專利名稱：鼠rank胞外蛋白晶體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)晶體，尤其涉及一種鼠RANK胞外蛋白晶體，本發(fā)明還提供 了一種制備RANK胞外蛋白晶體的方法，以及該RANK胞外蛋白晶體在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(TNF)家族中的細(xì)胞因子在諸如炎癥反應(yīng)、器官發(fā)生、宿主防御、 自身免疫和細(xì)胞凋亡等多種生物功能中扮演著重要的角色。這些生物調(diào)節(jié)因子是通過受 體-配體相互作用，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞以及細(xì)胞表型的改變而發(fā)揮相應(yīng)的生理作 用的。作為TNF家族成員的RANKL以及其受體RANK在生物體內(nèi)的多種活動中扮演著重要 的角色，其對于骨的重塑過程起到了重要的調(diào)節(jié)作用，并且RANK以及RANKL分子之間的相 互作用還可調(diào)節(jié)T細(xì)胞/樹突狀細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、樹突狀細(xì)胞的存活以及淋巴組織的發(fā)育， 近年來受到了廣泛的關(guān)注。在人體骨的重塑過程中，破骨細(xì)胞是骨重塑的“啟動子”，成骨細(xì)胞是骨重塑的“調(diào) 節(jié)者”，骨吸收類疾病共同的病理特征為破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致骨形成和骨吸收之間喪失 平衡，因此深入了解破骨細(xì)胞的激活機制將對于成功防治骨吸收類疾病的發(fā)生有著至關(guān)重 要的意義。1997年，幾個不同的研究小組發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子受體-配體超家族新成員骨 保護蛋白(osteoprotegerin，0PG)、RANKL以及RANK ；隨后，多項研究相繼顯示RANKL、0PG 具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育、影響其功能的作用，RANK是RANKL、OPG發(fā)揮作用的關(guān)鍵，它 們形成一個骨調(diào)節(jié)軸，來調(diào)節(jié)骨的重塑過程。RANKL為一種II型跨膜蛋白，其多為三個單體聚合成的復(fù)合體，主要分布在活 化T細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞等細(xì)胞中，目前認(rèn)為哺乳動物中存在三種RANKL蛋白 RANKLl、RANKL2、RANKL3，其中前兩種為膜結(jié)合蛋白，后一種為被分泌到胞外的可溶性蛋白。 人和大鼠的RANKL分子分別包含317、316個氨基酸殘基，具有87%的同源性；人類RANKL基 因位于13ql4，其啟動子區(qū)包含成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子cbaf-Ι的活性。RANKLmRNA 可在多種組織表達，以骨骼和淋巴組織中最高，在骨骼中，RANKL主要表達于骨小梁和骨髓； 在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞均可檢測到RANKL mRNA。2004年Ito S等人以及國際專利申 請NO. WO 03/014077都披露了 RANKL的三維結(jié)構(gòu)，其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。各項研 究表明每一個RANKL單體包括一個夾層結(jié)構(gòu)，其由兩個平面反平行β-折疊片層構(gòu)成。第 一個片層由β _鏈A”、Α、H、C及F組成，第二個片層由B’、B、G、D及E組成，其中第一片層 為內(nèi)層β -片層，該片層富含疏水性氨基酸，并通過疏水作用與另外兩個RANKL相互結(jié)合， 而B’、B、G、D及E鏈形成外層β -片層，該片層多為帶電及極性氨基酸，負(fù)責(zé)與受體RANK結(jié) 合；每一個RANKL單體中的β -夾層結(jié)構(gòu)的一個邊緣、鏈E及F包裹相鄰單體的AHCF β-片 層的內(nèi)部疏水層從而形成RANKL三聚體結(jié)構(gòu)。RANKL三聚體的晶體結(jié)構(gòu)特征是具有PZppi
的空間群，晶胞參數(shù)為a=65.3A±0.2A，b=82.0A 士0.2A,C=99.5人士 0.2Α,以及空間
群R3，胞晶為a=b 二 150.6A±0.2A，C= 139.5入士0.2入。其形狀就像被截平了的錐形，靠
近膜的一端寬于遠(yuǎn)端的頂點處。RANKL三聚體高55 A,底部直徑約為55 A,頂點處的直徑約為35 A。RANK是RANKL的受體，屬于TNF受體家族，是一種I型跨膜蛋白，鼠RANK分子在破 骨細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞內(nèi)表達量較高。RANK基因定位于18q22. 1，其編碼的蛋白 質(zhì)在體內(nèi)以跨膜蛋白型存在，其表達于單核-巨噬細(xì)胞系、破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、 B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，表達于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜表面的RANK介導(dǎo)RANKL的信號，發(fā) 揮調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的功能。當(dāng)配體RANKL與受體RANK的胞外區(qū)域結(jié)合后，導(dǎo)致了 RANK的激活，活化后的RANK 通過其胞內(nèi)區(qū)域的TRAF結(jié)合域與TRAF1、2、3、5、6等蛋白結(jié)合，并且通過這些TRAF蛋白激 活細(xì)胞內(nèi)的兩條重要的信號通路JNK/SAPK通路和NF κ B信號通路。