專利名稱：選擇性誘導晶狀體上皮細胞脫落和/或死亡以阻止后囊膜混濁的處理溶液和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的處理溶液和方法，所述處理溶液和方法包括單 獨應用或與其它藥物合并應用離子轉運機制干擾劑，通過選擇性誘 導晶狀體上皮細胞脫落和/或細胞死亡以阻止后囊膜混濁，而對其它 眼部細胞和組織無損害，且無需冗長的術前處理。發(fā)明背景人眼晶狀體的主要作用是將透過角膜和房水的光線聚集到視網(wǎng) 膜上。晶狀體的結構和代謝直接有助于保持其完整性和透明度。晶 狀體在不同的成熟階段，完全由上皮細胞組成，且獨特之處在于，組織在成熟過程中從來沒有^皮拋棄過。當新的晶狀體細^^形成后， 老的細胞便被遷移至晶狀體內部。不久，晶狀體就隔離于直接的血 液供應，并依靠房水和玻璃體液以獲取營養(yǎng)或做為消除通路。晶狀胞和可以降低胞內空間的纖維的密集填塞。因而，保持晶狀體的精 細結構成為晶狀體的一種必要特征。晶狀體已經(jīng)進化了其獨特能力， 可以通過調整其離子、糖、氨基酸和水平衡來保持其恒定容積。人眼白內障是由于晶狀體喪失透明度而引起的光線傳播的中 斷。白內障可引起視覺模糊和混濁，是至今為止視力精確度降低的 最常見的原因?；鞚岬木铙w可以通過手術操作去除，如白內障嚢外摘除術(ECCE)， ECCE包括通過手動或自動真空技術摘除包含皮 質的臨床核，而后囊和赤道嚢完整保留，做為包膜或者口袋，在其 中可植入后房型人工晶狀體(intraocular lens)。如果后嚢和晶體韌帶 完整，植入的晶狀體通常會保留在該適當位置，終其一生，而無任 何并發(fā)癥。手術中，小心打開晶狀體前嚢，摘除白內障，將人工晶 狀體植入到其余的后囊部。但這同樣會引起正常晶狀體調節(jié)功能的 部分喪失。標準的白內障手術包括稱為晶狀體乳化這一操作。該操作攪動 晶狀體內容物，引起晶狀體內物質的解體，然后通過晶狀體乳化探 頭同時注入和吸出洗滌液將其沖洗出晶狀體囊。脫落的死的和活的 晶狀體上皮細胞都會被該處理的沖洗操作洗滌出嚢。在發(fā)展新的白內障治療方法方面，已經(jīng)取得了進步，包括保留 晶狀體前嚢和用可注射材料替代晶狀體內容物方面。手術后，視力得到恢復，但主流白內障手術最常見的并發(fā)癥是術后晶狀體上皮細胞(LECs)的增殖。后嚢膜渾濁(PCO)也稱為繼發(fā)性 白內障，是白內障囊外摘除術的常見并發(fā)癥，病人的發(fā)病率為20% ~ 40%。在過去十年中，多項試驗和臨床研究結果使我們更好的理解 了 PCO的發(fā)病機理。PCO主要是剩余LECs增殖并遷移至晶狀體后嚢所致。盡管手 術中須小心去除大部分殘余的晶狀體上皮細胞，但它們很難去除。 所以，手術操作結束時很多LECs滯留在晶狀體囊袋中。LECs的增 殖引起人工晶狀體所植入的膜或袋隨時間推移變得渾濁。LECs的增 殖在白內障新的治療方法應用中也是一個重要問題，如可注射晶狀 體。形成的渾濁膜被稱為"后發(fā)性白內障"或PCO。 PCO的癥狀與 白內障相同，如不治療可引起視力逐漸喪失，最后導致失明。人們做出各種努力阻止或減少PCO的形成。這些努力可分為三 個領域手術方式的改進，晶狀體設計方面的改良和化學手段阻止。已經(jīng)發(fā)展了多種手術策略以阻止PCO,其中包括使用各種手術 器具和利用激光、超聲和冷凍技術。 一旦PCO發(fā)生，YAG激光嚢切開術可利用激光束在渾濁嚢中心形成一個開口，是一種簡單，快 速的操作。但YAG激光囊切開術有嚴重風險，主要包括視網(wǎng)膜脫離、 青光眼和黃斑囊樣水腫的發(fā)生。多數(shù)研究的興趣點主要集中在制作人工晶狀體的材料類型和人工晶狀體邊緣的形狀設計上，據(jù)報道，雙凸形和平凸形(planer convex) 聚丙烯酸甲酯，還有硅凝膠襻板式人工晶狀體和具有銳視覺邊緣 (sharp optic edges)的晶狀體對阻止PCO具有有益效果。尤其是， Alcon's Acrysof晶狀體在該領域做出了重大進步。但這些晶狀體相 對昂貴，并帶來了它們自己的并發(fā)癥或限制。還有其它利用化學藥物破壞或者阻止LECs增殖的嘗試。在2001 年9月21日遞交的英國專利申請0122807.1中，提出的假說為經(jīng) 醛糖還原酶抑制劑，通過調節(jié)山梨醇通路降低LECs細胞內山梨醇 濃度，因滲透沖擊(osmotic shock)誘導LECs死亡而阻止PCO。但為 調節(jié)山梨醇通路提議的治療方案包括手術前預處理晶狀體嚢袋48h， 所以要整合入現(xiàn)在的白內障手術并非易事。其它的化學治療也曾被嘗試過，如，應用免疫毒素偶聯(lián)的LECs 特異性抗體可以降低，但不能完全阻斷PCO發(fā)生，見Clark et al, J. Cataract Refract. Surg. 1998 Dec; 24(12): 1614-20禾口 Meacock et al， J. Cataract Refract. Surg. 2000 May; 26(5):716- 21 。利用乙二胺四乙酸、 胰蛋白酶和DISPASE⑧(中性蛋白酶)分離LECs,但破壞了韌帶和周 圍組織，見Nishi，丄Cataract Refract. Surg. 1999 Jan; 25(1): 106-17和 Nishi et al, Opthalmic Surg. 1991 Aug; 22(8):444-50。其它藥物包括 RGD肽，也被測試能否阻止PCO,抑制晶狀體細胞晶狀體上皮細胞 的遷移和增殖；還有抗有絲分裂藥物，如絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶。 見Chung HS, Lim SJ, Kim HB. J Cataract Refract Surg. 2000 Oct; 26(10): 1537-42; Shin DH, Kim Y.Y., Ren丄et al. Ophthalmology. 1998; 105:1222-1226。遺憾的是，如果在有效劑量應用上述化學藥物，其中大多數(shù)對 眼組織周圍包括眼部細胞，如角膜內皮細胞(CEDCs)和視網(wǎng)膜色素 上皮細胞(RPECs)，都表現(xiàn)出不能4^受的毒性水平。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，已克服上述討論的先前阻止PCO手段的缺點。本 發(fā)明通過快速的、選擇性的誘導晶狀體上皮細胞(LECs)脫落和/或死 亡，阻止PCO，而對其它眼部細月包和組織無明顯損傷，因而^艮容易 整合入已有的標準白內障手術和未來具有潛力的新治療方法中，并處理溶液可以阻斷PCO。在白內障手術前，手術中，或手術后，將 處理溶液應用或引入到晶狀體嚢袋中。另外，處理溶液也可在白內 障手術前應用到可注射人工晶狀體上。處理溶液包含一種離子轉運機制千擾劑，可以單獨應用，也可與其它處理藥物合并應用，如滲 透脅迫劑(osmotic stress agent)和建立合適pH的藥物，可選擇性的謙 導晶狀體上皮細胞(LECs)脫落和/或死亡，從而阻止后嚢膜混濁的發(fā) 生。由于離子轉運機理干擾劑可以干擾廣譜細胞的細胞機理和離子 分布，須選擇合適的藥物濃度使得可以選擇性的干擾上皮細胞的細 胞機理，而對其它眼部細胞基本上無損害。該處理溶液可選擇性的 誘導晶狀體上皮細胞(LECs)的脫落和/或死亡，而對其它眼部細胞和 組織基本上無損害，也無外科手術前冗長的預處理過程。處理溶液可于白內障手術前，手術中和手術后被應用或引入， 通過如下方式快速的、選擇性的去除LECs: (i)通過干擾細胞正常功 能，選擇性誘導LECs從其基底或膜上脫落，導致細胞最終死亡或 至少使去除LECs變的容易；(ii)通過千擾細胞正常功能，選擇性誘 導LECs細胞死亡；和/或(iii)通過千擾細胞正常功能，誘導LECs對 滲透脅迫的易感性，最終導致細胞脫落和/或死亡。本發(fā)明使得干擾 廣譜細胞離子轉運機制的化學藥物特異的、獨特的靶向LECs。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過應用 一種離子轉運機制干擾 劑誘導LECs較其它眼部細胞發(fā)生相當大(substantially greater)比率的 脫落和/或死亡以阻止PCO。本發(fā)明的離子轉運干擾劑能夠直接或間
接干擾LECs細胞外、細胞內和/或細胞間調節(jié)離子和水跨細胞膜的 機制。這種干擾可以引起細胞收縮和/或膨脹，結果引起細胞的脫落 和/或死亡。選擇藥物的濃度使得含有離子轉運干擾劑的處理溶液可 引起晶狀體上皮細胞發(fā)生明顯脫落或死亡，而不引起較大百分數(shù)的 其它眼部細胞脫落和/或死亡。尤其是，離子轉運機制千擾劑可包括 協(xié)同轉運干擾劑、鈉泵干擾劑、交換干擾劑或通道干擾劑。離子轉運干擾劑本身可誘導LECs細胞容積變化和/或細胞脫落 和/或死亡，或使LECs易感，以至于不能對可引起滲透壓脅迫的其 它藥物做出充分的響應，選擇性的脫落和/或殺死LECs，阻止PCO。 這些其它藥物是一種滲透脅迫劑，例如在LECs中可誘導滲透沖擊， 虧1起細胞脫落和/或死亡的滲透劑。本發(fā)明的處理溶液具有合適的pH，是根據(jù)特定滲透脅迫時的選 擇性濃度確定的，可用酸、堿或其它藥物升高或降低溶液中氫離子 濃度調節(jié)溶液pH。本發(fā)明的這些和其它優(yōu)點及新穎特征，還有其中的一些細節(jié)， 將在接下來的描述中得到更為充分的理解。附圖簡述

