專利名稱：Survivin抗體的應用及以其制備的食管癌免疫層析檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物檢測領域，涉及Survivin (存活素)抗體的應用，具體地 說，是關于Survivin抗體在制備食管癌免疫層析檢測試紙條中的應用以及所 制備的食管癌免疫層析檢測試紙條。
背景技術：
食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，食管癌的發(fā)生與亞硝胺類化 合物慢性刺激，炎癥與創(chuàng)傷，遺傳因素以及飲水、糧食和蔬菜中的微量元素 含量有關。我國食管癌發(fā)病率很高，僅次于胃癌。在我國農(nóng)村，食管癌是發(fā) 病率最高的腫瘤?，F(xiàn)己證實食管癌早期發(fā)現(xiàn)手術治療切除率可達100%， 5年 生存率可達90%以上，但是目前就診患者多數(shù)已達中晚期，遠期療效尚欠滿 意。因此，治療食管癌的關鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。早期發(fā) 現(xiàn)、早期診斷食管癌主要依靠定期健康普査。
現(xiàn)有的對食管癌的檢測、診斷方法主要包括食管拉網(wǎng)細胞學檢查、內(nèi)鏡 檢查(例如消化內(nèi)鏡檢查、食管腔內(nèi)鏡超聲、色素內(nèi)鏡檢查、熒光內(nèi)鏡檢査)、 影像學檢查(例如計算機體層攝影術(CT)、磁共振成像(MRI))以及基于分子 生物學標志物進行檢測等。
目前在食管癌標志物的研究中，應用較多的方法為免疫組化和放射免疫 測定。雖然食管癌腫瘤標志物的研究和報道較多，但是目前真正具有臨床應 用價值的標志物甚少。其中，腫瘤標志物CEA、 CA199和CYFRA21-1等在 食管癌的診斷、治療效果預測和追蹤復查具有一定的臨床應用價值，但這些 腫瘤標志物的敏感性不是很高(參見"食管癌腫瘤標志物檢測的臨床應用"，王 永興，蘇偉，許建林，劉錦程，施常備，《現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學》2006年5月第14巻第5期；"五項腫瘤標志物聯(lián)合檢測對食管癌診治的臨床評價"，張愛敏，焦
曉青，張鵬，《標記免疫分析與臨床》2008年4月第15巻第2期)；近年來， 一些文獻研究報道了凋亡抑制基因Survivin (存活素)(Survivin最早是 Ambrosini等(Nature Med., 1997， 3(8): 917-921)在人類基因組庫的雜交篩選中 分離出來的，由約1.5><103個堿基對組成，有4個外顯子和3個內(nèi)含子，定 位于人染色體17q25。 Survivin基因表達的蛋白是由142個氨基酸組成的胞質 蛋白，分子質量16.5kD)的表達與食管癌之間的關聯(lián)性(參見"食管癌組織 中Survivin、P53、Ki-67和PCNA的表達及臨床病理學意義"，戴天陽等，《中 華現(xiàn)代外科學雜志》2008-6-13)，但目前并未見將Survivin基因作為食管癌 腫瘤標志物臨床應用于食管癌的檢測技術；關于其他食管癌腫瘤標志物尚需 更多的病例研究來證實和進一步尋找。另外，蛋白質組學實驗技術結合計算 機生物信息學分析及處理技術應用于食管癌特異相關蛋白的研究近期已初見 報道，預計不久的將來可能會尋找到與食管癌相關的特異血清蛋白標志物， 為食管癌的診斷、治療和追蹤復查提供簡便快速和有價值的檢查方法。
然而，以上對食管癌的檢測中，各方法的檢測操作均需要專業(yè)技術人員 在專業(yè)的實驗室進行，技術要求高，且設備比較昂貴，單個樣品處理所需要 的時間長，無法達到快速篩査的目的；另外，上述常用的食管癌檢測方法包 括基于分子生物學標志物的免疫組化和放射免疫等在取樣時，病人或高發(fā)人 群需要忍受一定的痛苦，不易順從。上述關于食管癌的檢測方法均不適合在 普通人群中推廣，更不利于在我國發(fā)病率高、患者人數(shù)多的廣大的農(nóng)村及偏 遠地區(qū)推廣應用。
因此，目前迫切需要有新的低成本檢測技術和設備來滿足在全國尤其是 食管癌高發(fā)區(qū)的普查。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供Survivin抗體在制備食管癌免疫層析檢測試紙條中的應用。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種食管癌免疫層析檢測試紙條。 本發(fā)明的另一 目的在于提供一種利用所述食管癌免疫層析檢測試紙條 進行食管癌免疫層析檢測的方法。