這兩條信號通路的激 活誘導(dǎo)了與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因的表達，最終促進了破骨細(xì)胞的分化與成熟。而且， 各種骨代謝調(diào)節(jié)因子、激素參與RANKL-RANK-0PG軸信號的調(diào)節(jié)。與其它信號途徑一樣， RANKL-RANK-0PG軸信號也存在正反饋和負(fù)反饋調(diào)節(jié)。1 α，25-(OH)2D3^甲狀旁腺素、前列腺 素Ε2、白介素l、IL-6等骨吸收因子分別通過維生素D受體介導(dǎo)通路、蛋白激酶A介導(dǎo)通路、 gpl30/STAT介導(dǎo)通路上調(diào)成骨細(xì)胞/骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL mRNA表達；IL_1、TNF_ α分別通 過激活破骨細(xì)胞表面的IL-IR和TNFRl加強RANKL信號；TGF-β則可增加破骨細(xì)胞表面的 RANK上調(diào)RANKL信號。作為RANKL-RANK-0PG信號系統(tǒng)調(diào)控破骨細(xì)胞分化的中心環(huán)節(jié)，RANKL與RANK之 間的相互作用及其促使RANK活化的微觀機制一直以來是骨吸收類疾病研究領(lǐng)域的熱點問 題。其焦點問題之一是RANKL、RANK蛋白以及RANK/RANKL復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。雖然目前已 經(jīng)獲得了 RANKL蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，但是仍然沒有獲得RANK蛋白以及RANK/RANKL復(fù)合體的 晶體結(jié)構(gòu)，正是由于對這些結(jié)構(gòu)的認(rèn)識不足，所以學(xué)者們對于RANKL-RANK-0PG信號體系如 何被調(diào)控，以及受調(diào)控后RANKL-RANK-0PG執(zhí)行信號傳遞的微觀機制尚無明確的認(rèn)識。這嚴(yán) 重影響了有關(guān)骨吸收類疾病致病機制的探索以及抗骨吸收藥物的研究。分析目前還未獲得RANK蛋白以及RANK/RANKL復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)的原因主要有以 下兩點1. RANK蛋白較難于制備和純化。在RANK被發(fā)現(xiàn)至今的時間里，一直無RANK蛋白 E. coli表達以及純化的相關(guān)報道。2.相對于包含RANKL在內(nèi)的TNF蛋白家族成員所具有 的較剛性的結(jié)構(gòu)，包括RANK在內(nèi)的TNFR蛋白家族成員其結(jié)構(gòu)具有較大的可變性，因而更難 于獲得結(jié)晶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)晶體，其中所述晶體包括鼠RANK胞外區(qū)域的氨基酸序列。 鼠RANK的胞外區(qū)域是指RANK單體N-末端從26位氨基酸至210位氨基酸。本發(fā)明所提供的晶體由鼠RANK單體鏈A及單體鏈B形成的二聚體構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明所提供的鼠RANK胞外蛋白晶體，該晶體具有空間群PZPP1，晶胞參數(shù)為a=39.82 A,b=94.25 A和c=102.42 A。在本發(fā)明所提供的晶體中，單體鏈A及單體鏈B以反向平行形式，即單體鏈A的N 端對應(yīng)于單體鏈B的C端而形成二聚體；該二聚體含有四個CRD，存在于這四個CRD結(jié)構(gòu)域 中的多個二硫鍵使得單體鏈A和B形成細(xì)長的帶狀；兩個單體的重疊所形成的均方根差為 2.13A,除去溶劑后的二聚體所形成的總面積為3231 A2;由兩個單體之間所包含的面積被這兩個單體等分；形成的二聚體的長度與RANK單體的長度近似。在本發(fā)明所提供的晶體中，在所述二聚體中，每個不同的CRD結(jié)構(gòu)域具有不同的 均方根差，相對于Ca原子而言，該均方根差的范圍為從CRD3的0.35 A至CRD2的1.05 A。在本發(fā)明所提供的晶體中，單體鏈A以及單體鏈B主要在CRD2和CRD3結(jié)構(gòu)域發(fā) 生相互作用，涉及到這種相互作用的重要殘基為單體鏈A的Gln-145，Asn-147和Lys_171 以及單體鏈 B 的 Asn-147，Gln-145 和 Glu-84。在本發(fā)明所提供的晶體中，單體鏈A及單體鏈B中分別存在一個鈉離子，該鈉離子 可與單體鏈A和B上的Cys-134, Ala-135，Phe-138，Val-163以及骨架上的Ser-161側(cè)鏈
的羰基基團螯合。本發(fā)明還提供了一種制備RANK胞外蛋白晶體的方法，包括(1)將純化的RANK在 PH 7. 00的IM TRIS緩沖溶液中濃縮成10mg/mL ；⑵在溫度為294K的條件下，利用高通 量納升坐滴蒸汽擴散方法形成RANK胞外蛋白的晶體；3)所述RANK晶體在20% PEG 3350， 0. 2M酒石酸鈉條件下生長。本發(fā)明提供的該制備方法尤其適用于鼠RANK胞外蛋白晶體的 制備。根據(jù)本發(fā)明提供的制備RANK晶體的方法，其中所述RANK晶體還可以在30%的 PEG 5000,0. 2M的硫酸鈉，以及pH6. 5的0. IMMES的條件下生長。該生長條件尤其適用于鼠 RANK胞外蛋白晶體的生長。根據(jù)本發(fā)明提供的制備方法，其中所述RANK晶體可以在含有IOOnL蛋白質(zhì)溶液和 IOOnL pH為 6. 5 的 10% PEG 3350,15% PEG5000,0. IM硫酸銨，0. IM酒石酸鈉和 0. 05M MES 的池液的液滴中生長。該生長條件尤其適用于鼠RANK胞外蛋白晶體的生長。