圖1.闡明了不同眼部細胞(LECs 、 RPECs和CEDCs)《1入包含各 種濃度的NaCl溶液后的生存能力；圖2.闡明了在無(菱形)或有30 yM呋噻米(圓圈)(一種協(xié)同轉運 干擾劑)的情況下，對LECs應用濃度遞增的NaCl溶液后的細胞生 存能力；圖3.闡明了對LECs應用pH水平變化的、包含濃度遞增的NaCl 溶液后總LECs的生存能力；圖4.闡明了對RPECs應用在變化pH水平下包含濃度遞增的 NaCl溶液后的生存能力；圖5.闡明了對LECs和RPECs應用包含^200 mM NaCl、濃度遞增的協(xié)同轉運干擾劑呋噻米和3 m 1 5N NaOH的處理溶液后的生存 能力；圖6.闡明了對LECs、 RPECs和CEDCs應用包含^ 200 mM NaCl、濃度遞增的協(xié)同轉運干擾劑布美他尼和3nl 5N NaOH的處 理溶液后的生存能力；圖7.為3張圖片，闡明了本發(fā)明的處理溶液處理原代培養(yǎng)的 LECs的效應，(A)0min， (B)5min和(C)洗滌后10min。圖8.為4張圖片，闡明了本發(fā)明的處理溶液處理人器官培養(yǎng)PCO 才莫型中的原代培養(yǎng)LECs的效應，(A)處理前，(B)處理后5min， (C) 處理后10min和(D)洗滌后；圖9.為4張圖片，闡明了應用包含^ 200 mM NaCl、 90 ju M呋 ^米和3 ju 1 5N NaOH的處理溶液處理RPECs的效應，(A)Omin， (B) 處理后5min, (C)處理后10min和(D)洗滌后；圖IO.闡明了對LECs、 RPECs和CEDCs應用包^￡ 200 mM NaCl、 90 p M呋噻米和3 p 1 5N NaOH的處理溶液后的生存能力；圖11.闡明了應用包含200 ju M DHCT和^200 mM高滲NaCl的 處理溶液處理LECs-CCCs的效應，(A)Omin， (B)約2min和(C)洗滌后；圖12.闡明了應用含有DHCT和高滲NaCl的處理溶液體內處理 兔眼(C, D, E)后的效應，3周后治療組(C, D, E)和對照組(A， B)的效果 比較；圖13.闡明了應用包含308 nM布美他尼和高滲NaCl的處理溶 液處理LECs-CCCs的效應，(A)Omin， (B)5min和(C)洗滌后；圖14.闡明了應用含有布美他尼和高滲NaCl的處理溶液體內處 理兔眼睛后的效果；圖15.闡明了應用包含NEM的處理溶液處理人LECs的效應， (A)Omin, (B)約3min和(C)洗滌后2min;和(D, E)在體內兔眼上；圖16.闡明了應用包舍短桿菌肽和PBS的處理溶液處理LECs-
CCCs的效應，(A)0min， (B)2min和(C)洗滌后；表l.涉及不同處理溶液在體內兔眼中阻止PCO的效應。盡管將聯(lián)系一種或多種優(yōu)選實施方案來描述本發(fā)明，但并不應 被理解為本發(fā)明僅限于這些實施方案。相反，本發(fā)明包含所有可能 包括在對說明書形成結論的權利要求的精神和范圍內的可選擇的、 々務改的和等效的方案。本發(fā)明通過單獨應用或與其它藥物合用離子轉運機制干擾劑， 快速的、選擇性的誘導晶狀體上皮細胞從晶狀體嚢脫落和/或死亡， 從而阻止PCO,而對其它眼部細胞和組織基本無損害，也無冗長的 外科手術前處理。LECs與其它眼部細胞有區(qū)別，這一特性使選擇性 脫落和/或死亡成為可能。結果是，在選用的藥物劑量和濃度下，LECs 經(jīng)歷了容積變化(如收縮)，脫落，被殺死和/或被從晶狀體清除的過 程，而其它細胞和組織保持不受損害。水份可以有效控制人細胞膜兩側的熱力平衡。因為事實上，所 有人細胞的細胞膜對水而言都是高通透性的，細胞容積取決于滲透 活性溶質(電解質和滲透劑)的細胞內含量和細胞外液的摩爾滲透壓濃 度和/或液體張力。 一般而言，細胞內和細胞液體張力是相同的，在 生理條件下，大多數(shù)哺乳細胞并非暴露于較大跨度的體液張力中。 體液的摩爾滲透壓濃度約為285mOsm/kg H20,受體液穩(wěn)態(tài)的限制 在非常狹窄的界限內(±3%)調節(jié)。但，在病理生理情況下，體液穩(wěn)態(tài) 遭受擾亂，已觀察到血流摩爾滲透壓濃度可以在約220 mOsm/kg H20 到約350 mOsm/kg &0之間變化。在極端的情況下，缺失了容積調 節(jié)機制，體細胞可分別膨脹和收縮20 %到30% 。晶狀體上皮細胞和其它細胞一樣，可利用容積調整的過程抵抗 細胞外摩爾滲透壓濃度的變化，以保持恒定的細胞容積。晶狀體上 皮細胞，纖維和睫狀上皮細胞的容積調節(jié)機制先前已有描述。見例，發(fā)明詳述
CW. McLaughlin et al， Amer.丄Phsiol. Cell Physiol. 2001 Sept; 281(3): C865-75; J丄Zhang et al, Exp. Physiol. 1997 Mar: 82(2): 245-59; JJ. Zhang et al, Exp. Physiol. 1994 Sept: 79(5): 741-53; JJ. Zhang et al, J. Physiol. 1997 Mar: 1; 499(Pt. 2): 379-89。滲透干擾后，繼而進入容積 調整期，細胞趨于恢復到在等張等滲介質中的容積。細胞容積的變 化可激活特異性的代謝和膜轉運通路，結果導致滲透活性溶質的凈 積累或凈損失。調節(jié)性容積減少(調節(jié)性容積回縮)(RVD)是響應細胞 外低滲透壓或張力時，用以減少加或保持細胞容積的方法。調節(jié)性 容積增加(RVI)是響應細胞外高滲透壓或張力時，用以增加或保持細 胞容積的方法。當細胞溶質含量(如細胞內張力)或細胞外張力改變 時，將發(fā)生快速的穿膜水流以恢復平衡。因為質膜具有高度適應性， 可引起細胞膨脹或收縮。細胞改變細胞內離子濃度以建立平衡的一條通路是通過利用位 于細胞膜表面的離子轉運機制。這種機制使離子遷入或移出細胞， 結果改變了細胞內離子強度和滲透壓。如，各種類型細胞RVD過程中，被激活離子轉運機制包括傳導性fc和cr通道(單獨的傳導性K+和Cl一轉運通路)，K' - C廣協(xié)同轉運通路和功能偶聯(lián)的K+ - H+和CI —-HC03—交換。各種類型細胞RVI過程中，被激活離子轉運機制 包括Na+-K+-CI—協(xié)同轉運通道和功能偶聯(lián)的Na+-H+和CI—-HC03—交換。不同類型細胞之間離子轉運機制在本質和反應性上具有驚人的 多樣性。見Hoffmann and Simonsen, Physiol Rev. 1989 Apr; 69(2):315-制，但在晶狀體上皮細胞中卻有高表達。Haas, M. 1994 Am.丄Physiol. 267, C869-C885; Lawrence et al 2001, Exp. Eye Res. 73, 660。不同細 胞間容積的設定點也顯著不同，例如細胞具有某一容積設定點，在 該容積點時候，有能力進行RVD和RVI的細胞既不膨脹也不收縮。 不同的細胞具有不同的容積設定點，在該點時，轉運機制凈皮打開或 者關閉，見Parker, J.C Am J Physiol. 1993, 265:C1191-1200; Parker JC et al. J Gen Physiol. 1995 Jun; 105(6):677-99。晶狀體細胞關閉RVI和 RVD程序的設定點或基線與其它眼部細胞不同。對貼壁細胞而言， 細胞形狀和整合素與細胞外介質的相互作用在決定細胞脫落、生存 或誘導程序性細胞凋亡中起關鍵性作用。容積調節(jié)機制對細胞分裂 也是必需的。另外，在不同眼部細胞的不同部位發(fā)現(xiàn)了協(xié)同轉運機 制，這可能影響前房治療的效果。例如，睫狀上皮細胞的協(xié)同轉運 并非直接暴露于前房中。(Jacob and Civann， Am. J. Physiol. 271(40): C703-720， 1996)。這將LECs與其它眼部細胞和體細胞區(qū)分開來。干擾晶狀體上皮細胞離子轉運機制，阻止細胞對低滲或高滲的 細胞外環(huán)境或其它細胞應激做出充分反應。細胞未對這些應激做出 反應遲早將引發(fā)細胞脫落和/或死亡。晶狀體上皮細胞未能對應激做出響應或使其不能對應激做出響 應，可能有如下幾種反應。 一種反應是細胞死亡，另外一種可能的 反應是從其下面的基底或膜上脫落。例如，細胞可能收縮，以至于 細胞再也不能保持黏附在基底上，這可能與細胞骨架的重排有關。 細胞收縮也可引起貼壁細胞重新排列其焦點黏附接觸或連接這些接 觸的骨架。細胞脫落最終引起細胞死亡和/或使細胞去除變得容易。 細胞死亡導致細胞從周圍細胞和細胞外基質(ECM)脫落。脫落發(fā)生 時，細胞未必立即死亡。例如，已證明破壞細胞外基質(ECM)接觸 可誘導失巢凋亡，失巢凋亡是細力包從其分站(substation)細胞脫落后 誘發(fā)的一種細胞凋亡形式。晶狀體上皮細胞另一個可能的反應是弱 化或敏化了細胞，使得細胞對滲透脅迫或沖擊變得脆弱。例如，一 旦細胞被致敏，便使其不能對滲透沖擊或脅迫做出適當?shù)姆磻?，?至于對敏化細胞引入沖擊或脅迫將引起細胞容積改變、脫落和/或細 月包死亡。如某些實例所示，LECs處理后，在沖洗、洗滌或其它攪動 的方法使脫落和/或壞死細胞清除前后，觀察細胞面積(或通過其它技 術包括光學成像技術、光學和落射熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、電 子顯微鏡、免疫熒光技術、原位雜交技術和蛋白質鑒定和分析技術)， 證明了其容積改變、脫落和/或死亡。本發(fā)明的處理溶液和方法通過 選擇性、快速的引起至少LECS三個中的一個反應，阻止PCO,而 對其它眼部細胞基本無損害。一方面，本發(fā)明的眼部處理溶液和方法利用 一種離子轉運機制干擾劑，通過誘導LECs較其它眼部細胞如角膜內皮細胞(CEDCs)和 視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPECs)相當大比率的從其基底或膜脫落和/或 死亡，阻止PCO。因此，本發(fā)明的一個顯著優(yōu)點是用本發(fā)明藥物處 理，通過清除晶狀體嚢袋中的相當大比率的LECs阻止PCO,而對 其它眼部細胞和組織無顯著性損害。離子轉運機制干擾劑是一種能夠直接或間接在細胞內、細胞外 和/或細胞間干擾調節(jié)離子和水在晶狀體上皮細胞膜內或跨膜流動機 制的藥物。離子轉運機制干擾劑可干擾正常細胞離子分布機制，由 此干擾細胞功能?；騿为殤没蚺c其它藥物合并應用本發(fā)明的離子 轉運機制干擾劑，可擾亂LECs細胞離子正常分布，由此選擇性的、 直接或間接誘導LECs脫落和/或死亡，阻止PCO。