一方面，本發(fā)明提供了Survivin抗體的新應用，具體是其在制備食管癌 免疫層析檢測試紙條中的應用。
膠體金技術在免疫層析快速診斷技術中己應用成熟，然而，目前并未見 膠體金技術在食管癌的檢測和診斷中的相關應用。本發(fā)明首次提出了 Survivin 抗體可用于制備一種食管癌免疫層析檢測試紙條，并用于食管癌的早期篩查 和療效監(jiān)測。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述Survivin抗體為抗人Survivin單克隆 抗體和/或抗人Survivin多克隆抗體。本發(fā)明中，所述抗體可以商購獲得， 也可以按照現(xiàn)有技術中的記載方法(包括所屬領域的常規(guī)操作，例如參見 Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Lab(CSHL) Press, 2001)中所述的方法)自行制備。例如，制備本發(fā)明的單克隆抗體的方 法可以是以蛋白或其片段作為抗原免疫動物(例如小鼠、豚鼠、雞、兔、山 羊、綿羊等動物)，取免疫動物的脾細胞作為能夠產(chǎn)生抗體的漿細胞(免疫細 胞)，與同系動物的骨髓瘤細胞進行融合。篩選能夠產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細 胞，并進行單克隆化。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案，所述Survivin單克 隆抗體為按照王友等人在"人Survivin基因克隆和單克隆抗體的研制及在 肝癌中的表達"(中華檢驗醫(yī)學雜志2006年3月第29巻第3期)中記載的方 法制備得到。制備本發(fā)明的多克隆抗體的方法可以是純化Survivin蛋白或 具有抗原性的片段，可被施用于動物(例如小鼠、豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊 等動物)以誘導含有多克隆抗體的抗血清的產(chǎn)生，必要時在免疫時可加入佐劑， 以增強免疫效果。為了使實驗結果真實可靠，需要對抗血清進行純化?？寡?清純化可使用常用的蛋白A/G結合法和抗原親和純化法。本發(fā)明在一具體實施例中制備和純化了抗Survivin多克隆抗體，經(jīng)證明純化后的抗體具有很好 的活性以及特異性。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述食管癌免疫層析檢測試紙條是用于 對待測樣品中的Survivin進行檢測。優(yōu)選地，所述待測樣品為血清或血漿。
另一方面，本發(fā)明提供了一種食管癌免疫層析檢測試紙條，該試紙條
包含硝酸纖維素膜層以及玻璃纖維膜層，其中，所述硝酸纖維素膜層上設 置T測試區(qū)和C質控區(qū)，測試區(qū)包被Survivin單克隆抗體或多克隆抗體， 質控區(qū)包被二抗IgG;所述玻璃纖維膜層固定有膠體金標記的Survivin多克 隆抗體或單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述試紙條還包括一些常規(guī)的設置部件， 例如在試紙條兩端分別設有作為加樣區(qū)的玻璃纖維膜層、以及吸水濾紙，并 可設置底板以支撐其上所設置的硝酸纖維素膜層、玻璃纖維膜層及吸水濾 紙，所述底板例如可為硬紙底板。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明的食管癌免疫層析檢測試紙條 中，所述膠體金顆粒直徑范圍優(yōu)選為10 35nm，更優(yōu)選為15 35nm;所 述Survivin多克隆抗體的標記濃度優(yōu)選為10 35ng/ml，更優(yōu)選為15 35(ig/ml。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明的食管癌免疫層析檢測試紙條 中，所述硝酸纖維素膜上抗人Survivin單克隆抗體或多克隆抗體的濃度優(yōu) 選為0.4 1.5mg/ml，所述二抗IgG濃度優(yōu)選為l 3mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明的食管癌免疫層析檢測試紙條 中，所述二抗IgG優(yōu)選為羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在標記后膠體金應用時應調(diào)OD280值到 0.40 1.00， 30 70pl/cm。