本發(fā)明所提供的鼠RANK胞外蛋白晶體在篩選治療骨吸收類疾病或抗骨吸收藥物 中的應(yīng)用，包括根據(jù)該蛋白晶體的結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬來篩選可能結(jié)合到特定部位的任 一種多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物；根據(jù)該蛋白晶體的結(jié)構(gòu)，通過計算 機模擬來篩選可能結(jié)合到特定部位的已知多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機 物；其中與該鼠RANK胞外蛋白序列具有至少50%同源性的任何RANK胞外蛋白結(jié)合的多 肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物或者與RANK胞外蛋白的親和力PD2值> 4. O 的多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物為候選物；通過生物學(xué)實驗確定所述候 選化合物在治療骨吸收類疾病或抗骨吸收藥物中的應(yīng)用。


圖IA示出了未結(jié)合狀態(tài)的鼠RANK胞外區(qū)域二聚體的三維結(jié)構(gòu)；
圖IB示出了鼠RANK單體鏈A和單體鏈B的重疊；圖IC示出了參與到胞外區(qū)域二聚體相互作用的重要殘基；圖ID是在圖IC的基礎(chǔ)上加有深色背景，以更清楚的識別二聚體相互作用中的重
要殘基；圖2示出了未結(jié)合與結(jié)合RANKL狀態(tài)下RANK在三維構(gòu)象上的差異；圖3示出了存在于鼠RANK單體鏈中的鈉離子以 及其與其它氨基酸之間的相互作用。
具體實施例方式一、表達及純化1.鼠RANK胞外蛋白的表達與純化
鼠RANK的氨基酸序列如下MAPRARRRRQLPAPLLALCVLLVPLQVTLQVTPPCTQERHYEHLGRCCSRCEPGKYLSSKCTPTSDSVC LPCGPDEYLDTWNEEDKCLLHKVCDAGKALVAVDPGNHTAPRRCACTAGYHWNSDCECCRRNTECAPGFGAQHPLQL NKDTVCTPCLLGFFSDVFSSTDKCKPffTNCTLLGKLEAHQGTTESDVVCSSSMTLRRPPKEAQAYLPSLIVLLLFIS VVVVAAIIFGVYYRKGGKALTANLWNWVNDACSSLSGNKESSGDRCAGSHSATSSQQEVCEGILLMTREEKMVPEDG AGVCGPVCAAGGPWAEVRDSRTFTLVSEVETQ⑶LSRKIPTEDEYTDRPSQPSTGSLLLIQQGSKSIPPFQEPLEVG ENDSLSQCFTGTESTVDSEGCDFTEPPSRTDSMPVSPEKHLTKEIE⑶SCLPWVVSSNSTDGYTGSGNTPGEDHEPF PGSLKCGPLPQCAYSMGFPSEAAASMAEAGVRPQDRADERGASGSGSSPSDQPPASGNVTGNSNSTFI SSGQVMNF K⑶IIWYVSQTSQEGPGSAEPESEPVGRPVQEETLAHRDSFAGTAPRFPDVCATGAGLQEQGAPRQKDGTSRPVQE QGGAQTSLHTQGSGQCAE劃線部分為鼠RANK胞外區(qū)域的氨基酸序列材料寡聚核苷酸由Sangon Biotech (China)制備而成；從Fermentas購得限制性內(nèi)切 酶、T4DNA連接酶以及第一鏈eDNA合成試劑盒；從Tiangen Biotech (China)購得pfu DNA 聚合酶；從Sigma購得谷胱苷肽(還原型和氧化型)；谷胱苷肽瓊脂糖凝膠4B獲自通用電 氣醫(yī)療集團(GE Healthcare) ；TRIZOL試劑購自Invitrogen. Inc.；所有其它得化學(xué)物質(zhì)均 為分析純。質(zhì)粒及菌株編碼成熟鼠RANK胞外區(qū)域(殘基26-210)的cDNA為鼠RAW264. 7細(xì)胞的mRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)所獲得，并且克隆到pET28載體(Novagen)中。用于GST-RANKL表 達的質(zhì)粒(殘基 159-361)獲贈于 Daved H. Fremont 教授(Department of Pathology andlmmunology, Washington University School of Medicine, USA.),用 E. coli 菌株 BL21-Gold(購買于Stratagene公司)表達重組蛋白。表達及純化在E.coli菌株BL21-Gold(DE3)中，重組RANK主要以包涵體形式表達。該包涵體 通過超聲處理而被純化并且重新溶解在6M的鹽酸胍中。重組RANK的重新折疊通過如下步 驟而實現(xiàn)該包涵體稀釋在包含20mM的Na2HPO4 (pH 7. 3) UM L-精氨酸、20%甘油、IOmM還 原型谷胱苷肽以及ImM氧化型谷胱苷肽的復(fù)性(IB)溶液中，然后在含有20mM的Na2HPO4 (pH 7.3)、0.5M L-精氨酸、10%甘油的重新折疊緩沖液1中4°C下透析12小時，然后在含有 20mM的Na2HPO4(pH 7. 3)、0. 2M L-精氨酸、5%甘油的重新折疊緩沖液2中4°C下透析12小 時，最后在20mM的Na2HPO4 (pH 7. 3)、0· 2M L-精氨酸中4°C下透析12小時，在20000g離心 10分鐘后，將上清液用瓊脂75 (Superdex 75)色譜柱(購自Amersham pharmacia公司)進 行純化，并且收集正確折疊的鼠RANK，并用SDS-PAGE分析。2.