選擇藥物的濃度 使得處理溶液能夠干擾LECs的離子轉運機制，引起細胞容積改變、 脫落和/或死亡，但基本上不干擾其它眼部細胞的離子轉運機制。因 LECs脫落和/或死亡，很容易被從晶狀體囊袋中清除，而其它眼部 細胞基本無損傷。離子轉運干擾劑是可以干擾LECs中的一種或多種細胞機制的 藥物(l)協(xié)同轉運機制(例如K+-Cl一協(xié)同轉運，Na+—C1—協(xié)同轉運, Na+—K+—2Cl-協(xié)同轉運和氨基酸轉運)；(2)鈉泵；(3)離子交換(例如， 功能偶聯(lián)的Na+ - IT和Cl — - HC03交換；功能偶聯(lián)的K+ - H+和Cl — -HC03—交換，Cl ——Cl—>交換，Ca2+—Na+交換);和(4)離子通道(例如 鉀通道、氯通道、容量敏感性有機滲透劑和陰離子通道(VSOAC)、 孔道形成蛋白/肽和其它陰離子通道)。離子通道機制干擾劑可以直接 或間4矣激活或抑制這些細月包4幾制。 在低滲介質中，脊推動物細胞開始因滲透水平衡發(fā)生膨脹，但 后來通過KC1的凈損失和隨之發(fā)生的細胞水的損失調整其容積以恢 復正常細胞容積。細胞膨脹激活轉運通道導致鉀、氯和有機滲透劑凈流出。各種細胞RVD過程中，離子轉運機制被激活，包括，傳導 性K+和C1—通道(獨立的傳導性K'和Cl一轉運通路)，K+ - C1—協(xié)同轉 運通路和功能偶聯(lián)的K+-H+和C廠-HCO,交換。例如，鉀和氯主 要通過激活K+和C廣協(xié)同運輸通道或分別激活鉀和陰離子通路而流 出細胞。相反，在高滲介質中，脊推動物細胞開始因滲透水平衡而收縮， 但后來通過KC1凈獲得和隨之發(fā)生的細胞水的攝入而調整其容積以 恢復正常細胞容積。細胞收縮激活了轉運通路，結果導致氯、鈉和 鉀凈內流。各種細胞在RVI過程中，離子轉運機制被激活，包括Na"^ -C1—或Na+ - - 2C1一協(xié)同轉運通路，和功能偶聯(lián)的Na+ - H+和Cl —-HC03—交換。離子轉運機制干擾劑的實例包括但不限于N-乙基順丁烯二酰亞胺纈氨霉素短桿菌肽兒茶酚胺類釣離子載體(Ionophore)A2318 (包括，例如離子載體A23187加鈣)鈣調節(jié)蛋白匹莫齊特髓袢利尿藥(例如，呋噻米、布美他尼、依他尼酸、吡咯他尼、 托拉塞米)噻嗪類利尿劑(例如，雙氫氯p塞嗪、氫氯噻嗪、環(huán)戊噻嗪、苯噻 溱、氯噻嗪、千氟噻嗪、氯噻酮、氫氟噻嗪、甲氯噻嗪、曱苯喹唑 酮、泊利噻嗪、喹乙宗、三氯噻。秦)
氨氯吡咪4,4'-二異硫氰酸二苯乙烯-2,2'-二磺酸(DIDS)十字孢堿(SITS)尼氟滅酸二苯乙烯衍生物(例如4,4'-二硝基二苯乙烯(dinitrostilbene)-2'2-二 磺酸(disulfonic acid) 奎寧細胞松弛素B?？傊?，有四種類型的離子協(xié)同轉運機制干擾劑(l)協(xié)同轉運干擾劑；(2)鈉泵干擾劑；(3)交換千擾劑；和(4)通道干擾劑。正如下面所反映的是， 一種離子轉運干擾劑可以被歸于上述四類中的一類或多類，這是不言而喻的。協(xié)同轉運干擾劑是能夠直接或間接干擾細胞的協(xié)同轉運機制的藥物。特別是，協(xié)同轉運干擾劑能激活或抑制LECs的協(xié)同轉運機 制。選擇協(xié)同轉運干擾劑的濃度，使得處理溶液誘發(fā)LECs較其它 眼部細胞發(fā)生相當大比率的脫落和/或死亡。協(xié)同轉運的實例包括K+ -Cl-或Na+ - K+ - 2Cr協(xié)同轉運。協(xié)同轉運干擾劑的例子包括 利尿劑，例如(i)噻嗪利尿劑，如雙氫氯噻t秦、氫氯噻嗪、氫氯噻嗪、環(huán)戊噻 溱、苯噻溱、氯噻嗪、千氟噻嗪、氯噻酮、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、 甲氯噻嗪、甲苯喹唑酮、泊利噻嗪、喹乙宗、三氯噻嗪。在美國通 常應用的品牌名包括Aquatensen(甲氯噻嗪)、Diucardin(氫氟噻"秦)、 Diulo(甲苯喹唑酮)、Diuril(氯噻嗪)、Enduron(甲氯噻嗪)、Esidrix(氫 氯噻嗪)、Hydro-chlor(氫氯噻嗪)、Hydro-D(氫氯噻嗪)、 HydroDIURIL(氫氯噻。秦)、Hydromox(喹乙宗)、Hygroton(氯噻酮)、 Metahydrin(三氯噻。秦)、Microzide(氫氯噻嗪)、Mykrox(曱苯喹唑酮)、 Naqua(三氯噻漆)、Naturetin(芐氟噻嗪)、Oretic(氬氯噻嗪)、Renese(泊 利噻嗪)、Saluron(氫氟噻嗪)、Thalitone(氯噻酮)、Trichlorex(三氯噻
嗪)、Zaroxolyn(甲苯喹唑酮)、Apo-Chlorthalidone(氯噻酮)、Apo-Hydro(氫氯噻嗪)、Diuchlor H(氫氯噻。秦)、Duretic(甲氯噻溱)、 HydroDIURIL(氫氯噻嗪)、Hygroton(氯噻酮)、Naturetin(芐氟噻嗪)、 Neo-Code脂(氫氯噻嗪)、Novo-Hydrazide(氫氯噻嗪)、Novo-Thalidone(氯噻酮)、Uridon(氯噻酮)、Urozide(氫氯噻嗪)和 Zaroxolyn(甲苯奮喹唑酮)。(ii)長效利尿藥，如benzmetanide、布美他尼、托塞米、依他尼酸、 呋噻米(又稱為呋喃苯胺酸)。通常應用的品牌名包括Bumex(布美 他尼)、Demadex(托塞米)、Edecrin(依他尼酸)、Lasix(呋噻米)、 Myrosemide(吹p塞米)、Apo-Furosemide(吹蓬米)、Edecrin(依他尼酸)、 Furoside( p夫瘞米)、Lasix(呔遂米)、Lasix Special(呔遙米)、 Novosemide(呋噻米)和Uritol(呋噻米)。(iii) 保鉀利尿藥。美國通常應用的品牌名為Aldactone(螺內酯), Dyrenium(氨苯蝶啶)和Midamor(阿米洛利)。加拿大通常應用的品牌 名為Aldactone(螺內酯)、Dyrenium(氨苯蝶啶)、Midamor(阿米洛利) 和Novospiroton(螺內酯)。(iv) 碳'酸酐酶抑制劑，如Acetazolamide(乙酰唑胺)、 Dorzolamide(多佐胺)和Brinzolamide(布林唑胺)。(v) 含鉀利尿劑BurinexK(R)(Leo)(布美他尼)、Centyl K(R)(芐 氟瘞溱)、Lasikal(R)和Neo-NaClex-K(R)。(vi) 合用的利尿藥，如Triam-co[氨苯蝶啶氫氟噻嗪合用50/25]; Amil-co [阿米洛利氫氯噻嗪合用5/50〗、co-amilozide 5/50 [阿米洛利/ 呋塞米合用5/50]、 Moduretic[阿米洛利氫氯噻嗪合用5/50]、 Dyazide [氨苯蝶啶氫氯噻。秦合用50/25]、 Nav邵are [阿米洛利2.5mg + cyclopenthiazide環(huán)戊p塞。秦250mcg]、 co-amilofruse 5/40 [阿米洛利呋 塞米合用5/40Fru-co [阿米洛利/呋塞米合用5/40] Frusene [氨苯蝶啶 50mg +呋塞米40mg]、 Kalspare [氨苯蟲菜啶50mg +氯。塞酮50mg]; Burinex A [阿米洛利5mg +布美他尼lmg] Lasoride [阿米洛利呋塞米
合用5/40]、 Fmmil [阿米洛利/呋塞米合用5mg/40mg] Lasilactone[螺 內酯50mg +呋塞米201^]、 Aldactide 50 [氟噻溱螺內酯合用50/50] 和Dytide [氨苯蝶啶50mg十千氟噻嗪25mg]; Co-flumactone [螺內酯 和氫氟噻嗪合用]。協(xié)同轉運干擾劑的例子還包括通過K-C1協(xié)同轉運促進KC1外流增加，而引起細胞收縮的協(xié)同 轉運干擾劑，包括DDS-NOH、 二氫茚基[氧基]烷酸(DIOA)、岡田酸 (OA)、 A-23187、 l-乙基-2-苯并咪唑啉酮、YM934、克羅嗎寧、偕 二甲基取代物9-(3,4-二氯苯基)-3,4,6,7，9,10-六氫-l,8(2H,5H)-吖啶二 酮(A-184208)、北非蝎毒素(ChTX)、前列腺素E2、十字孢堿、K+離 子載體、凡林霉素、腫瘤壞死因子a力吖戊二酰)亞胺環(huán)己酮、二氮 。秦、吡那地爾和尼可地爾、升高細胞內cAMP或cGMP水平的藥物 (Nelson et al.， 1995)，以及花生四烯酸環(huán)氧化物。通過激活K-C1協(xié)同轉運機制誘導鉀和氯及其它離子和滲透劑損 失(如細胞內釣排空或升高)的刺激物N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)(包括，例如N-乙基順丁烯二酰亞 胺力口4如)碘代乙酰胺和其它任何能夠激活或抑制晶狀體上皮細胞協(xié)同轉運機制的藥物。鈉泵干擾劑為能夠直接或間接干擾細胞內被稱為鈉泵的 Na/K/ATP酶泵機制的藥物。尤其是，鈉泵千擾劑可以激活或抑制 LECs的Na/K/ATP酶泵。例如，LECs含有非永久的陰離子大分子， 陰離子和水擴散入細胞而導致的膠質滲透壓腫脹經(jīng)常被離子外排泵 以等于損耗性泄漏進入(dissipative leak entry)的速率外排離子而抵 消。選擇鈉泵干擾劑的濃度使得處理溶液可誘導LECs較其它眼部 細胞發(fā)生相當大比率的脫落和/或死亡(如通過腫脹)。鈉泵干擾劑的 實例包括毒毛花甙G和其它任何能夠激活或抑制晶狀體上皮細胞鈉 泵的藥物。但，另外 一種類型的離子交換機制干擾劑是一種交換干擾劑。 交換干擾劑是一種能夠直接和間接干擾細胞離子交換的藥物。尤其是，交換干擾劑激活或抑制LECs離子交換機制，這不僅引起細胞 內和細胞間的離子再分布，而且還可以改變細胞內pH。離子交換機 制的實例包括K+ - H+和Cl — - HC03 —交換，和CI — - HC03交換功 能偶聯(lián)的Na+-H+交換。例如，通過激活！C-H+和CI — -HC03 —交 換誘導鉀和氯損失的刺激物都是交換干擾劑。交換干擾劑的實例包 括十字孢堿(SITS) 阿米洛利二 -異石充氰基-二石黃?；?二乙丈希苯(di-isothiocyano-disulfonyl stilbene)(DIDs) 鈞調素(CaM) 銅離子(Cu20 氫離子(H+)和其它任何能夠激活或抑制晶狀體上皮細胞交換的藥物。 通道干擾劑是一種能夠直接或間接干擾細胞離子通道的藥物。 尤其是，通道干擾劑能激活或抑制LECs離子通道。離子通道的實 例包括鉀、氯、鈉和VSOAC和孔形成蛋白/肽通道或轉運通路。例 如，通過激活鉀和氯通道誘導氯化鉀和有機滲透劑損失的任何刺激 物都是通道干擾劑。選擇通道干擾劑的濃度使得處理溶液能誘導 LECs較其它眼部細胞發(fā)生相當大比率的脫落和/或死亡。通道干擾 劑的實例包括酮康唑(KETO)5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸(NPPB) 1,9-二脫氧弗司扣林(DDF)
