專利名稱：：茶樹兒茶素組織細胞化學定位方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及茶樹兒茶素組織細胞化學定位方法。
背景技術：
：植物中的類黃酮包括有查爾酮、黃酮、黃酮醇、黃垸醇、花青素、原花青素等，茶樹中的兒茶素類屬于類黃酮中的黃垸醇類物質。目前國內外用于類黃酮類組織化學定位的染色劑主要有Fe3+或Fe"鐵鹽、Cr2072—、中性紅、亞甲基藍、甲苯胺、鉬酸鹽、香草醛酸性溶液、丁醇硫酸二甲氨基肉桂醛等，大多數(shù)染色劑都是廣譜性染色劑，缺乏特異性。雖然香草醛酸性溶液可以與二氫查爾酮、黃烷醇、二氫黃酮醇、原花青素或縮合單寧反應而顯色，但香草醛濃鹽酸試劑仍然被廣泛用于進行茶樹黃烷醇(兒茶素類)含量的定量檢測[1]，其原因是茶樹中的酚類物質含量相當高，其含量可以達到鮮葉和嫩莖干重的18-36%，其中兒茶素約占茶多酚的70-80%。有國外研究者將香草醛濃鹽酸試劑用于其他植物的酚類物質的組織化學定位的報道，但由于染色技術的缺陷，如在染色前進行材料的固定，導致酚類物質滲出，造成染色效果較差，色澤彌散的現(xiàn)象(圖1)[2]，因此只能進行植物的器官和組織的初步定位。尚未發(fā)現(xiàn)此方法用于酚類物質的細胞學定位。尚未發(fā)現(xiàn)茶樹兒茶素組織化學定位的實驗技術的報道。
發(fā)明內容為了解決現(xiàn)有酚類物質組織化學定位技術中存在染色劑缺乏特異性、染色劑靈敏度不高、染色前進行材料的固定等缺陷，本發(fā)明提供一種針對茶樹兒茶素組織細胞化學定位的方法，該方法具有顯色特異性強、操作方便、顯色速度快、靈敏度高的特點。實現(xiàn)上述目的的技術解決方案如下茶樹兒茶素組織細胞化學定位方法包括下述操作步驟A、取材取幼嫩的茶樹的鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織，清水清洗干凈后，放入清水中，備用；3B、制片將洗凈的茶樹鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織切片；C、切片留影將切成片的茶樹鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織顯微拍照留影；D、染色用滴管從切片的側滴加1%3%(w/v)香草醛濃鹽酸溶液，從切片的另一側用濾紙吸取溶液，直至到材料完全變紅；用濾紙吸取多余的香草醛濃鹽酸溶液，并用吹風機吹干表面的香草醛濃鹽酸溶液，得染色切片；E、顯微鏡觀察染色后30分鐘內，對染色切片顯微拍照，記錄染色切片染色后形態(tài)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下幾方面的優(yōu)點1、本發(fā)明染色前無須進行材料的固定，染色過程簡單，操作方便。2、針對茶樹的兒茶素來說，與常用的三氯化鐵等酚類物質的顯色劑相比較，香草醛酸性溶液染色劑顯色速度快，靈敏度高，特異性好，見表l。3、本發(fā)明不僅能對茶組織器官兒茶素定位，還可以對茶細胞內細胞器兒茶素精確定位。圖1為白楊葉20y。(w/v)香草醛濃鹽酸染色圖(摘自Yu-YingKao(高玉英).2002)，圖2為茶鮮葉下表皮染色前圖，圖3為茶鮮葉下表皮濃鹽酸染色后圖，圖4為茶鮮葉下表皮1%香草醛濃鹽酸染色后圖，圖5為茶鮮葉下表皮3%香草醛濃鹽酸染色后圖，圖6為茶鮮葉下表皮0.5%香草醛濃鹽酸染色后圖，圖7為茶鮮葉下表皮1%香草醛濃鹽酸染色10min后圖，圖8為茶鮮葉下表皮1%香草醛濃鹽酸染色30min后圖，圖9為茶鮮葉下表皮1%香草醛濃鹽酸染色60min后圖，圖10為茶嫩莖FAA固定后1%香草醛濃鹽酸染色圖，圖11為茶嫩莖1%香草醛濃鹽酸染色圖，圖12為茶愈傷組織細胞1%香草醛濃鹽酸與碘液雙重染色圖。具體實施例方式下面結合附圖，通過實施例對本發(fā)明作進一步地說明。實施例主要設備l.刃口刀片(日美牌)；2.載玻片；3.蓋玻片；4.滴管；5.直徑9cm培養(yǎng)皿；6.尖嘴鑷子；7.數(shù)碼顯微鏡。材料與試劑1.