鼠RANKL的表達和純化鼠RANKL的氨基酸序列如下MRRASRDYGKYLRSSEEMGSGPGVPHEGPLHPAPSAPAPAPPPAASRSMFLALLGLGLGQVVCSIALFLYFRAQMDPNRISEDSTHCFYRILRLHENADLQDSTLESEDTLPDSCRRMKQAFQGAVQKELQHIVGPQRFSGAPA MMEGSffLDVAQRGKPEAQPFAHLTINAASIPSGSHKVTLSSffYHDRGffAKISNMTLSNGKLRVNQDGFYYLYANI CFRHHETSGSVPTDYLQLMVYVVKTSIKIPSSHNLMKGGSTKNffSGNSEFHFYSINVGGFFKLRAGEEISIQVSN PSLLDPDQDATYFGAFKVQDID劃線部分為鼠RANKL胞外區(qū)域的氨基酸序列鼠RANKL的可溶性胞外區(qū)域是以谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白形式表達的；融 合蛋白利用谷胱苷肽瓊脂糖凝膠4B(購自Amersham pharmacia公司)進行親和純化，用 PreScission蛋白酶進行切割；酶切所得的RANKL用瓊脂糖75 (Superdex 75)色譜柱(購 自 Amersham pharmacia 公司)純化。二、RANK胞外區(qū)域蛋白的結(jié)晶化將最終純化的RANK在pH 7. 00的IM TRIS緩沖溶液中濃縮成10mg/mL。在溫度 為294K的條件下，利用高通量納升坐滴蒸汽擴散方法(sitting drop vapour diffusion method)形成RANK胞外區(qū)域的晶體網(wǎng)格(crystallization screen)，并且利用牛津蛋白產(chǎn) 物工具中的自動結(jié)晶圖像系統(tǒng)進行監(jiān)控。得到的晶體初始在兩個條件下成長1)20%的PEG 3350,0. 2M酒石酸鈉；2)30% 的PEG 5000,0. 2M的硫酸鈉，以及pH6. 5的0. IM生物緩沖液MES。在條件1)下的晶體生長 很難重復(fù)，在條件2)下很容易再生長，但它們多以多倍體形式存在。通過實驗發(fā)現(xiàn)，在含有 IOOnL 蛋白質(zhì)溶液和 IOOnL pH 為 6. 5 的 10% PEG 3350,15% PEG 5000,0. IM硫酸銨，0. IM 酒石酸鈉和0. 05M MES的池液的液滴中，可以得到晶體生長最好的鼠RANK胞外區(qū)域蛋白晶 體。三、鼠RANK/RANKL胞外區(qū)域復(fù)合體晶體的形成與結(jié)構(gòu)測定以1 1的比例混合兩種蛋白而制的RANK/RANKL復(fù)合體蛋白溶液。在溫度為 294K的條件下，利用高通量納升坐滴蒸汽擴散方法形成RANK/RANKL胞外區(qū)域的晶體網(wǎng)格 (crystallization screen)，并且利用牛津蛋白產(chǎn)物工具中的自動結(jié)晶圖像系統(tǒng)進行監(jiān) 控(Mayo等2005，Walter等2005)。在以下兩個優(yōu)選條件下得到了生長情況最好的晶體 1)0. IM 磷酸二氫鈉，2M 氯化鈉，0. IM 二氫磷酸鉀和 0. IM MES (pH 6.5) ； 2) 20% 的 PEG 3350 以及0. 2M的甲酸銨，結(jié)晶液滴中含有IOOnL蛋白溶液以及IOOnL池液。在條件1下得到RANK/RANKL復(fù)合體晶體的X-射線數(shù)據(jù)是在ESRF，利用光束線 ID23-EH2得到的。在0.873A下，從單晶的2個位置收集到衍射震蕩為1. 0°的180個圖 像。在波長1.060A下，利用鉆石的光束線103得到了條件2下生長的復(fù)合體晶體的X-射 線數(shù)據(jù)。25%甘油作為冷凍保護劑加入到結(jié)晶液滴中，晶體被冷凍起來并且在整個數(shù)據(jù)采 集階段，采用氮氣的冷凍流來保持晶體處于100K。利用HKL2000(Ref.)對數(shù)據(jù)圖像進行索 弓丨，積分和合并。采用計算機程序分析得到RANK/RANKL復(fù)合體晶體中RANK的構(gòu)型模型。四、RANK晶體結(jié)構(gòu)的測定在法國Glenoble的歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)法國分部(ESRF)，利用光束線 BM14測得RANK的X_ray數(shù)據(jù)。在波長0.954A下，從單晶中收集到衍射震蕩為1. 0°的180 個圖像。25%甘油作為冷凍保護劑加入到結(jié)晶液滴中，晶體被冷凍起來并且在整個數(shù)據(jù)采 集階段采用氮氣的冷凍流將晶體保持在100K的溫度。利用HKL2000(Ref.)對數(shù)據(jù)圖像進 行索引，積分和合并。表1中給出了 X-ray衍射數(shù)據(jù)。
五、結(jié)果解析1.晶體結(jié)構(gòu)測試結(jié)果表lX-ray衍射結(jié)果 括號中的數(shù)據(jù)是高分辨率的結(jié)果。Rrak和Rftra定義為R = Σ hkl I I Fobs I -1 Fcalc I I / Σ hkl I Fobs ι，其中 h，k，1 是指反射指數(shù)(用于 Rw。a 精細(xì)化；5%，不用 于Rfree的精細(xì))，F(xiàn)。bs和F。al。是結(jié)構(gòu)因子，從測量的強度中推論出來并通過模型計算出來。平均B因子用于蛋白，水和其他原子鼠RANK胞外區(qū)域蛋白晶體的三維晶體結(jié)構(gòu)的參數(shù)為空間群組為PZfP1,晶胞的 尺寸為 a=39.82A,b=94.25A*c=102.42A。2.鼠RANK胞外區(qū)域蛋白的結(jié)構(gòu)解析2. 1解析方法在利用同步輻射收集相關(guān)數(shù)據(jù)后，利用鼠RANK/RANKL復(fù)合體晶體中的RANK模型 作為起始模型，利用CCP4軟件包中MOLREP程序通過分子置換法首次解析了鼠RANK胞外區(qū) 域蛋白的三級結(jié)構(gòu)。RANK單體具有作為其家族的代表性結(jié)構(gòu)的TNF樣jelly折疊。帶有 2,6-His標(biāo)記的RANK的分子質(zhì)量為23. 5kDa。從建立的部分模型中計算出來的初步衍射電 子密度圖譜清楚的顯示出了 RANK多肽，并且該圖譜顯示出能夠構(gòu)建RANK胞外區(qū)域蛋白分 子的4CRD區(qū)域的特性。利用復(fù)合體中的RANK模型解析未結(jié)合配體的RANK胞外區(qū)域的晶體結(jié)構(gòu)。但是， 由于RANK薄而狹長的形狀以及分子的柔性大，利用分子替代方法對結(jié)構(gòu)的解析并不容易。 在利用程序PHASER(ccp4 ref)定位中心2CRD區(qū)域后，才得到未結(jié)合配體的RANK的正確解 析結(jié)果。對于從30至4.0A的數(shù)據(jù)，初始的R因子是0. 54。