他莫昔芬 維拉帕米奎寧鋇(Ba")二苯胺-2-羧酸鹽或酯(DPC) 蒽-9-曱酸indocrmone(MK- 196)匹莫齊特CBIQEBIOl-乙基-2-苯并咪唑酮他莫昔芬+ATP巰基氧化劑蛋白磷酸化抑制劑4-氯-苯并[F]異喹啉(3國CCM、 ZK 93426氟馬西腺苷磺酰脲花生四烯酸(AA) 磷脂酶C(PLC) 蛋白激酶C G蛋白能誘導纖維型肌動蛋白結構發(fā)生變化的藥物 和任何能夠激活或抑制晶狀體上皮細胞離子通道的藥物。 孔形成蛋白/肽是能夠在晶狀體上皮細胞中為通常情況下不能穿 越雙層膜的分子制造通路的藥物。尤其是，PPFPs形成一個孔或通 道以促進細胞內K從LECs中泄漏。在過去的半個世紀中，有上百 種肽抗生素被描述，包括短桿菌肽、地衣桿菌素；多粘菌素(B)(Neosporin， Otosporin)、制霉菌素(Nystan, Tri-Adcortyl)、糖肽、a-防御素、(3-防御素1、鱟肽素、細菌乳鏈菌肽、a-紅細胞溶解素、 roimmunolysins、孑L蛋白(OmpA、 PhoE、 NmpC、 OmpF、 Phosphoporin、 LamB porin)、 BcI-XL; a-紅細胞溶解素、氣溶素、大腸桿菌素、丙 甲菌素、抗菌肽蛙皮素、天蠶抗菌肽;兩親性p片狀肽(短桿菌肽、防 御素和細胞溶解素)、a-螺旋肽(丙甲菌素、肺炎[鏈]球菌溶血素、抗 菌肽蛙皮素和天蠶抗菌肽)、ranalexin(—種抗菌肽)、brevinin(—種抗 菌肽)和PR39。利用本發(fā)明的藥物，選擇藥物的濃度使得應用該處理溶液，引 起LECs細胞的生存能力小于約10%,更優(yōu)選小于約5%,更進一步 優(yōu)選接近0。而對其它眼部細胞的理想生存能力，如RPECs和 CEDCs,優(yōu)選大于約70%，進一步優(yōu)選約90%，更進一步優(yōu)選接近 100%。在這種情況下，包含藥物的處理溶液，也可與其它藥物合并應用，可選擇性誘導LECs較其它眼部細胞發(fā)生相當大比率的脫落和/ 或死亡。如實施例中所示，可在沖洗、洗滌或其它攪動的方法使脫 落和/或壞死細胞清除前后，觀察細胞面積，證明其脫落和/或死亡。上述的本發(fā)明藥物(下文稱為主藥(primary agent)單獨應用或與下 述另外的藥物和/或其它藥物或化學品合并應用，可直接或間接選擇 性誘導LECs脫落和/或死亡。例如，本發(fā)明的眼部處理溶液和方法 除主藥外，還包括一種滲透脅迫劑，其中的溶液可誘導晶狀體上皮 細胞較角膜內皮細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞發(fā)生相當大的比率細胞 脫落和/或死亡，以阻止后囊膜渾濁。滲透脅迫劑是能夠誘導LECs中滲透沖擊的藥物。改變細胞內 和細胞外正常離子平衡的細胞條件都可以引起LECs滲透沖擊。例 如，滲透活性溶質細胞外濃度的改變和各種影響涉及細胞容積控制 的特定離子轉運系統(tǒng)活性的各種刺激物質(例如，激素、生長因子和 其它外部刺激物質、細胞膜電位和細胞質第二信使)，都可以誘導滲 透沖擊。大量的跨細胞離子流可以沖擊細胞體積的動態(tài)平衡。將細 胞暴露于低滲溶液或低滲摩爾滲透壓濃度的溶液可以引起低滲脅 迫。相反，細胞暴露于高滲溶液或具有高滲摩爾滲透壓濃度的溶液 可引起高滲脅迫。細胞內滲透活性溶質和有機溶質濃度的升高或降低也可沖擊細胞體積的調節(jié)，激活與RVD或RVI響應有關的的膜轉運過程。當主藥使LECs對滲透沖擊變得敏感(例如通過抑制一種離子轉 運機制)和當滲透脅迫劑本身可誘導細胞脫落和/或死亡時，應用或引 入一種滲透脅迫劑是合適的。例如，如果離子轉運機制干擾劑抑制 一種必需離子轉運機制，如鈉-鉀泵協(xié)同轉運，LECs就不能保護自 己抵抗外部的滲透脅迫或沖擊，因而提高其對其它滲透脅迫劑引起 的細胞外滲透壓的敏感性。LECs未對滲透脅迫或沖擊做出響應，將 會通過激活死亡信號程序，引發(fā)細胞死亡。但是，需理解的是，主藥也可以是滲透脅迫劑，如主藥可以同 時干擾LECs離子轉運機制并誘導滲透沖擊。特別是，滲透脅迫劑具有高滲或低滲摩爾滲透壓濃度。低滲溶 液含有較常見于正常生理條件的較低濃度溶質；高滲溶液含有較常 見于正常生理條件的較高濃度溶質。換句話說，滲透脅迫劑導致了 細胞外高壓或低壓。任何生理可容忍的電解質和滲透劑，任何對滲透張力有貢獻的 溶質，都適合誘導滲透脅迫或沖擊。滲透劑的實例包括鹽(例如NaCl),包括(i)陽離子與相應的陰離子形成的無機鹽，所述陽離子包括鈉、 鉀、鋰、銣、鈹、鎂、《丐、鍶、鋇、鋁、鋅、錫、銀、金、鐵、汞， 相應的陰離子包括氯、溴、碘、氫氧根、硼酸根、偏硼酸根、碳酸 根、碳酸氫根、硝酸根、氟離子、硫酸根、單磷酸根、二磷酸根、 石粦酸根、硫氰酸根和異硫氰酸根。(li)上述同樣陽離子與相應的陰離子形成的有機鹽，相應的陰離 子例如醋酸根、藻酸根、苯甲酸根、丁酸根、辛酸根、己酸根、枸 櫞酸根、癸磺酸根、癸基硫酸根、十二烷基硫酸根、二乙基巴比妥 酸根、二甲二硫氨基甲酸根、連二亞硫酸根、十二烷基磺酸根(dodecansulfonate)、乙基磺酸根、氟乙酸根、氟磷酸根，、富馬酸根、 六氟磷酸根、己磺酸根(hexansulfonate)、碘醋酸根、L-乳酸根、D-乳酸根、D,L-乳酸根、馬來酸根、丙二酸根、mesolaxate、肉豆蔻酸 根、油酸根、草酸根、棕櫚酸根、丙酸根、水楊酸根、酒石酸根和 三氟乙酸根；氨基酸(如?；撬?、甘氨酸和丙氨酸)；糖(如甘露醇、肌醇、甜菜堿、甘油磷酰膽堿、甜菜堿、尿素、 蔗糖和葡萄糖)；及其它任何有機和無機滲透劑。值得注意的是，當滲透劑是氯化鈉時，如上所述，氯可以被碘、 溴、硝酸根、硫氰酸根、氟、硫酸根、羥乙基磺根、葡糖酸根和其 它可接受的基團取代；同樣，鈉也可以被鉀、鍶、銣、鋰、鈁和其 它可以接受的取代物代替。優(yōu)選的滲透劑為氯化鈉、氯化鉀、溴化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、 氫氧化鈉、碘化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硝酸鈉、氟化鈉、硫酸鈉、 碳酸鉀、檸檬酸鉀、乳酸鉀、碳酸氫鉀、溴化鉀、氫氧化鉀、碘化 鉀、硝酸鉀、 -琉酸鉀、氯化鍶、氯化銣和氯化鋰。滲透脅迫劑和主藥在治療PCO時可以單獨應用，同時應用或先 后順序應用。處理溶液pH優(yōu)選5到1，這取決于使用的藥物和藥物濃度。 在一個優(yōu)選的實施方案中，處理〉容液包括約士200mM NaCl，進一步 優(yōu)選^200 mM NaCl， pH優(yōu)選范圍約8-10，進一步優(yōu)選為7.6。處 理;容液的pH可以通過改變主藥或滲透脅迫劑的濃度或引入可以改 變pH的其它化學藥物加以調整?？梢杂萌魏卧黾踊驕p少氫氧根離子濃度的酸和堿調整pH。一定濃度范圍內的主藥、滲透脅迫劑和調整pH的藥物組成的 處理溶液都可發(fā)揮作用。依據(jù)本發(fā)明，選擇合適的藥物濃度，使得干擾廣譜細胞細胞機制的藥物能選擇性干擾LECs離子轉運機制， 引起LECs脫落和/或死亡。處理溶液的應用可引起較大百分數(shù)的 LECs發(fā)生脫落和/或死亡，而其它眼部細胞僅較小百分數(shù)受損。在 藥物濃度范圍的一個端點，處理溶液的效率降低，結果需要更長時 間殺死LECs。在另一個端點，藥物有殺死其它眼部細胞的傾向。應 選擇主藥，滲透脅迫劑和調整pH藥物的合適濃度，使得可以通過 選擇性的誘導LECs脫落和/或死亡阻止PCO，而對其它眼部細胞和 組織無明顯損害。優(yōu)選的是，應選擇藥物濃度，使得一旦應用該處 理溶液，LECs細胞生存能力小于約10%,進一步優(yōu)選少于約5%, 更進一步優(yōu)選接近0,而其它眼部細胞，如RPECs和CEDCs的生 存能力高于約70%，進一步優(yōu)選高于約90%,更進一步優(yōu)選接近IOO %?；钚猿煞值臐舛纫蕾囉谄渌幚砘钚?，但一般優(yōu)選低于1500mM， 進一步優(yōu)選低于1000 m M,更進一步優(yōu)選低于500 y M。上述的藥物和其使用濃度是相關聯(lián)的。例如，高pH處理溶液 在低水平等滲溶摩時就可殺死LECs。某種藥物的合適濃度將在下面 實施例中提供。而且，可以改變濃度以適應主流白內障手術技術的 特定需要和病人需要。本發(fā)明的處理溶液可以在白內障手術前，手術中和手術后應用 以阻止PCO。打開晶狀體前嚢，摘除白內障。將人工晶狀體植入后 嚢。除此之外，晶狀體和晶狀體內容物可以被可注射的人工晶狀體 取代(又稱為晶狀體再填充技術)。在植入晶狀體嚢袋前(例如通過注 射或植入)，可以用本發(fā)明的處理溶液對人工晶狀體和晶狀體材料進 行預處理。采用真空技術或其它手術技術可以去除殘余的LECs,或 也可不去除。晶狀體乳化術、激光或其它技術也可以用來去除晶狀 體內容物。在該過程前、進行中、或進行后任何時間都可以在局部