材料(l)春季或夏季剛長出一周內的茶鮮葉、嫩蓬；(2)剛長出的茶根尖；(3)茶愈傷組織；(4)新鮮的胡蘿卜。2.主要試劑(1)1%香草醛濃鹽酸溶液取lg香草醛溶于100ml濃鹽酸中；(2)清水；(3)10%鹽酸溶液取26g濃鹽酸濃度(36M)加入10g水；(4)軟化劑(50%酒精甘油=1:1)，S卩50%酒精溶液和甘油按體積1:1混合；(5)15%氫氟酸取32§濃氫氟酸濃度(47%)加入15g水；(6)FAA固定液按體積比甲醛:冰乙酸乙醇=1:1:18混合；(7)0.01mol/L碘液稱取1.3g碘，加入2.5g碘化鉀及25ml蒸餾水；(8)70%硫酸取28g濃硫酸濃度(98M)加入70g水。操作方法染色步驟取材一制片一染色一顯微鏡觀察1、取材取幼嫩的茶樹器官，即茶樹新鮮的鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織，清水清洗干凈后，放入清水中，以免萎蔫，備用。2、制片采用徒手切片法。(l)茶葉片制片取新鮮的胡蘿卜，去除木質部，切成橫切面0.5cm*0.5cm，長度5cm的蘿卜條，在蘿卜條一端縱切一縫，將茶鮮葉切成適當大小，夾在縫隙中。在切片時，用左手的拇指與食指、中指夾住支持物，大拇指應低于食指23mm，以免被刀片割破。支持物要伸出食指外約23mm，左手拿支持物要松緊適度，右手平穩(wěn)地拿住刀片并與支持物成垂直。將刀口向內對著支持物，并使刀片與支持物切口基本上保持平行，再用右手的臂力(不要用手的腕力)自左前方向右后方均勻地拉切，將夾持物和其中的材料一齊切成薄片，連續(xù)地切下數(shù)片后，將刀片放在預先盛有清水的培養(yǎng)皿中輕輕晃動，切片即漂浮于水中。當切到一定數(shù)量后，可在培養(yǎng)皿內挑選透明的薄片用低倍鏡觀察檢査。好的切片應該是薄且比較透明、組織結構完整，否則要重新進行切片。選取切得較好切片材料，放在載玻片上，滴上一滴清水，小心蓋上蓋玻片，避免氣泡的產(chǎn)生。用濾紙吸取多余的水，顯微拍照，記錄染色前形態(tài)。(2)茶葉表皮、葉肉細胞制片若觀察茶鮮葉葉肉細胞或葉表皮細胞染色效果，可以將鮮葉切成0.5cm*0.5cra大小，放入10%(w/w)鹽酸溶液中解離10-20min，以葉片綠色稍褪為宜。用鑷子取出少量解離后的葉片放在載玻片上，滴上一滴清水，小心蓋上蓋玻片，避免氣泡的產(chǎn)生。用鑷子輕輕敲擊蓋玻片，讓材料分散開。(3)茶嫩莖制片取新鮮的胡蘿卜，去除木質部，切成橫切面0.5cm*0.5cm，長度5cm的蘿卜條，在蘿卜條一端縱切一縫，在縫里挖一個和茶嫩莖形狀相似、大小相同的凹陷，把茶嫩莖夾在凹陷里。(4)茶根尖制片方法同步驟(3)。(5)茶愈傷組織制片茶愈傷組織無需支持物，直接徒手切片即可。3、切片留影將切成片的茶樹鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織顯微拍照留影。4、染色用滴管從切片的側滴加P/。(w/v)香草醛濃鹽酸溶液，從切片的另一側用濾紙吸取溶液，直至到切片完全變紅。用濾紙吸取多余的香草醛濃鹽酸溶液，并用吹風機吹干切片表面的香草醛濃鹽酸溶液，避免濃鹽酸對身體和顯微鏡的傷害，得染色切片。5、顯微鏡觀察染色后30分鐘內，對染色切片顯微拍照，記錄染色切片染色后形態(tài)。技術特點說明1.染色特異性茶樹中能與香草醛濃鹽酸溶液顯色的物質有兒茶素、茶皂素、二氫黃酮醇類以及黃酮醇類化合物，但后三者在茶樹中的含量低。且表1顯示后三者和香草醛濃鹽酸反應的標準曲線斜率較兒茶素類小(表l)，反應靈敏度低，故不會形成明顯的干擾。雖然花青素和花白素在酸性條件下呈現(xiàn)的紅色會干擾兒茶素與香蘭素酸性溶液的顯色反應，但茶中花青素只占干重的0.01%，而茶樹新稍中花白素只占干重的2%-3%[4]，這種干擾可以忽略不計，試驗也證實，經(jīng)過不含香蘭素的酸性溶液作用后的茶樹鮮葉并不呈現(xiàn)顏色反應(圖2、圖3)2.染色劑濃度香草酸濃鹽酸溶液染色劑的濃度在1%3%(w/v)較為適宜(圖4、圖5)，低于0.5%材料不能被充分染色(圖6)。