另一方面，本發(fā)明還提供了應用所述食管癌免疫層析檢測試紙條進行
食管癌免疫層析檢測的方法，該方法包括步驟1) 取20 150pl、最優(yōu)選10(^il待檢樣品，將試紙條的底端(加樣區(qū)) 插入該管中；
2) 在30分鐘以內(nèi)觀察并記錄實驗結果，優(yōu)選的觀察時間為5 15min 以內(nèi)。
本發(fā)明是采用膠體金免疫層析技術雙抗體夾心法原理檢測樣品中的 Survivin，從待測樣品中檢測出是否存在Survivin，以便作為篩查和診斷食管 癌的輔助參考參數(shù)。應用本發(fā)明的方法，在將試紙條插入待測樣品如血槳或 血清中，液體流向吸水濾紙的方向，當流到金標記物處時，金標抗體溶解， 并與血漿或血清中的Survivin結合形成復合物。當金標抗Survivin抗體-抗原 復合物繼續(xù)前移時，在檢測線與包被抗體結合，形成金標抗Survivin多克隆 抗體-抗原-包被Survivin單克隆抗體復合物而凝聚顯色，在質控線處形成金標 抗Survivin多克隆抗體-包被二抗復合物而顯色，如質控線未顯色則表明該試 劑無效。
應用本發(fā)明的食管癌免疫層析檢測試紙條進行檢測時，檢測結果的判 定如下
陽性結果在試紙條的測試區(qū)和質控區(qū)位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。 陰性結果僅試紙條的質控區(qū)位置上出現(xiàn)一條紫紅色條帶。 無效結果在試紙條的檢測線和質控線位置上均未出現(xiàn)紫紅色條帶。 應用本發(fā)明的食管癌免疫層析檢測試紙條進行食管癌免疫層析檢測， 操作簡單，診斷速度快，取樣容易，可快速、直接、定性地檢測待測樣品中 Survivin,本發(fā)明的技術作為一種無創(chuàng)簡易檢測手段，適合于地方特別是高發(fā) 區(qū)人群的篩查。本發(fā)明具有如下突出優(yōu)點
(1)敏感性好，特異性高而又無創(chuàng)傷性，可檢測待測樣品如血清或血
漿中的Survivin,標本用量只需10(^1，可以檢測到納克級Survivin,適用 于多種場合檢測，發(fā)明人通過利用本發(fā)明的試紙條對大量食管癌患者及健 康人群的血清樣品進行實際應用檢測，在具有統(tǒng)計學意義的條件下，食管 癌患者的檢出率可達到51%以上，尤其在對69歲以上老年人進行檢測時，陽性率可達到63.9%以上。
(2)檢測速度快，成本低，可在5分鐘內(nèi)出結果，操作簡便快捷，適
用于食管癌腫瘤的流行病學調(diào)査輔助檢測、篩選食管癌檢査適合人群(即 用該試紙條找出高度可疑的食管癌患者)和療效監(jiān)測。
本發(fā)明的食管癌免疫層析檢測試紙條對于在全國特別是廣大農(nóng)村基層 或食管癌高發(fā)區(qū)推廣健康普查具有重大意義。
圖1為本發(fā)明一具體實施例的食管癌膠體金免疫層析檢測試紙條的結構 示意圖。
圖2為本發(fā)明一具體實施例中應用本發(fā)明的食管癌膠體金免疫層析檢測 試紙條對血清的測試結果。圖中，從左至右分別顯示對食管癌病人l、食管癌 病人2、健康人3、健康人4的血清的檢測結果。
圖3為本發(fā)明另一具體實施例中應用本發(fā)明的另一食管癌膠體金免疫層 析檢測試紙條對血清的測試結果。圖中，從左至右分別顯示對食管癌病人5、 食管癌病人6、健康人7、健康人8的血清的檢測結果。
具體實施例方式
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例及附圖進一步描述本發(fā) 明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中未注明具體條 件的實驗方法為所屬領域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議 的條件。
實施例l
本實施例中提供了一種Survivin膠體金免疫層析檢測試紙條，請參見圖 1所示，本實施例的試紙條設有硬紙底板5，在底板5上從左到右依次設有 吸血清玻璃纖維膜層4 (作為加樣區(qū))、固定有抗人Survivin多克隆抗體的 玻璃纖維膜層3、硝酸纖維素膜2和吸水濾紙1。各層被依次交錯粘貼在硬紙底板5上組裝而成本實施例的Survivin膠體金免疫層析檢測試紙條。