應用或引入本發(fā)明的處理溶液。然后洗滌眼部區(qū)域以去除殘余的細 胞。如上所述，處理溶液可以包括主藥、滲透脅迫劑和任何調節(jié)溶 液pH的化學物質。除此之外，可以按順序或同時應用或引入單獨包含主藥、滲透脅迫劑和/或調節(jié)pH的化學物質的溶液以阻止PCO。如上述描述，主藥也可以是滲透脅迫劑?？梢酝ㄟ^注射器滴器、超 聲乳化用探針或其它任何適合或方便的使用方法應用處理溶液。本發(fā)明的另外 一 個優(yōu)點是，處理溶液可以誘導細胞相對快速的 體積變化(例如，晶狀體上皮細胞收縮、脫落和/或死亡)以使本發(fā)明 的處理方法可以很容易整合到白內障手術中。晶狀體上皮細胞在應用本發(fā)明的溶液或藥物約30min后發(fā)生脫落，幾小時后細胞死亡。 優(yōu)選的是，應用約15min后細胞體積改變和/或脫落，但這依賴于選 擇的藥物及其濃度。本發(fā)明的處理溶液和方法是否已誘導LECs細胞較其它眼部細 胞發(fā)生相當大比率的脫落和/或死亡，這種處理是否具有選擇性，可 以在處理后通過細胞生存能力的比較評價或其它可接受的測定效率 的方法加以確定。尤其是，該處理溶液和方法應阻止PCO而對已述 的其它眼部細胞僅引起最小限度的生理損害。優(yōu)選的是，應選擇藥 物和藥物濃度，使得一旦應用后，LECs細胞生存能力低于約10%, 而其它眼部細胞如RPECs和CEDCs的生存能力大于約70%。應了 解，處理溶液可以包括其它藥物、化學物質、蛋白質和/或物質，也 可包括多于一種主藥和滲透脅迫劑?？梢约尤肫渌瘜W物質或生理 成分以改善處理溶液的性質，如生理耐受性、粘度和儲存性能。當采用再填充技術時，在白內障手術前，可用該處理溶液涂布 人工晶狀體和/或人工晶狀體材料或與人工晶狀體材料混合。處理溶 液可以包裝在試劑盒中或其它包裝中，或以整體溶液貯存，或如上 所述以單獨的溶液^存以備后用。例如， 一個試劑盒或包裝可以包 括含有離子轉運機制干擾劑的溶液，該溶液與含有滲透脅迫劑的溶 液分開包裝。另外，處理溶液可以包裝在含有可用于超聲乳化液體 的試劑盒或包裝中，或包裝在用于注入可注射人工晶狀體前去除晶 狀體內容物的試劑盒中。實施例 比較實施例1如下所描述，將生長于96孔平底板的LECs、 CEDCs和RPECs 融合單層細胞暴露于不同濃度的NaCl(—種滲透劑)溶液中，在每孔 中分別加入200jnl濃度為137mM、 170 mM 、 340mM、 680mM、 1360mM 和2000 mM NaCl溶液(按如下描述配制)，溶液pH為8.0 ±0.4。各 濃度NaCl溶液對應的最終摩爾滲透壓濃度分別從約285到 4000mOsm/L。在加入高滲NaCl后約5到10分鐘內， 一些LECs開 始收縮，變圓(roundup)，失去與單細胞層的黏附作用，并呈現(xiàn)劑量 依賴性。在CEDCs和RPECs中未見如此明顯效應。隨高滲NaCl的濃度升高，LEC、 CEDC和RPEC的細胞生存能 力見圖l(LECs以淺灰菱形表示，RPECs為暗灰正方形，CEDCs為 黑色菱形)。每點代表2次實驗的均值。在約1380 mM NaCl高滲脅 迫下，約40 %的LECs存活，而多于80 %的CEDCs和RPECs存活， 這證明了細胞間的不同的滲透耐受性。培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞，人角膜內皮細胞和人視網(wǎng)膜色素上皮 細胞的原代細胞和第一傳代細胞，上述細胞(LECs、 CEDCs和RPECs) 是用細胞分離和酶消化標準技術從尸身的眼睛中分離獲得的，方法 見Uebersax ED, Grindstaff RD and Defoe DM Exp Eye Res. 2000 Mar;70(3): 381-90; Wagner LM, Saleh SM, Boyle DJ, and Takemoto DJ. Mol Vis. 2002 Mar 14;8:59-66; Cammarata PR, Schafer G， Chen SW, Guo Z, and Reeves RE. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002 Feb; 43(2):425-33; Rakic JM, Galand A, and Vrensen GF. Exp Eye Res. 2000 Nov; 71(5):489-94。LECs和CEDCs培養(yǎng)在Eagle氏極限必需培養(yǎng)基(MEM) 中,RPECs培養(yǎng)在補充有2 mM谷氨酰胺；25mmol/L Hepes, pH 7.4; lOU/mL青霉素；10pg/mL鏈霉素和15%熱滅活胎牛血清(FCS)的 Ham's F10培養(yǎng)基中。原代培養(yǎng)的LECs、 CEDCs和RPECs在96孔 平底板中按IOV孔進行傳代培養(yǎng)，直到它們達到90-100%融合。細 胞在加濕空氣中含5% 032的培養(yǎng)箱中于37。C生長至融合。細胞在 分析前保持融合狀態(tài)過夜。NaCl高滲溶液制備方法為將58.44克NaCl(NaCl由Sigma Chemical co提供，Dorset,英國)加入到500ml dH20中，得到2M NaCl 貯備液，用蒸餾水(dH20)稀釋2M NaCl貯備液得到目的濃度的NaCl 滲透溶液。例如，要制備170mMNaCl高滲溶液，用(11^20按1: 10.1 稀釋2MNaCl貯備液即可；要制備340mM NaCl高滲溶液，用dH20 按1: 4.56稀釋2M NaCl貯備液即可。利用冰點滲透壓儀通過凝固 點降低法測定溶液的最終(重量)摩爾滲透壓濃度(mOsm/kg/H20)。高滲溶液處理后，處理細胞經(jīng)過充分洗滌，在評價其生存能力 前用新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時。暴露后12-24小時內用MTT法評 價細胞在指定高滲脅迫水平下的生存能力。MTT法是評價線粒體功能的方法，按Mosmann描述操作 [Mosmann,T. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65(1- 2):55-63]。將3國 (4,5-二甲基嗜唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT， Sigma Chemical Co.提供)按5 mg/ml溶于磷酸鹽平衡液(PBS)中，過0.22pm Millipore 濾膜除菌。將MTT貯備液按1:10加入到培養(yǎng)基中，細胞在該培養(yǎng) 基中孵育3至4小時。當加入MTT時，活細胞中線粒體脫氫酶切斷 四氮環(huán)，生成暗藍色的曱階(formazan)反應產(chǎn)物，曱臢在細胞內堆積。 MTT反應的培養(yǎng)物不進行進一步處理在明視野顯微鏡下觀察。如某 孔細胞完全被反應產(chǎn)物填充(在細月包未貼壁的情況下)或含有自多灶發(fā) 散的甲朥晶體(在貼壁或延展細胞的情況下)，則該孔細胞被評分為 MTT-陽性。用DMSO溶解MTT反應的培養(yǎng)物，在自動酶標儀上讀
數(shù)，以測量細胞生存能力。特定濃度下測定每孔活細胞數(shù)目(MTT 陽性)，以總細胞百分數(shù)表示(如圖1所示)。實施例2實驗前，用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌融合的LECs單層細 胞三次，以去除FCS。如實施例1,在96孔培養(yǎng)板中制備LECs。 將LECs暴露于200pl/孔的處理液中約5至10分鐘，所迷處理液包 括濃度遞增( 135mM, 170mM, 340mM, 680mM, 1360mM和 ~2000mM的NaCl)的NaCl(—種滲透劑)，含或不含30pM的呋噻米(一 種協(xié)同轉運干擾劑， 一種離子轉運機制干擾劑)。處理溶液的pH為 8.0 ±0.4。處理后，處理細胞經(jīng)過充分洗滌，培養(yǎng)在新鮮的培養(yǎng)基中。 如實施例1所描述，處理后12-24小時內，用MTT法測定LECs的 生存能力。處理后，如比較實施例1中所觀察到的，細胞收縮和脫落現(xiàn)象 同樣發(fā)生于呋噻米存在的情況下，只是這種變化更加顯著。圖2表 明，在無呋噻米存在的情況下(以菱形表示)，用1380mM NaCl快速 高滲沖擊后，約40%的LECs得以生存。但，用呋噻米抑制協(xié)同轉 運機制后(用圓圏表示)，LECs對滲透壓的耐受性顯著性降低，用340 mM NaCl快速高滲沖擊后，幾乎沒有細胞生存。結果表明，LECs 的生存能力從無呋噻米存在的情況下可以耐受2000mM NaCl滲透沖 擊變?yōu)橛羞秽缑状嬖诘那闆r下僅能耐受170mM NaCl滲透沖擊。每點代表三次實驗的均值士標準偏差(SD)。 30.3mM呋噻米貯備 液的配制方法如下先將20mg呋噻米溶解于100^1 DMSO中，確 認溶解完全后，將其加入到1.9m目的濃度的高滲NaCl中。要得到 30mM的呋，塞米，將5^1呋噻米貯備液加入到5ml目的濃度的NaCl 溶液中(按比較實施例1中描述制備)。比較實施例3 該實施例證明了 pH對LECs :滲透存活的效應。如比較實施例1 中所描述，制備融合的LECs單層細胞。對照組細胞暴露于包含生 理濃度的135 mM NaCl， pH為7.4 ±0.3的溶液中。其它組細胞暴露 于200 y 1/孔的包含濃度遞增( 170 mM和~340 mM)的，不同pH(8.0 ± 0.4, 8.4 ± 0.5， 8.9 ± 0.8和0.6 ± 0.5)的NaCl溶液中10分鐘。通過在選定的Oml高滲NaCl溶液(如實施例1中描述制備)中 直接加入O， 1, 3或5^1 5N NaOH貯備液，調整pH，用專業(yè)的pH計 測定相應的最終pH。不加NaOH的10ml NaCl溶液最終pH讀數(shù)為 約8.0±0.4。加入1^15NNaOH的10ml NaCl溶液最終pH讀數(shù)為約 8.4 ± 0.5。加入3jlU 5N NaOH的10ml NaCl溶液最終pH讀數(shù)為約8. 9 ±0.8。加入5pl 5N NaOH的10ml NaCl溶液最終pH讀數(shù)為約10.6 ±0.5。如實施例1所描述，細胞處理后12-24h,用MTT法測定細胞 生存能力。用溶液處理后，細胞生存能力如圖3所描述。如圖所示， 灰色棒代表暴露于135mM NaCl生理鹽水的LECs對照組；黑棒和 白棒分別代表暴露于pH升高的170 mM NaCl和340 mM NaCl中的 LECs。如圖所示，隨著pH和NaCl濃度升高，LECs對高滲脅迫的 敏感性增加。在pH約10.6±0.5時，超過75%的LECs破裂，并在 5min內死亡。在pH8.9士0.8時，可有效使LECs從其基質脫落，但 破裂并不明顯。比較實施例4該實施例證明了細胞外pH對RPECs滲透生存的影響。如實施 例1中所描述制備融合的單層RPECs。細胞暴露于200^1/孔的溶液 中10min，所述溶液包括濃度遞增的NaCl(137mM, 170 mM, 340mM, 680mM, 1360mM和2000 mM)不同pH值(8.4士0.5和10.6士0.5)的 NaCl溶液。NaCl溶液按實施例1中描述的方法制備。溶液的pH按 實施例3描述的方法加入lpl和5|al 5NNaOH加以調節(jié)。