2. 2未結(jié)合配體的鼠RANK胞外區(qū)域的三級結(jié)構(gòu)對于未結(jié)合配體的鼠RANK胞外區(qū)域蛋白結(jié)構(gòu)，在一個不對稱晶胞中的兩個分子 是通過局部的2次對稱旋轉(zhuǎn)軸相關(guān)聯(lián)的，該未結(jié)合配體的RANK模型與RANKL-RANK復(fù)合體 中的RANK模型疊加后發(fā)現(xiàn)在第一至第四CRD區(qū)域之間存在很大的區(qū)別，這說明存在較大的 構(gòu)型差異。在修正后，利用所有的數(shù)據(jù)至2.0A的辨析率，構(gòu)建出第一和第四CRD區(qū)域。RANK最終精細(xì)化結(jié)構(gòu)具有良好的晶體學(xué)R因子以及立體化學(xué)，以上結(jié)果均已在表 1中示出。未結(jié)合配體的RANK胞外區(qū)域蛋白以反向平行(頭-對-尾)的二聚體形式存在， 即由單體鏈A及單體鏈B構(gòu)成(如圖1A)。每個二聚體具有四個CRD，存在于CRD結(jié)構(gòu)域中 的多個二硫鍵使得RANK分子形成細(xì)長的帶狀。利用Vega ZZ 2. 1軟件分析可知兩個單體鏈 的均方根差(RMSD)為2.13 A。不同的結(jié)構(gòu)域具有不同的RMSD，相對于Ca原子，RMSD的范 圍從CRD3中的0.35 A至CRD2中的1.05 A (如圖IB)。兩個反向平行的分子互相重疊，形 成的二聚體的長度接近于單體的長度。除去溶劑后的二聚體形成的總面積約為3231人2， 并且兩個單體包含的面積被平分。利用Pymol軟件分析可知在RANK 二聚體中，主要在兩個 單體鏈的CRD2和CRD3之間通過范德化力、氫鍵和鹽鍵，形成亞單位之間的相互作用。參與 到這種相互作用的重要殘基是單體鏈A的Gln-145、Asn-147和Lys_171以及單體鏈B的 Asn-147、Gln-145和Glu-84，它們之間形成極性相互作用(見圖IC及圖1D)。利用Pymol軟件分析，結(jié)合狀態(tài)以及未結(jié)合配體狀態(tài)的RANK分子之間的差別如 下(1)復(fù)合體中的RANK受體單體是被拉直的，與它們的未結(jié)合狀態(tài)相比，彎曲度減少。未 結(jié)合狀態(tài)與復(fù)合體狀態(tài)相比，位置Lys-91處的扭轉(zhuǎn)角度發(fā)生60度的變化。(2)螺旋構(gòu)象 中的環(huán)IOOS(殘基102-112)在RANK與RANKL結(jié)合的過程中發(fā)生了移動，該移動起始于位 置Val-102，扭轉(zhuǎn)角度發(fā)生約50度的改變，并在位置Cys-113處終止。這種改變有助于穩(wěn) 定受體與配體結(jié)合的最適宜的構(gòu)型。(3)在螺旋結(jié)構(gòu)中，環(huán)120S僅發(fā)生很小的移動，并且 在受體的兩種狀態(tài)中，扭轉(zhuǎn)角度僅發(fā)生15度的改變。(4)通過結(jié)合，RANK的C末端發(fā)生了 一些構(gòu)型的改變。兩個區(qū)域，即殘基182-185，以及殘基194-196的自由卷曲構(gòu)型轉(zhuǎn)化成復(fù) 合體中的2個較短的β-片層構(gòu)型，從而形成了較為有序的結(jié)構(gòu)域。(5)參與到形成RANK 二聚體中單體鏈A及單體鏈B之間的相互作用的大多數(shù)重要殘基，如Gln-145，Asn-147以 及Lys-171都位于RANK/RANKL復(fù)合體的外螺旋區(qū)域，并不直接參加RANK與RANKL的相互 作用。在本研究中，未結(jié)合配體的RANK胞外區(qū)域蛋白在pH6. 5下結(jié)晶形成反向平行二聚 體，這一點向人們示出，當(dāng)受體沒有與配體結(jié)合時，TNF受體家族成員的胞外區(qū)域之間可形 成二聚體的特性。但是，RANK的構(gòu)型并不同于TNFR-I 二聚體的兩個反向平行的構(gòu)型。在 PH7. 5下，在TNFR-I 二聚體的反向平行構(gòu)型中，兩個單體僅在每個分子的N末端部分重疊， 而本發(fā)明提供的RANK 二聚體的反向平行構(gòu)型產(chǎn)生了非常強烈的相互作用。在pH 3. 7下， 盡管反向平行的TNFR-I 二聚體中的兩個單體是完全重疊的，但兩個單體以左手雙螺旋的 形式纏繞在一起，而在反向平行的RANK 二聚體中，這兩個單體形成右手雙螺旋。未結(jié)合配 體的RANK構(gòu)型的差異也表明了 TNF受體家族成員的特異性。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，在形成的 二聚體中，在CRD3結(jié)構(gòu)域以及CRD4結(jié)構(gòu)域之間 的螺旋區(qū)域中分別觀察到了一個與之結(jié)合的金屬離子，根據(jù)結(jié)合位點的平均鍵長，計算得到的該金屬離子的平均鈣鍵-化合價總和(CBVS，calcium bond-valence sum)為1.2， 對于鈉離子，CBVS的預(yù)期值為1. 6，鉀離子為0. 6，鈣離子為2. 0，錳離子為3. 2，鎂離子為 4. 2 (Mulle等，2003)，所以推斷該金屬離子為鈉離子；通過在波長1.698 A下收集到的數(shù) 據(jù)計算出的異常繞射差異圖(anomalous difference map)，該推斷被進一步證實，目前為 止在其它TNF受體家族成員中尚未有相似報道。該鈉離子可與Cys-134、Ala-135、Phe-138 和Val-163以及骨架Ser-161側(cè)鏈的羰基基團螯合。(見圖3)結(jié)合以上說明，本發(fā)明揭示出了鼠RANK胞外區(qū)域蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。從上述晶體結(jié)構(gòu)中，不難找到單體鏈A和單體鏈B相互作用中的重要殘基。