈-水溶液(84 : 16; V乙腈V水)振蕩10min， 15°C 4000r/min以上離心10min;
取3ml上層與3ml蒸餾水混合，加入4.5ml乙酸乙酯混合5min， 15°C4000r/min以上離心lOmin;
將上層有機相轉(zhuǎn)移到試管中5(TC下氮氣吹干；
加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml稀釋后的復(fù)溶液混合 lmin，離心去除正己垸。 取50nl用于分析。
(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進行檢測
從4'C冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫(20-25°C)平衡30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2國8。C。
配液將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用蒸餾水或去離子水稀 釋至800ml備用(或按需要量稀釋)。
編號將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
加標準品/樣本50nl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液 50^1/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。37t環(huán)境中反應(yīng)30min。
取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液25(Hil/孔洗板4-5次，每次間隔IO 秒，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
每孔加入酶標記物lOOfil，蓋板膜蓋板后置37'C環(huán)境中反應(yīng) 30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍(同上)，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
顯色每孔加入底物10(^1，輕輕振蕩混勻，37"C環(huán)境中避光顯
色15min。
測定每孔加入終止液50pl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm 處(建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔 OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第 2種方法。注意樣本吸光值與其所含氯霉素成反比。 粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍
(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.250，樣本2的吸光度值為0.720， 標準液吸光度值分別是Oppb為1.610; 0.025ppb為1.380; 0.075ppb 為1.100; 0.225ppb為0.620; 0.675ppb為0.289; 2.025ppb為0.108。 則樣本1的濃度范圍是0.675ppb-2.025ppb;樣本2的濃度范圍是 0.075 ppb-0.225 ppb。 2、定量分析
百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣 本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸 光度值，再乘以100%，即
<formula>formula see original document page 17</formula>B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
Bo—Ong/ml標準溶液的平均吸光度值 標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度(ng/ml) 的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖，見圖1。將樣本的百分吸光率 代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng) 的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件 進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
圖1為氯霉素的檢測標準曲線圖，橫坐標表示氯霉素標準品濃度，縱 坐標表示標準品百分吸光率。
具體實施例方式
實施例1檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒組分的制備 1.抗原的合成
a. 包被原的合成
將氯霉素采用衍生物法合成氯霉素半抗原，再將半抗原通過重氮 化反應(yīng)和牛丙種球蛋白載體蛋白用活潑酯法進行偶聯(lián)得到。
b. 免疫原的合成
將氯霉素半抗原通過重氮化反應(yīng)和鑰孔槭血藍蛋白載體蛋白用 活潑酯法進行偶聯(lián)得到。2. 氯霉素鼠單克隆抗體的制備
a. 動物免疫
采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍蛋 白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為30(Hig/只，首免時將免疫原與等量的 弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2周取相 同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免 后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。
b. 細胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5: 1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融 合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限 稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤 細胞株。
c. 細胞凍存和復(fù)蘇
取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成5xl(^個/ml的細 胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立 即放入37'C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
d. 單克隆抗體的制備與純化
采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油 0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5><106個/只，7天后采集腹水。 用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，20'C保存。
3. 氯霉素兔多克隆抗體的制備
采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以氯霉素半抗原與鑰孔槭血藍蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為3mg/kg，首免時將免疫原與等量 的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周取 相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共 免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7天后采血，測定血清 抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。 4.酶標板的制備
用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.06pg/ml，每孔加入 100^1， 37。C溫育6h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次lmin， 拍干，然后在每孔中加入150^1封閉液，37"C溫育lh，傾去孔內(nèi)液體， 干燥后用鋁膜真空密封保存。 實施例2檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建