按實施例1描述的方法，處理后12-24h用MTT法測定細胞的 生存能力。應用溶液處理RPECs后，生存能力如圖4所示(pH 8.4± 0.5以菱形標出；pH 10.6±0.5以圓圈標出)。每點代表三次實驗的均 值士標準偏差。如圖所示，當pH升高時，RPECs暴露于高滲NaCl 時，生存水平急劇降低。實施例5按實施例1描述的方法制備融合的LECs和RPECs。細胞暴露 于200|il /孔的溶液中約10min，所迷溶液包括(i)S 200 mM高滲 NaCl;(ii)濃度遞增的(10pM, 30pM, 60^M, 90pM和120pM)協(xié)同轉運 干擾劑一呋噻米，和(iii)3pl 5N NaOH。按實施例2中所述方法制備含有呋噻米的處理溶液，用S200mM 的高滲NaCl溶液(如實施例1中所述制備)稀釋呋噻米貯備液。例如， 要得到含60pM呋噻米的高滲NaCl溶液，將10^1呋噻米貯備液加 入到5ml高滲NaCl溶液中，用3(il 5N NaOH調節(jié)溶液的pH。按實施例1描述的方法，細胞處理后12-24h用MTT法測定處 理細胞的生存能力。LECs(圓圈)和RPECs(菱形)的生存能力如圖5 所示，每點代表6次HLECs實驗或4次HRPECs實驗的均值±標準 偏差(s.e.m)。如圖所示，10mM的呋噻米時，超過50%的LECs細 胞發(fā)生收縮，脫落或死亡。30hM到120hm的呋噻米時，約90%的 LECs被去除或殺死。另一方面，3(HiM到9(HiM的呋p塞米時，很少 RPECs被去除或殺死。因此，例如，在該pH下，在約200jiM的高 滲NaCl中，約15pM到約00jLiM的呋漆米為有效濃度，該濃度對 RPECs無明顯損傷。實施例6按實施例1所描述，制備LECs、 CEDCs和RPECs融合單層細 胞。將細胞暴露于200 Ml/孔的處理溶液中約10min，所述處理溶液
包括(i)《200 mM的高滲NaCl，(ii)濃度遞增的(14]LiM, 28pM, 56pM, 112^M和224pM)協(xié)同轉運干擾劑一布美他尼。和(iii)3pl 5NNaOH。按如下方法制備含有布美他尼的處理溶液，先制備1.4M的布美 他尼貯備液，用lm]高滲NaCl溶液(按實施例1中描述制備)稀釋1 yl 1.4M的布美他尼溶液，得到14mM的布美他尼第二貯備液。用 NaCl溶液稀釋14mM的布美他尼貯備液得到最終目的濃度的布美他 尼，濃度分別約為O]uM(對照)，14pM, 28pM, 56|nM， 112|liM和224岸， 用3pl 5 N NaOH調節(jié)溶液的pH。按實施例1描述的方法，細月包處理后12-24h用MTT法測定處 理細胞的生存能力。LECs(圓圈)、RPECs(菱形)和CEDCs(正方形)的 生存能力如圖6所示，每點分別代表6次HLECs實驗或3次HRPECs 和CEDCs實驗的均值土標準偏差(s.e.m)。如圖所示，28pM、 112mM 和224pM的布美他尼時，在相差顯微鏡下觀察到幾乎所有的LECs 細胞都發(fā)生收縮，脫落或死亡，洗滌后幾乎無細胞存留，幾乎100 %的細胞顯示MTT陰性響應。另一方面，在同一濃度下，小于約20 %的RPECs和30%的CEDCs被殺死或去除。因此，對這些特定的 處理溶液而言，28nM, 112nM和224|liM是布美他尼合適的治療濃度。實施例7按實施例1描述，制備LECs融合的單層細胞，但培養(yǎng)在玻璃 蓋玻片而不是96孔平底細胞培養(yǎng)+反。充分洗滌LECs以去除血清。在深35mm的培養(yǎng)皿中配制10ml含有《200 mM NaCl、 90pM 呋塞米和3|iil 5N NaOH的處理溶液。將蓋玻片轉移至含有該處理溶液的培養(yǎng)皿中，在處理溶液中保 持5到10min。然后傾倒出處理;容液，用抽出/灌入探針，以新鮮的 HBSS溶液在微壓下充分沖洗蓋玻片和脫落的LECs。立即用倒置相 差顯微鏡檢查和拍照，然后將LECs在新鮮培養(yǎng)基中保持7天，以 檢查是否有殘余細胞生存。 圖7描述了用倒置相差顯微鏡拍攝的LECS照片和在處理過程中的滲透反應。照片7A顯示，在0tmn時，融合的LECs覆蓋了整 個區(qū)域，照片7B顯示，處理后5mm時，LECs變圓，并與其基質 分離。照片7C顯示，處理10mm后和洗滌后，細胞被沖走后基本 是清晰的基質。實施例8為在與體內相近的環(huán)境下評價該治療方法的有效性，采用了一種晶狀體器官培養(yǎng)PCO模型[模型最初由Liu等建立(Liu CS, Wormstone IM, Duncan G, Marcantonio JM, Webb SF, Davies, PD. Invest Ophthalmol Vis Sci.9% Apr; 37(5):906-14)]。從捐獻人(年齡 從19到89歲)的眼睛中分離人晶狀體，然后將其粘附到一個定制的 不銹鋼架上。在手術顯微鏡下，采用連續(xù)環(huán)形撕嚢術將晶狀體的前 嚢100(直徑大約6mm)小心打開，然后用HBSS(hank，s緩沖溶液)液 壓擠出(hydroexpress)晶狀體核，并小心去除剩余的晶狀體纖維。而 后嚢200和赤道嚢300保留，做為包膜(口袋)保存在塑料培養(yǎng)皿中(深 35mm的培養(yǎng)皿)并覆蓋補充有10 %到15%FCS的Engle氏極限必需 培養(yǎng)基(MEM)。器官培養(yǎng)模型中的LECs需要4-5天，以從手術創(chuàng) 傷中恢復。建立了兩組器官培養(yǎng)PCO模型。第一組建立了 10個晶狀體作 為對照，保存在器官培養(yǎng)基中，不作處理。這些晶狀體在約4至7 天后，在前囊100和后嚢200發(fā)展成單層或多層增殖的LECs。第二組12只晶狀體，經(jīng)過4至5天的培養(yǎng)，也具有增殖的LECs 單細胞層，在引入處理溶液前要充分洗滌以去除血清。在35mm的 培養(yǎng)皿中配制0ml舍(i)《200 mM NaCl,(ii)約,M呋塞米，或約 28inM布美他尼，或約U2^VI布美他尼，和(iii)3pl 5N NaOH的處理 溶液。如其它實施例中所描述方法配制溶液。然后將器官培養(yǎng)物轉 移至含有處理溶液的培養(yǎng)皿中，并在該處理溶液中保持5至10min。
用鑷子將器官培養(yǎng)物轉移至另一培養(yǎng)皿中。用抽出/灌入探針，以新 鮮的HBSS溶液在微壓下充分沖洗PCO器官培養(yǎng)物中的囊以及脫落的LEC。立即檢查，然后將器官培養(yǎng)物保存在培養(yǎng)基中，用新鮮培 養(yǎng)基培養(yǎng)7天檢查是否有殘余細胞存活。用倒置相差顯微鏡檢查該處理方法對PCO器官培養(yǎng)物模型中 LECs的效應。在處理后0 、 5 、 10min和12h后用T-Max 400 film(Kodak) 拍照。如圖8所示，處理5至10min內，所有的LECs變圓，并失 去與單細胞層和晶狀體嚢的粘附。相差顯微照片8A描述了在低放 大倍數(shù)(視野為1 mm x 0.75 mm)下，在解剖6至7天后對前嚢100 和后嚢200進行ECCE假手術后，但在溶液處理前LECs的增殖情 況。相差顯微照片8B描述了在高放大倍數(shù)下(視野為3.4 mm x 1.5 mm), LECs被處理5min后，開始變圓，從晶狀體嚢脫落。相差顯 微照片8C描述了在高放大倍數(shù)下，LECs被處理10mm后，絕大多 數(shù)處理細胞從單細胞層上脫落。相差顯微照片8D描述了在低放大 倍數(shù)下，LECs被處理10min后，經(jīng)過洗滌后晶狀體囊無LECs存在。實施例9在本實施例中，評價了該處理方法對原代RPECs的效應。為評 價該處理方法是否對其它眼部細胞有任何副作用，在6孔平底培養(yǎng) 板中，在Ham's F10培養(yǎng)基中(補充以2 mM谷氨酰胺，25mmol/L Hepes， pH 7.4, 10 U/mL青霉素，10 n g/mL鏈霉素和15%熱滅活胎牛血清 (FCS))培養(yǎng)原代RPECs，至它們達到90 %到100%的融合。培養(yǎng)物 保持在培養(yǎng)箱中，箱內通有含5%<:02的潮濕空氣，溫度為37°C， 培養(yǎng)物分析前保持融合狀態(tài)過夜。在引入處理溶液前充分洗滌RPECs培養(yǎng)物。如前面實施例所描 述，在深35 mm培養(yǎng)皿中配制20ml含有(i)S 200 mM NaCl，(ii)約 90)LiM呋噻米，或約28pM布美他尼，或約112pM布美他尼,和(iii)6ita 5N NaOH的處理溶液。在6孔培養(yǎng)板中的3孔中，每孔加入5ml處