根據(jù)NCBI網(wǎng)站(www.ncbi. nlm. nih. gov)上Blast的分析結(jié)果，鼠與人的RANK胞外區(qū)域的同源性為83%，所以利用這 些信息，我們可以繼續(xù)探尋RANK/RANKL所引起的生物活性的激活途徑，設(shè)計出能夠調(diào)節(jié)相 關(guān)生物激活途徑的藥物。本發(fā)明提供了鼠RANK胞外蛋白晶體在篩選治療骨吸收類疾病或 抗骨吸收藥物中的應(yīng)用，包括根據(jù)該蛋白晶體的結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬來篩選可能結(jié)合到 特定部位的任一種多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物；根據(jù)該蛋白晶體的結(jié) 構(gòu)，通過計算機模擬來篩選可能結(jié)合到特定部位的已知多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無 機物或有機物；其中與該鼠RANK胞外蛋白序列具有至少50%同源性的任何RANK胞外蛋白 結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物或者與RANK胞外蛋白的親和力PD2 值> 4. 0的多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物為候選物；通過生物學(xué)實驗確 定所述候選化合物在治療骨吸收類疾病或抗骨吸收藥物中的應(yīng)用。上文中，基于特定優(yōu)選的實施方式描述了本發(fā)明，然而在不違背所附權(quán)利要求中 所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可增加多種變化和修改，這對于本領(lǐng)域中的普通 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)是顯而易見的。序列表<110>中國人民解放軍總醫(yī)院北京表源生物技術(shù)有限公司<120>鼠RANK胞外蛋白晶體<130>P21358BYSff<160>2<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>625<212>PRT<213> 鼠 RANK 蛋白<400>1Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Gln Leu Pro Ala Pro Leu Leu151015Ala Leu Cys Val Leu Leu Val Pro Leu Gln Val Thr Leu Gln Val Thr202530Pro Pro Cys Thr Gln Glu Arg His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys354045
Ser Arg Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Leu Ser Ser Lys Cys Thr Pro Thr505560 Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Thr65707580Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Val Cys Asp Ala Gly859095Lys Ala Leu Val Ala Val Asp Pro Gly Asn His Thr Ala Pro Arg Arg100105110Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys115120125Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Phe Gly Ala Gln His Pro Leu130135140Gln Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Thr Pro Cys Leu Leu Gly Phe Phe145150155160Ser Asp Val Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys165170175Thr Leu Leu Gly Lys Leu Glu Ala His Gln Gly Thr Thr Glu Ser Asp180185190Val Val Cys Ser Ser Ser Met Thr Leu Arg Arg Pro Pro Lys Glu Ala195200205Gln Ala Tyr Leu Pro Ser Leu lie Val Leu Leu Leu Phe lie Ser Val210215220Val Val Val Ala Ala lie lie Phe Gly Val Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly225230235240Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp Asn Trp Val Asn Asp Ala Cys Ser245250255Ser Leu Ser Gly Asn Lys Glu Ser Ser Gly Asp Arg Cys Ala Gly Ser260265270His Ser Ala Thr Ser Ser Gln Gln Glu Val Cys Glu Gly lie Leu Leu275280285Met Thr Arg Glu Glu Lys Met Val Pro Glu Asp Gly Ala Gly Val Cys290295300Gly Pro Val Cys Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Glu Val Arg Asp Ser305310315320Arg Thr Phe Thr Leu Val Ser Glu Val Glu Thr Gln Gly Asp Leu Ser325330335Arg Lys lie Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Thr Asp Arg Pro Ser Gln Pro340345350Ser Thr Gly Ser Leu Leu Leu lie Gln Gln Gly Ser Lys Ser lie Pro