其中，硝酸纖維素膜2的尺寸為長10cm，寬2.5cm。在硝酸纖維素膜 2上設有T測試區(qū)和C質控區(qū)，所述測試區(qū)T是標有抗人Survivin單克隆抗 體的區(qū)帶，Survivin單克隆抗體濃度約l.Omg/ml;所述質控區(qū)C是標有羊抗 兔二抗IgG的區(qū)帶，二抗?jié)舛?mg/ml。
玻璃纖維膜層3上固定有膠體金標記的抗人Survivin多克隆抗體，所述 膠體金顆粒直徑20nm，所述抗體的標記濃度15(ig/ml。膠體金標記抗人 Survivin多克隆抗體的操作參照所屬領域的常規(guī)技術進行，其中，在標記后 膠體金應用到玻璃纖維磨層上時應調(diào)OD280值到0.625，其在玻璃纖維磨 層上的應用量為50nl/cm。
該Survivin膠體金免疫層析檢測試紙條在制備過程中所用的抗Survivin 單克隆抗體為發(fā)明人按照王友等人在"人Survivin基因克隆和單克隆抗體 的研制及在肝癌中的表達"(中華檢驗醫(yī)學雜志2006年3月第29巻第3期) 中記載的方法制備得到，其中所用各實驗材料均可商購獲得，在此通過引證 的方式將該文獻的全部內(nèi)容合并于此，而不再對具體的制備方法進行贅述； 該單克隆抗體效價l: 12800;
抗Survivin多克隆抗體按照以下方法制備由北京大學醫(yī)學部第一 附屬醫(yī)院實驗動物室購得1只新西蘭雌兔，2.5KG，第一次用弗氏完全佐劑 等體積混合約lmgPMS-Survivin融合蛋白，選取背部五點注射，第一次免 疫前耳緣靜脈取血作為陰性對照。兩周后第二次免疫，lmgPMS-Survivin融 合蛋白等體積弗氏不完全佐劑混合，背部五點注射。四周后進行第三次免
疫，第三次免疫時0.5mg PMS-Survivin融合蛋白等體積弗氏不完全佐劑混 勻，背部五點注射。 一周后靜脈插管取血并分離血清，分裝后-8(TC保存。 使用前用ProteinA-Sepharose-4B純化柱(購自GE公司)純化。該多克隆抗 體效價l: 6400;
二抗羊抗兔千粉，購自鼎國生物技術有限公司，按2mg/ml稀釋使用，
效價約1: 2000;
其他材料和試劑如所用的底板、硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維和金子稀釋液干粉、氯金酸等均商購獲得。
應用本實施例的試紙條進行食管癌免疫層析檢測時，可按照以下操作 進行
先取10(^1待檢樣品于EP管中，將試紙條的底端(吸血清玻璃纖維膜
層4)插入EP管中，在30分鐘內(nèi)通常在15分鐘內(nèi)甚至更短時間即可觀察 并記錄實驗結果。
檢測結果的判定如下
陽性結果在試紙條的測試區(qū)和質控區(qū)位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。 陰性結果僅試紙條的質控區(qū)位置上出現(xiàn)一條紫紅色條帶。 無效結果在試紙條的檢測線和質控線位置上均未出現(xiàn)紫紅色條帶。 在檢測時應注意以下事項
O被檢樣品在室溫(20'C左右)平衡并在該條件下檢測。要求被檢樣 品為新鮮樣品。樣品收集后應1小時測定保證結果的可靠性。
2) 本試紙條僅供體外檢測粗篩，不能作為確認試劑，陽性結果必須進 行確證實驗。
3) 30分鐘后觀察結果無效。
4) 試紙條應避光保存。
實施例2
從北京腫瘤醫(yī)院檢驗科取2例經(jīng)病理確診的食管癌患者血清各100pl， 另取2例體檢健康血清各100pl作為對照，取血后馬上應用實施例1的 Survivin膠體金免疫層析檢測試紙條進行檢測。其中，2例食管癌患者血清 的檢測中，在將試紙條的底端(吸血清玻璃纖維膜層4)插入EP管中的待 測血清中后，約1.5分鐘在質控線和檢測線處都各出現(xiàn)了紫紅色條帶；而2 例健康人血清的檢測中，在將試紙條的底端(吸血清玻璃纖維膜層4)插入 EP管中的待測血清中后，約1.5分鐘在質控線出現(xiàn)了紫紅色條帶，而在檢測 線處30分鐘內(nèi)仍無反應(結果請參見圖2所示)。說明本發(fā)明的試紙條具 有敏感性好、檢測速度快的特點。實施例3
本實施例的Survivin膠體金免疫層析檢測試紙條中，所述測試區(qū)T是標 有抗人Survivin單克隆抗體的區(qū)帶，Survivin單克隆抗體的濃度0.6mg/ml; 所述質控區(qū)C是標有羊抗兔二抗IgG的區(qū)帶，二抗?jié)舛?mg/ml;玻璃纖維 膜層3上固定的膠體金標記的抗人Survivin多克隆抗體中，抗體的標記濃度 為15Mg/ml，所述膠體金顆粒直徑20nm，在標記后膠體金應用時調(diào)OD280 值到O.S，應用濃度50 pl/cm。該試紙條的其他參數(shù)和結構以及制備方法同 實施例1。