理溶液到融合的RPECs中。約10min后，完全去除溶液，用抽出/ 灌入探針，以新鮮的HBSS溶液在微壓下充分沖洗處理的RPECs。 在快速檢查完后，將原代RPECs保存于培養(yǎng)基中，用新鮮的培養(yǎng)基 培養(yǎng)7天檢驗是否有殘存的細胞生存。用倒置相差顯微鏡檢驗該處理溶液對原代RPECs的作用。處理 后0、 5、 10和12h時用T-Max 400 film(Kodak)拍照。RPECs暴露于 該處理溶液10min并未受到顯著影響。圖9描繪了該處理溶液對該 細胞作用的典型實例。圖9A描繪的是Omin的狀況，圖9B描繪的 是處理后5min時的狀況，圖9C描繪的時處理后10min的狀況。圖 8D描繪的時RPECs被處理后經(jīng)過洗滌的情況。實施例10為評價該處理方法是否對其它眼部細胞具有任何副作用，按實 施例1中所描述制備LECs、 CEDCs和RPECs的融合單細胞層。將 這些細胞暴露于200^1 /孔的處理溶液中約10min，所述溶液包括》 200mMNaCl， 90pM呋噻米和3^1 5N NaOH。根據(jù)實施例1描述處理后12-24h用MTT法測定處理細胞的生 存能力。圖10描繪了處理后LECs、 RPECs和CEDCs細胞生存狀 況，每點代表4次實驗的均值土s.e.m.。如圖所示，處理后10min, 通過測定細胞生存能力，處理溶液誘導LECs較CEDCs和RPECs 發(fā)生相當大比率的脫落和/或死亡。特別是，超過70。/。的CEDCs和 80%的RPECs在處理后仍得以存活。這可以與小于10。/。的LECs存 活的情況做出比較。實施例11檢驗該處理方法對器官培養(yǎng)角膜植片(button)的作用以確定該處 理方法是否會對近似體內環(huán)境中的眼部周圍組織造成損害。選擇角 膜是因為其敏感性和直接暴露于該處理的危險性。用HBSS洗滌角膜器官培養(yǎng)物，上皮細胞側向上^:置在定制的不銹鋼架上，然后將其保存在無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中盛有MEM培養(yǎng)基，僅覆蓋底部， 這提供了潮濕的小室，以防止上皮細胞干燥。角膜內皮的凹面充滿補充有10-15%FCS的MEM培養(yǎng)基，在含5%C02, 37。C的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。器官培養(yǎng)物分成對照組和處理組。先用HBSS洗滌培養(yǎng)物3次， 其內皮面或暴露于生理NaCl溶液(137mM, 293土9mOsm/L)中，或暴 露于處理溶液中，持續(xù)10min。對處理組，在深35mm的培養(yǎng)皿中制備包含(i)S 200 mM NaCl,(ii) 約90pM呋塞米或約112pM布美他尼，和(iii)3nl 5N NaOH的處理 溶液。將器官培養(yǎng)物轉移至含有該溶液的培養(yǎng)皿中，并保持10min 以上。然后用鑷子將器官培養(yǎng)物轉移至另外一個含有新鮮HBSS的 培養(yǎng)亞中，用抽出/灌入探針，以新鮮的HBSS溶液在微壓下充分沖 洗培養(yǎng)板角膜器官培養(yǎng)物，處理后保存在新鮮培養(yǎng)基中6小時。就對照組而言，以新鮮的HBSS代替上述的處理溶液，處理角 膜器官培養(yǎng)物10min。為評價該處理方法對角膜內皮細胞的毒性，用倒置相差顯微鏡 和熒光共聚焦顯微鏡檢查角膜器官培養(yǎng)物植片。在共聚焦顯微鏡下， 檢驗角膜內皮細胞的肌動蛋白絲的形態(tài)學，從而為細胞(是否)具有完 整結構提供證據(jù)。處理前和處理后固定角膜器官培養(yǎng)物的內皮，并 用FITC偶聯(lián)的次毒蕈環(huán)肽染色。角膜內皮的共聚焦激光掃描照片證 明未處理組(對照組)和處理組無顯著性區(qū)別。處理組的上皮細胞層與 未處理組保持一致的完整性。對照組和處理組中，角膜內皮細胞均 保持均勻分布的單細胞層，其細月包保持六邊形外觀。處理溶液對角 膜內皮細胞無明顯損害。實施例12檢測了含有雙氫氯噻。秦(DHCT)(—種源自噻嗪類和其相關利尿
劑的協(xié)同轉運千擾劑)和高滲NaCl的處理溶液對人LECs的原位效應。該處理是在附著于剛從人白內障手術中摘除的連續(xù)環(huán)形撕嚢-晶狀體嚢(LECs-CCC)的LEC上進行的。LECs-CCCs來自白內障手術，并立即放入新鮮制備的補充有2 mM谷氨酰胺，25 mmol/L Hepes(pH 7.4),無胎牛血清(FCS)的Engle 氏極限必需培養(yǎng)基(MEM)中，并轉移至實驗室用于評價。用0.2%臺 盼藍染色LECs-CCCs 5mm鑒定存活的LECs，用含有超過70%LECs 存活的細胞片層評價處理的效應。處理溶液包括或170或200mM NaCl的蒸餾水溶液和200或 300, DHCT。第一步，將58.44克NaCl(Sigma Chemical Co., U.S提供)加入到 500ml dH20中，得到2M的高滲NaCl貯備液。通過用水稀釋2M 貯備液得到目的濃度的滲透NaCl溶液，例如，要制備170mM的NaCl 高滲溶液，用水按照l: 10.1稀釋2M NaCl貯備液。要制備200 mM NaCl高滲溶液，用水按照l: 9稀釋2M NaCl貯備液。利用水點滲 透壓儀通過凝固點降低法測定溶液的最終(重量)摩爾滲透壓濃度。第二步，將25mg DHCT加入到1 ml dH20中制備DHCT貯備液。最后一步，用170mM或200mM的高滲NaCl溶液稀釋DHCT 貝i備液制備200或300pM的DHCT處理溶液，并調節(jié)pH至± 7.8。將LECs-CCCs暴露在一盛有處理溶液的小培養(yǎng)皿中5min，暴 露5min后，用注射器吸去處理溶液，然后在培養(yǎng)皿中加入新鮮的PBS 洗去處理溶液。洗滌LECs-CCCs三次。在顯微鏡下觀察LECs的變 化，洗滌后0、 2和5min進行顯微拍照。暴露于處理溶液后，人LECs開始收縮，細胞間逐漸形成大的 間隙。收縮的細胞逐漸變圓并破裂。圖11顯示了包含200pM DHCT和^200 mM NaCl高滲處理溶液 引起的LECs-CCCs的變化，A為處理后Omin, B為2到3min, C
為洗滌后的變化情況。在圖11A中，表明處理前晶狀體細胞堆積緊 密，與相鄰細胞接觸緊湊，類似完整的細胞片層。圖11A中的插圖是較大放大倍數(shù)的圖片。圖1 IB為處理后2到3min拍攝的照片，顯 示收縮的細胞間有較大間隙，圖11B中的的插圖是較大放大倍數(shù)的 圖片。圖11C為沖洗去除處理溶液和脫落細胞后拍攝的照片，除了 一些殘存的細胞碎片，沒有觀察倒存活的細胞。圖11C中的插圖為 高放大倍數(shù)的圖片。實施例13在兩組新西蘭大白兔上進行實驗，檢驗如實施例12所描述的處 理方法阻止PCO的體內效應。實驗組包括16只兔眼，對照組包括 4只兔眼。在對照組中進行白內障假手術。對其它個體進行白內障 治療手術。在1小時內，3次局部應用10%的G去氧腎上腺素(Alcon Labs., Inc., China)和1%的G環(huán)戊通(Bausch & Lomb Pharm., Inc., USA)以對 每只兔眼的瞳孔進行手術前散大。用鹽酸氯胺酮(5 mg kg-l)和鹽酸 賽拉嗪(2 mg kg-l)麻醉兔并放置在手術臺上。每5min用1%的鹽酸 地卡因(Dieaine)進行局部麻醉，進行兩次。使用金屬絲式眼瞼張開 器以保持眼瞼張開。在顳側緣形成一進入眼睛的3.2 mm鞏膜隧道切口 。用黏彈性物 質保持前室，在晶狀體前囊表面制造一直徑4-5 mm連續(xù)環(huán)行撕嚢， 以打開其嚢袋。首先通過水分離術引入處理溶液，這確保處理溶液 立刻到達整個前嚢/LECs。這一過程使得(i)晶狀體皮質與嚢及晶狀 體上皮細胞得以分離，使得在手術后期去除晶狀體皮質變得容易， (ii)LECs有足夠時間暴露于處理溶液中(總共多于5min)。用晶狀體乳化器(Universal II, Alcon Labs., Inc., China)去除晶狀 體，盡可能吸出剩余的皮層以暴露LECs。在晶狀體嚢袋中部分填充 黏彈性材料以保持其形狀，當應用處理溶液時，黏彈性材料不應覆
蓋LECs。使處理溶液散布在前嚢袋的內表面(LECs附著的地方)，用一具 有彎曲的針管的注射器連續(xù)充填前嚢，注意不要溢出嚢袋。當處理 溶液充滿嚢袋后，保持5min即用注射器吸走。在個別情況下，植入了 IOLs。這種情況下，處理溶液布滿嚢袋 整個內表面3到5min后，用注射器小心吸走處理溶液。同時，將切 口擴大到6.0 mm，制備一 6.5 mm光學直徑(optic)的后房型眼晶狀體 (IOLs)(聚曱基丙烯酸曱酯，PMMA)，并放入到嚢袋中。因為這一操 作一般需要外科醫(yī)生約5min完成，LECs應該已經(jīng)暴露在處理溶液 中大約10min。然后在微壓下充分沖洗囊袋，以清除脫落和死亡的LECs，并去 除多余的處理溶液和黏彈性物質。用縫合或非縫合方法使傷口閉合。手術完畢后每只兔眼接受結膜下注射地塞米松(0.25 ml)和慶大 霉素(0.25 ml)。手術后，給兔使用1 %硫酸阿托品眼藥水和硫酸新霉 素-硫酸多粘菌素一地塞米松眼藥膏3個星期，每天2次。動物評價3周和10周，據(jù)文獻報道，在兔中，3周為證明阻止 PCO的效果的最佳時間。在1天、1周、2周和3周時，用裂隙燈 評價所有兔，并對眼部反應進行評分(見表1)。手術后3周和10周， 肌肉注射2ml鹽酸氯胺酮與賽拉口秦(20mg/ml)ll: 1混合物麻醉動物， 然后靜脈注射2ml戊巴比妥鈉殺死動物。摘取眼球(其中部分用福爾馬林0%中性緩沖液固定24h),從前 部到赤道沿冠狀面切成兩半，肉眼觀察評價PCO發(fā)展狀況。用裝備 在手術顯微鏡上(Leica/Wild MZ-8， Vashaw Scientific, Inc.)的數(shù)碼相機 從后部進行拍照。根據(jù)文獻報道的方法對PCO的程度和嚴重性進行評分(見表1)。 將晶狀體嚢固定，在顯微鏡下評分(01umpus, Optical Co. Ltd.)，并用 數(shù)碼相機拍照。確定有無細胞，細胞類型和細胞生長的程度。結果表明，處理溶液的處理組在處理后3周和10周時，炎癥反