355360365Pro Phe Gln Glu Pro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln370375380Cys Phe Thr Gly Thr Glu Ser Thr Val Asp Ser Glu Gly Cys Asp Phe385390395400Thr Glu Pro Pro Ser Arg Thr Asp Ser Met Pro Val Ser Pro Glu Lys405410415His Leu Thr Lys Glu lie Glu Gly Asp Ser Cys Leu Pro Trp Val Val420425430Ser Ser Asn Ser Thr Asp Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Asn Thr Pro Gly435440445Glu Asp His Glu Pro Phe Pro Gly Ser Leu Lys Cys Gly Pro Leu Pro450455460Gln Cys Ala Tyr Ser Met Gly Phe Pro Ser Glu Ala Ala Ala Ser Met465470475480Ala Glu Ala Gly Val Arg Pro Gln Asp Arg Ala Asp Glu Arg Gly Ala485490495Ser Gly Ser Gly Ser Ser Pro Ser Asp Gln Pro Pro Ala Ser Gly Asn500505510Val Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr Phe lie Ser Ser Gly Gln Val Met515520525Asn Phe Lys Gly Asp lie lie Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln530535540Glu Gly Pro Gly Ser Ala Glu Pro Glu Ser Glu Pro Val Gly Arg Pro545550555560Val Gln Glu Glu Thr Leu Ala His Arg Asp Ser Phe Ala Gly Thr Ala565570575Pro Arg Phe Pro Asp Val Cys Ala Thr Gly Ala Gly Leu Gln Glu Gln580585590Gly Ala Pro Arg Gln Lys Asp Gly Thr Ser Arg Pro Val Gln Glu Gln595600605Gly Gly Ala Gln Thr Ser Leu His Thr Gln Gly Ser Gly Gln Cys Ala610615620Glu625<210>2<211>316<212>PRT <213>鼠RANKL蛋白氨基酸序列
<400>2Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu151015Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro202530Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser354045 Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser505560lie Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg lie65707580Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg lie Leu Arg Leu His Glu859095Asn Ala Asp Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro100105110Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys115120125Glu Leu Gln His lie Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala130135140Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu145150155160Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr lie Asn Ala Ala Ser lie Pro Ser165170175Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp180185190Ala Lys lie Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn195200205Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn lie Cys Phe Arg His His210215220Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr225230235240Val Val Lys Thr Ser lie Lys lie Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys245250255Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr260265270Ser lie Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu lie275280285Ser lie Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala290295300
Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp lie Asp305310 31權(quán)利要求
一種胞外區(qū)域蛋白的晶體，其中所述晶體包括鼠RANK胞外區(qū)域的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晶體，其中所述胞外區(qū)域是指鼠RANK單體N-末端從26位氨 基酸至210位氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的晶體，其中所述晶體由鼠RANK單體鏈A及單體鏈B形成的二 聚體構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的晶體，其中所述晶體具有空間群PZfA，晶胞參數(shù) 為a二39.82 A,b=94.25 A和 c=102.42 A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的晶體，其中所述二聚體以反向平行形式存在；所 述單體鏈A及單體鏈B含有四個CRD結(jié)構(gòu)域，存在于所述四個CRD結(jié)構(gòu)域中的多個二硫鍵使 得所述兩個單體鏈形成細(xì)長的帶狀；所述兩個單體鏈的重疊所形成的均方根差為2.13A， 除去溶劑后的二聚體所形成的總面積為3231 A2丨所述兩個單體之間所包含的面積被等 分，所述二聚體的長度與所述RANK的單體鏈長度近似。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的晶體，其中在所述二聚體中，所述四個CRD結(jié)構(gòu)域具有不同的均方根差值，所述均方根值的范圍為對于C α原子從CRD3的α35入至0 2的1·05 A。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的晶體，其中所述單體鏈A以及單體鏈B主要在所述CRD2和 CRD3結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，涉及到所述相互作用的重要殘基為所述單體鏈A的Gln-145、 Asn-147 和 Lys-171 以及所述單體鏈 B 的 Asn-147、Gln-145 和 Glu-84。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的晶體，其中所述單體鏈A以及所述單體鏈B分 別存在一個鈉離子，所述鈉離子可與所述兩個單體鏈上的Cys-134、Ala-135、Phe_138、 Val-163以及骨架上的Ser-161側(cè)鏈的羰基基團螯合。
9.一種制備RANK胞外蛋白晶體的方法，包括(1)將純化的RANK在pH 7. 00的IM TRIS 緩沖溶液中濃縮成10mg/mL ；(2)在溫度為294K的條件下，利用高通量納升坐滴蒸汽擴散方法形成RANK胞外蛋白的 晶體；3)所述RANK晶體在20% PEG 3350,0. 2M酒石酸鈉條件下生長。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述RANK晶體在30%的PEG5000,0. 2M的硫酸 鈉，以及ρΗ6· 5的0. IM MES的條件下生長。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述RANK晶體在含有IOOnL蛋白質(zhì)溶液和IOOnL PH 為 6. 5 的 10% PEG 3350，15% PEG 5000,0. IM 硫酸銨，0. IM 酒石酸鈉和 0. 05M MES 的池 液的液滴中生長。
12.權(quán)利要求1-3中任一項所述的鼠RANK胞外蛋白晶體在篩選治療骨吸收類疾病或抗 骨吸收藥物中的應(yīng)用，包括根據(jù)所述蛋白晶體的結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬來篩選可能結(jié)合到特定部位的任一種多 肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物；根據(jù)該蛋白晶體的結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬來篩選可能結(jié)合到特定部位的已知多肽、蛋 白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物；其中與所述RANK胞外蛋白序列具有至少50%同源性的任何RANK胞外蛋白結(jié)合的多 肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物或者與RANK胞外蛋白的親和力PD2值> 4. O 的多肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫結(jié)合物、無機物或有機物為候選物；通過生物學(xué)實驗確定所述候選化合物在治療骨吸收類疾病或抗骨吸收 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鼠RANK胞外蛋白晶體，以及該RANK胞外蛋白晶體在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/68GK101845090SQ20091008073
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者劉長振, 唐佩福, 張世謙, 高斌, 黃鵬 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院;北京表源生物技術(shù)有限公司