應用本實施例的Survivin膠體金免疫層析檢測試紙條，從北京腫瘤醫(yī)院 檢驗科取2例經(jīng)病理確診的食管癌患者血清各lOOpl，另取2例體檢健康血 清各IOOjlU作為對照，取血后馬上應用本實施例的Survivin膠體金免疫層析 檢測試紙條進行檢測。其中，2例食管癌患者血清的檢測中，在將試紙條的 底端(吸血清玻璃纖維膜層4)插入EP管中的待測血清中后，約1.5分鐘在 質控線和檢測線處都各出現(xiàn)了紫紅色條帶(結果請參見圖3所示，其中檢測 線處的紫紅色條帶雖不如圖2中清晰，但仍能辨識)；而2例健康人血清的 檢測中，在將試紙條的底端(吸血清玻璃纖維膜層4)插入EP管中的待測 血清中后，約1.5分鐘在質控線出現(xiàn)了紫紅色條帶，而在檢測線處30分鐘內(nèi) 仍無任何反應。說明本發(fā)明的試紙條具有敏感性好、檢測速度快的特點。
權利要求
1.Survivin抗體在制備食管癌免疫層析檢測試紙條中的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，所述Survivin抗體為抗人Survivin 單克隆抗體和/或抗人Survivin多克隆抗體。
3. 根據(jù)權利要求l所述的應用，其中，所述食管癌免疫層析檢測試紙 條是用于對待測樣品中的Survivin進行檢測。
4. 一種食管癌免疫層析檢測試紙條，該試紙條包含硝酸纖維素膜層以 及玻璃纖維膜層，其中，所述硝酸纖維素膜層上設置T測試區(qū)和C質控區(qū)， 測試區(qū)包被Survivin單克隆抗體或多克隆抗體，質控區(qū)包被二抗IgG;所述 玻璃纖維膜層固定有膠體金標記的Survivin多克隆抗體或單克隆抗體。
5. 根據(jù)權利要求4所述的食管癌免疫層析檢測試紙條，其中，所述玻 璃纖維膜層中，膠體金顆粒直徑范圍10 35nm，所述Survivin多克隆抗體 或單克隆抗體的標記濃度為10 35pg/ml。
6. 根據(jù)權利要求4或5所述的食管癌免疫層析檢測試紙條，其中，玻 璃纖維膜層上的標記Survivin多克隆抗體或單克隆抗體的膠體金OD280值 為0.40 1.00，用量為30 70jil/cm。
7. 根據(jù)權利要求4所述的食管癌免疫層析檢測試紙條，其中，所述硝 酸纖維素膜上Survivin單克隆抗體或多克隆抗體的濃度為0.4 1.5mg/ml， 所述二抗IgG濃度為l 3mg/ml。
8. 根據(jù)權利要求4所述的食管癌免疫層析檢測試紙條，其中，所述二 抗IgG為羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG。
9. 應用權利要求4 8任一項所述食管癌免疫層析檢測試紙條進行食 管癌免疫層析檢測的方法，該方法包括步驟1) 取20 150^待檢樣品，將試紙條的底端插入待檢樣品中；2) 在30分鐘以內(nèi)觀察記錄實驗結果。
10. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其中，所述待測樣品為血清或血漿。
全文摘要
本發(fā)明提供了Survivin抗體的應用，具體是其在制備食管癌免疫層析檢測試紙條中的應用。本發(fā)明還提供了一種食管癌免疫層析檢測試紙條，該試紙條包含硝酸纖維素膜層以及玻璃纖維膜層，所述硝酸纖維素膜層上設置T測試區(qū)和C質控區(qū)，測試區(qū)包被Survivin單克隆抗體或多克隆抗體，質控區(qū)包被二抗IgG；所述玻璃纖維膜層固定有膠體金標記的Survivin多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明同時提供應用所述試紙條進行食管癌免疫層析檢測的方法。應用本單克隆抗體多克隆抗體發(fā)明的試紙條進行食管癌免疫層析檢測具有無創(chuàng)性、操作簡單、靈敏和取樣容易等優(yōu)點，可快速、直接、定性地檢測樣品中Survivin，可用于高發(fā)區(qū)人群食管癌的篩查。
文檔編號G01N33/577GK101539574SQ20091008278
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月29日 優(yōu)先權日2009年4月29日
發(fā)明者張青云 申請人:北京市腫瘤防治研究所