組建檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分
(1) 包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板；
(2) 用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；
(3) 氯霉素鼠單克隆抗體；
(4) 氯霉素標準品溶液6瓶，濃度分別為Opg/L、 0.025pg/L、 0.075ng/L、 0.225pg/L、 0.675,、 2.025pg/L;
(5) 底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲與鄰苯二胺(OPD)或四甲 基聯(lián)苯胺CTMB)的混合液；
(6) 終止液為2 mol/L的硫酸緩沖液；
(7) 濃縮洗滌液為去離子水或三蒸水；
(8) 抗體稀釋液為pH值8.2、 0.05mol/L、含有3%馬血清和5%0明膠的磷酸鹽緩沖液。
(9)濃縮復(fù)溶液為去離子水或三蒸水。 實施例3檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的的組建
組建檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分
(1) 包被羊抗兔抗抗體的酶聯(lián)板；
(2) 用堿性磷酸酯酶標記的氯霉素抗原；
(3) 氯霉素兔多克隆抗體；
(4) 氯霉素標準品溶液6瓶，濃度分別為0ng/L、 0.025pg/L、 0.075ng/L、 0.225pg/L、 0.675pg/L、 2.025pg/L;
(5) 底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液；
(6) 終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液；
(7) 濃縮洗滌液去離子水或三蒸水；
(8) 濃縮復(fù)溶液為去離子水或三蒸水。 實施例4樣品中氯霉素殘留的檢測
1. 樣品前處理
用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本;稱3士0.05g樣本于離心管中，先加入3ml 去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫4000r/min 以上，離心10min;取出2ml上層液體(約相當于lg的樣本)在氮 氣流50-6(TC水浴中干燥；加入lml正己烷溶解干燥的殘留物，再加 lml稀釋后的復(fù)溶液強烈振蕩lmin，室溫4000r/min以上離心15min。 取5(Hd下層相用于分析。
2. 用試劑盒檢測向氯霉素偶聯(lián)抗原包被的96孔酶標板微孔中加系列標準品或樣
本溶液(各2孔)50W，再加入氯霉素抗體工作液50jul，用蓋板膜封板， 37"C恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250W洗滌液， 30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。 每孔加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體100^1，用蓋板膜封板， 37°。恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌工作。加入底物顯色液lOOpl， 輕輕振蕩混勻，37"C恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液2 mol/L。 硫酸50pl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值。 3.檢測結(jié)果分析
用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)，除以第一 個標準溶液(O標準)的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度 值。以氯霉素濃度的半對數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標 準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液 的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液中氯霉 素所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中氯霉素的實 際濃度。
實施例5樣品中氯霉素殘留的檢測 1.樣品前處理
取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；加入 4ml乙酸乙酯上下振蕩10min;室溫4000r/min以上離心10min;移取 lml上層乙酸乙酯(相當于0.5g樣本)到另一離心管中，50-6(TC氮 氣流下干燥；用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解；取50iul用于分析。2. 用試劑盒檢測
向羊抗兔抗抗體包被的96孔酶標板微孔中加入氯霉素兔多克隆 抗體工作液10(^1，用蓋板膜封板，37'C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出 孔中液體，每孔加入250nl濃縮洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此 重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入細菌提取堿性磷酸酯 酶標記的氯霉素抗原50nl，再加入系列標準品或樣本溶液5(^1，用 蓋板膜封板，37。C恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌過程。加入對硝基 磷酸鹽緩沖液lOOpl，輕輕振蕩混勻，37'C恒溫箱避光顯色15min。 每孔加入終止液2mol/L氫氧化鈉50|til，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測 定每孔吸光度值。
3. 檢測結(jié)果分析
用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)除以第一個 標準溶液(0標準)的吸光度值(B。)再乘以100%，得到百分吸光度值。 以氯霉素濃度Oig/L)的半對數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標 準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液 的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液所對應(yīng) 的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中氯霉素實際濃度。 實驗例1標準品精密度試驗
從每批按照實施例1(4)中的方法制備的酶聯(lián)板中，各抽出10個 微孔，測定0.45pg/L。標準溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)3次，計
算變異系數(shù)cvy。，結(jié)果見表l。
表1標準可重復(fù)性試驗(CVM)12345678910
01批8.99.310.28.57.67.37.95.16.36.9
cv%
03批6.77.912.35.56.95.66.85.65.78.3
CV%
06批5.68.57.68.25.97.58.67.38.66.7
CV%
結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在5.1%-12.3%之間，符合了變異系數(shù)小 于20%的規(guī)定，說明本試劑盒標準品精密度達到了標準。 實驗例2樣本可重復(fù)性試驗
以0.4pg/L，濃度的氯霉素對魚蝦、雞肉和蜂蜜，添加到樣品中， 分別取三個不同批次的試劑盒各五個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算 變異系數(shù)，結(jié)果見表2、表3。
表2魚蝦、雞肉樣品可重復(fù)性試驗 批號 實測值fig/L 變異系數(shù)
cv%
0.350.360.290.360.3512.2
010.370.400.310.400.3611.3
0.360.340.360.370.3110.9
0.380.360.370.280.3513.2
030.330.400.290.370.3610,5
0.380.340.390.300.3512.3
0.320.350.300.290.3713.9
060.390.360.320.390.4013.0
0.370.390.320.310.3016.0
表3蜂蜜樣品可重復(fù)實驗
批號 實測值Hg/L 變異系數(shù)
CV%0.320.390.320.300.3211.6