應和晶狀體嚢表面沉淀程度都最小，手術后3或10周內無中央PCO(CPCO)(在瞳孔區(qū)域范圍內)和外周PCO(PPCO)(瞳孔外6-6.5 mm 大小)發(fā)生(見圖12C和12D)。多^:眼睛的確發(fā)生了一定程度的與殘 留晶狀體皮質纖維有關的Soemmering環(huán)。圖12C為從眼后角度拍攝的整體照片，顯示了兔小切口白內障 手術(無K)Ls植入)3周后的兔眼，瞳孔區(qū)是清晰的。圖12D為去除 虹膜后的整體照片，在6mm中夬區(qū)外，無PPCO發(fā)生。圖12E為 圖12C中顯示的看似無晶狀體上皮細胞殘留的瞳孔區(qū)的相差顯微照 片。與處理組相對照的是，對照組眼睛發(fā)生顯著的CPCO和PPCO。 圖12A是對照組兔眼晴白內障手術3周后(無IOLs植入)的整體照片 (用Miyake-Apple技術從眼后拍攝)，在瞳孔區(qū)有明顯來自PCO的纖 維。圖12B,表明在顯微鏡下，對照組眼中，色素上皮細胞和晶狀 體上皮細胞的混合細胞明顯增殖，并覆蓋了整個晶狀體嚢(見圖12B)實施例14檢驗了含有308pM布美他尼(一種袢利尿劑類協(xié)同轉運干擾劑) 和170或200 mM NaCl高滲水溶液的處理溶液在原位對LECs-CCCs 的效應。從白內障手術中摘取LECs-CCCs后立即應用，處理方法如 實施例12。暴露于布美他尼-高滲NaCl處理溶液后，LECs發(fā)生收縮，并且 細胞間出現(xiàn)間隙。收縮的細胞并不變圓，而是在晶狀體嚢上以收縮 狀態(tài)被固定或滯留于其上。LECs并不脫落，而是滯留于其上，收縮 并死亡(見圖13)。圖13顯示了 LECs被該處理方法誘導(A)Omin， (B)5min和(C) 沖洗后(15mm)時的細胞變化。圖13A顯示了處理前為完整的晶狀體 上皮細胞片層，有一些因白內障手術導致的脫落LECs、紅細胞和細 胞碎片。插圖為該圖片放大倍數(shù)圖片。圖13B為處理后5min拍攝， 顯示了細胞發(fā)生收縮，細胞間產(chǎn)生大的間隙，插圖為該圖片放大倍數(shù)圖片。圖13C為沖洗去除處理溶液和任何脫落細胞15min后拍攝， 該圖顯示如圖13B所見相同的細胞收縮的外觀，插圖為該圖片放大 倍數(shù)圖片。處理后細胞發(fā)生死亡，這可以通過臺盼藍排斥法評價加 以證實。實施例15在兩組新西蘭大白兔上進行實驗，檢驗如實施例14所描述的處 理溶液(布美他尼和高滲NaCl溶液)體內阻止PCO的效能。處理組 包括5只兔眼，對照組包括2兩只兔眼，兩組平行建立并評價。本 實驗采用和實施例13中相同的手術和評價程序。在接下來的3周內，實驗表明，處理組兔眼無CPCO和PPCO 發(fā)生(用Miyake-Apple技術從眼后肉眼觀察)(見圖14)。與原位實驗 結果(見實施例14)相同，暴露于布美他尼-高滲NaCl溶液后，整個 晶狀體上皮細胞單層出現(xiàn)滯留，并呈現(xiàn)收縮的外觀。這僅見于晶狀 體前嚢(見圖14B)。在后嚢可見細胞不多。同樣，盡管在晶狀體前嚢 有如描述的收縮的LECs單層細胞，但無明顯的細胞增殖。圖14A是利用Miyake-Apple技術從眼后拍攝的圖片，表明白內 障手術(無IOLs插入)3周后，處理組兔眼瞳孔清晰。圖14B為處理 后，晶狀體嚢瞳孔的相差顯微照片，顯示為兩層囊，上層嚢為附有 一層收縮細胞的前嚢，下層為無清晰細胞的后嚢。插圖為高放大倍 數(shù)的圖片，圖14B的插圖顯示具有收縮外觀的單層細胞，細胞無明 顯增殖。實施例16檢測了含有200或300pM N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)(—種 激活或促進協(xié)同KC1外排的轉運干擾劑)的PBS溶液即處理溶液對 LECs-CCCs的原位效應。如實施例12進行處理。 LECs急性暴露于NEM處理溶液5min后，觀察到幾乎無變化， 但一旦將處理的LECs放入PBS洗滌液后，細胞發(fā)生收縮，細胞間 形成大的間隙。如實施例12描述所見，收縮的細胞從LECs嚢脫落。圖15顯示了 NEM誘導LECs-CCCs在(A)0min, (B)2至3min, (C)洗滌后2mm時的細胞變化。圖5A顯示了處理前完整晶狀體上 皮細胞片層，伴有因白內障手術引起的些許損傷，以及脫落LECs 和細胞碎片。圖15B為處理后2至3min拍攝，表明細胞輕度收縮。 一旦細胞被放回新鮮的PBS洗滌液，細胞明顯收縮，細胞間形成明 顯間隙，這些細胞在實驗結束時很容易脫落或被沖洗掉。實施例n在兩組新西蘭大白兔上進行實-驗，檢驗如實施例16所描述的處 理溶液(NEM PBS溶液)阻止PCO的體內效果。處理組包括6只兔眼， 對照組包括2兩只兔眼，兩組平行建立并評價。采用與實施例13中 相同的手術和評價程序。處理組兔眼用含有200或300|liM NEM的PBS或170mM的甘 露醇溶液處理，在接下來的3至]0周內，處理組兔無CPCO或PPCO 發(fā)生(目艮后肉眼檢查)(見表1和圖15D)。處理組眼睛瞳孔區(qū)清晰。用 顯微鏡檢驗，在晶狀體嚢袋無LECs存在(圖15E)。但處理組眼睛發(fā) 生虹膜后粘連并在處理早期出現(xiàn)嚴重的眼部炎癥反應。與處理組眼睛結果形成對照的是，觀察到對照組兩只兔眼睛的 瞳孔區(qū)有明顯的源自PCO的纖維增生(無IOLs植入)。實施例18為防止嚴重前室(AC)反應，對應用于眼內的治療程序進行了改 進。在IOLs上涂布處理溶液，并才直入到去除晶狀體內容物的晶狀體 嚢袋中，而不是將處理溶液直接引入到眼睛中，尤其是在IOLs的后 部和赤道部涂布含有300|liM NEM的PBS溶液即處理溶液。在無菌 層流操作臺干燥過夜，IOLS就可以應用了。這一操作顯著降低了AC 反應。實施例19檢測了含有10或100pM短桿菌肽(一種來自孔形成蛋白和肽 (PFPs)類的物質)和PBS的處理溶液對人LECs的原位效應。按實施 例12中描述應用本處理方法。將UECs-CCCs暴露于短桿菌肽-PBS溶液5min，在顯微鏡下監(jiān) 測LECs的變化。圖16為處理(A)0min,(B)2min和(C)洗滌后拍攝的 顯微照片。暴露于處理溶液后，人LECs收縮，并且細胞間逐漸形成大的 空隙，收縮的細胞慢慢變圓并破裂。圖16A為應用處理溶液前拍攝 的，表明晶狀體細胞相互間連接緊密，并且類似完整的細胞片層。 圖16B表明，暴露于處理溶液后2min,細胞呈現(xiàn)出收縮外觀，細胞 間形成清晰的間隙。圖16C表明，沖洗去除處理溶液和脫落細胞后， 除一些殘存的細胞碎片外，沒有存活的細胞。從上述教導來看，對本發(fā)明的^f艮多改變和變異是可能的。例如， 除上述詳細討論的外，也可采用其它離子轉運機制干擾劑，例如如 下物質可能也是適合的纈氨霉素、溴、茶堿和其它烷基化黃嘌呤、 icosanoids、佛波酯(例如TPA)、保鉀利尿劑(例如氨苯蝶啶、螺內酯 和坎利酸鉀)、花萼海綿誘癌素A、岡田軟海綿酸(OA)、普萘洛爾和 其類似物、血管緊張素II、酮康唑(CDC)、花生四烯酸、鑭、三氟 拉嗪、碘昔芬、2-aminisobutyric acid、 17-|3雌二醇、緩激肽、4,5-二 磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、 1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)、前列腺素(PGE》、 環(huán)磷酸腺普(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸 酯酶(S/T-Ppases)、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、絲裂素活 化蛋白激酶(MAPK)、 SRC家族酪氨酸激酶(SFKs)、多不飽和脂肪酸、 磷脂酶C(PLC)、磷酸酶(PP)、 G-蛋白、銣、酮(012+)、硝酸根(NCV)、 鋇(Ba/)、氯(Cl-)、鉀(K"、改變細胞內鎂和氫(離子)濃度的物質，降低細胞內鈉、氯和鉀(離子)濃度的物質。值得重視的是，還有其它離 子轉運干擾劑。所以，需要理解是，在我們所附的權利要求范圍內，除了這里以上描述的以外，本發(fā)明仍是可以實踐的。我們要求的和希望通過專利證書所保護的內容見權利要求書。
權利要求
1. 一種眼部處理溶液，pH為約7到10,包含氬氯p塞。秦，其中 所述溶液可誘導晶狀體上皮細胞較角膜內皮細胞和視網(wǎng)膜色素上皮 細胞發(fā)生相當大比率的脫落，以阻止后嚢膜混濁，并且其中所述晶 狀體上皮細胞脫落前發(fā)生收縮。
2. 權利要求1中所述的眼部處理溶液，進一步包含滲透劑。
3. 權利要求2中所述的眼部處理溶液，其中的滲透劑包含無機jhl 。
4. 權利要求2中所述的眼部處理溶液，其中的處理溶液具有高 滲摩爾滲透壓濃度，并且其中溶液中存在的氫氯噻。秦的濃度范圍為 約60pM到約500pM。
5. —種阻止后囊膜混濁的方法，所述方法包括 將包含氫氯噻溱和滲透脅迫劑的處理溶液應用于人工晶狀體；并將所述的人工晶狀體放入眼中，其中晶狀體上皮細胞較角膜內皮細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞發(fā) 生相當大比率的脫落以阻止后嚢膜混濁。
6. 權利要求5中所述的處理;容液，其中溶液中存在的氬氯瘙"秦 的濃度小于約150(HiM。
7. 權利要求5中所述的處理溶液，其中溶液中存在的氫氯謹:溱的濃度小于約1000pM。
8. 權利要求5中所述的處理溶液，其中溶液中存在的氫氯瘞。秦 的濃度小于約500pM。
全文摘要
一種用來阻止后囊膜渾濁的處理溶液，在白內障術前、術中或術后應用于或引入晶狀體囊袋中。該處理溶液也可在術前應用于人工晶狀體。該處理溶液包含離子轉運機制干擾劑，該干擾劑可單獨使用或與滲透脅迫劑等其它處理劑聯(lián)用來建立合適的pH，選擇性誘導晶狀體上皮細胞脫落和/或死亡，從而阻止后囊膜渾濁。雖然離子轉運機制干擾劑能夠干擾許多種細胞的細胞機制和細胞離子分布，但是其藥物濃度還要進行選擇，從而使處理溶液選擇性干擾晶狀體上皮細胞的細胞機制，而基本不損害其它眼部細胞。該處理溶液選擇性誘導晶狀體上皮細胞脫落和/或細胞死亡，而對其它眼部細胞和組織無損害，且無需冗長的術前處理。
文檔編號A61K31/198GK101146516SQ200580048451
公開日2008年3月19日 申請日期2005年12月19日 優(yōu)先權日2004年12月17日
發(fā)明者張進軍 申請人:張進軍