010.310.400.370.360.3913.7
0.300.280.330.310.4010.9
0.400.360.380.320.3711.8
030.350.330.390.300.3713.4
0.370.300.340.360.3312.4
0.300.330.370.400.2815.7
060.290.370.360.300.3413.9
0.320.380,310.370.3610.3
結(jié)果表明魚蝦、雞肉樣本變異系數(shù)均低于20%，蜂蜜樣本的變異 系數(shù)均低于20%，符合了變異系數(shù)小于25%的規(guī)定，說明本試劑盒 測定樣本的精密度達到了標準。
實驗例3抗體的特異性
特異性是指抗體對待測物的識別能力，強調(diào)抗體與待測物間結(jié)合 反應(yīng)的專一性和對結(jié)構(gòu)相近或相關(guān)物質(zhì)的區(qū)分能力。特異性取決于待 測物與其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)。在競爭分析中，不同物質(zhì)的交叉反應(yīng)率 可用如下公式計算
交叉反應(yīng)率(%) =IC50 (競爭物)/IC50 (待測物)*100
表4用KLH蛋白偶聯(lián)的抗原制備的抗體的交叉反應(yīng)率
化合物交叉反應(yīng)率(％)
勵
甲砜霉素0.01
氟甲砜霉素0.01
實驗例4試劑盒的準確度試驗
取兩個濃度的氯霉素標準品溶液，分別為0.15pg/kg(L)lpg/kg(L)，分別對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分
別計算回收率。
表5試劑盒的準確度 樣本_魚蟲下、雞肉_蜂蜜
添加濃度pg/L 0.15 1 0.15 1
90 93 79 83
回收率 99 87 82 85
88 83 84 84
85 82 90 89
平均值 90.5 86.3 83.8 85.3
結(jié)果表明魚蝦、雞肉添加的回收率在86.3%-90.5%之間，蜂蜜 添加回收率在83.8%-85.3%之間。 實驗例5
試劑盒保存條件為2-8'C，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大 吸光度值(零標準)、50%抑制濃度、氯霉素添加實際測定值均在正常 范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將 試劑盒在37'C保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結(jié)果表 明該試劑盒各項指標完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將 試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標完 全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒在2-8'C可以保存6個月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，它含有(1)包被氯霉素抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標記物；(3)氯霉素特異性抗體；(4)氯霉素標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液；試劑盒中氯霉素包被抗原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白進行偶聯(lián)得到的，抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫得到。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫 試劑盒，其特征是，試劑盒中酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記氯 霉素抗原，所用酶為過氧化物酶或半乳糖甘酶；酶標記物形式為凍 干粉、濃縮液或工作液。
3. 如權(quán)利要求2所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所用的酶為過氧化物酶。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中酶標記抗原是采用活性酯法將標 記酶與氯霉素半抗原進行偶聯(lián)得到。
5. 如權(quán)利要求4所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫 試劑盒，其特征是，試劑盒中氯霉素特異性抗體為鼠源單克隆抗體 或兔源多克隆抗體，免疫原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與鑰孔 槭血藍蛋白進行偶聯(lián)得到的；抗體形式為凍干粉、濃縮液或工作液； 抗體稀釋液為pH值8.2、 0.05mol/L、含有3%w/v馬血清和5%。w/v 明膠的磷酸鹽緩沖液。
6. 如權(quán)利要求5所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫 試劑盒，其特征是，試劑盒中當標記酶為過氧化物酶時底物顯色液 為過氧化氫或過氧化脲、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液、終止液為 0.1-0.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為半乳糖甘酶時，底 物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩 沖液；濃縮洗滌液為去離子水或三蒸水；濃縮復(fù)溶液為去離子水或 三蒸水。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫 試劑盒，其特征是，制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為批pH 值9.6、 0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被氯霉素抗原或抗抗體的載 體物質(zhì)為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠或瓊脂糖凝膠；載體的形式是試管、微量反 應(yīng)板凹孔、小珠或小圓片；洗漆液為去離子水或三蒸水；封閉液是 含有15%-30%w/v的馬血清和P/。w/v惰性蛋白的溶液。
8. 如權(quán)利要求1-3和5-7任一項所述的檢測動物源性食品中氯 霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中氯霉素標準品溶液為 六個濃度梯度的氯霉素溶液，氯霉素稀釋液為去離子水或三蒸水， 氯霉素標準溶液濃度為0jug/L、 0.025pg/L、 0.075pg/L、 0.225pg/L、 0.675pg/L、 2.025,， l-3ml/瓶。
9. 如權(quán)利要求4所述的檢測動物源性食品中氯霉素的酶聯(lián)免疫 試劑盒，其特征是，試劑盒中氯霉素標準品溶液為六個濃度梯度的 氯霉素溶液，氯霉素稀釋液為去離子水或三蒸水，氯霉素標準溶液 濃度為0pg/L、 0.025嗎/L、 0.075嗎/L、 0.225pg/L、 0.675)ig/L、 2.025pg/L， l-3ml/瓶。
10. —種檢測動物源性食品中氯霉素的方法，包括以下步驟(1) 樣品前處理；(2) 用權(quán)利要求l-9任一所述的試劑盒進行檢測；(3) 分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶聯(lián)板；酶標記物；氯霉素特異性抗體；氯霉素標準品溶液；底物顯色液；終止液；濃縮洗滌液；濃縮復(fù)溶液。氯霉素包被抗原是采用活潑酯法將氯霉素半抗原與牛丙種球蛋白進行偶聯(lián)得到，所述抗體為多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種檢測動物源性食品中氯霉素的方法，包括了以下步驟樣品前處理；用試劑盒的試劑進行檢測；分析檢測結(jié)果。本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費用低廉、適用于大量樣本篩查的檢測動物源性食品氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測方法。
文檔編號G01N33/52GK101526537SQ20091004516
公開日2009年9月9日 申請日期2009年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者青 吳, 俊 唐, 成 李, 宏 楊, 楊宗繁, 溫俊梅, 聶繼斌, 欣 齊 申請人:深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司