酸溶液為濃鹽酸或70%硫酸。3.染色保留時間材料經(jīng)l%(w/v)香草醛濃鹽酸溶液染色劑染色后，顏色立刻達到最深，染色后30min后，顏色開始逐漸褪去(圖7、圖8、圖9)。即使用甘油封片，不能阻止褪色。4.固定染色染色材料在染色前不易采取FAA固定液(甲醛:冰乙酸乙醇=1:1:18)固定，經(jīng)過固定的材料兒茶素溶出，造成染色彌散，不能準確判斷兒茶素在材料中積累的位置。如茶嫩莖經(jīng)FAA固定液固定后，木質部導管不能顯色、其他組織顯色不清晰(圖10)。未經(jīng)固定液固定的茶嫩莖，l%(w/v)香草醛濃鹽酸溶液染色劑染色后，木質部導管染色鮮艷，其他組織染色清晰，不存在染色效果彌散的現(xiàn)象(圖11)。5.雙重染色該顯色劑可以與碘液染色劑雙重染色，即材料用碘液染色后，再用該顯色劑顯色(圖12)。這對確定細胞核是否有兒茶素積累，至關重要。細胞核不經(jīng)染色劑染色，不易觀測，經(jīng)碘液染色后呈黃色。表1香草醛鹽酸顯色的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>參考文獻鐘蘿.茶葉品質理化分析[M].上海:上?？茖W技術出版社，1989,278279。高玉英,斯科特A哈丁，蔡鐘瑞.白楊積累縮合丹寧和木質化細胞中的兩個不同丙氨酸解氨酶基因的不同表達[J].植物生理學，2002,130:796~807(Yu-YingKao,ScottA.Harding,andChung-JuiTsai.Differentialexpressionoftwodistinctphenylalanineammonia-lyasegenesinCondensedtannin-accumulatingandlignifyingcellsofQuakingAspen[J].PlantPhysiology,2002，130:796~807)。[4]宛曉春.茶生物化學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2003,1819。權利要求1、茶樹兒茶素組織細胞化學定位方法，其特征在于包括下述操作步驟A、取材取幼嫩的茶樹的鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織，清水清洗干凈后，放入清水中，備用；B、制片將洗凈的茶樹鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織切片；C、切片留影將切成片的茶樹鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織顯微拍照留影；D、染色用滴管從切片的側滴加1％～3％(w/v)香草醛濃鹽酸溶液，從切片的另一側用濾紙吸取溶液，直至到材料完全變紅；用濾紙吸取多余的香草醛濃鹽酸溶液，并用吹風機吹干表面的香草醛濃鹽酸溶液，得染色切片；E、顯微鏡觀察染色后30分鐘內，對染色切片顯微拍照，記錄染色切片染色后形態(tài)。全文摘要本發(fā)明涉及茶樹兒茶素組織細胞化學定位方法，解決了現(xiàn)有酚類組織化學定位技術中染色顯色特異性差、顯色速度慢、靈敏度不高，無法進行茶樹兒茶素組織細胞化學定位的問題。本發(fā)明包括下述操作步驟取幼嫩的茶樹的鮮葉或嫩莖或根尖或茶愈傷組織；制成切片；用滴管從組織切片的側面滴加1％～3％(w/v)香草醛濃鹽酸溶液，從組織切片的另一側用濾紙吸取溶液，直至到材料完全變紅；用濾紙吸取多余的香草醛濃鹽酸溶液，并用吹風機吹干切片表面，得染色切片；染色后30分鐘內，對染色切片顯微拍照，記錄染色切片染色后形態(tài)。本發(fā)明染色過程簡單，操作方便；與常用的三氯化鐵等酚類物質的顯色劑相比較，香草醛酸性溶液染色劑顯色速度快，靈敏度高，特異性好；不僅能對茶組織器官兒茶素定位，還可以對茶細胞器兒茶素精確定位。文檔編號G01N21/95GK101482520SQ200910116108公開日2009年7月15日申請日期2009年1月21日優(yōu)先權日2009年1月21日發(fā)明者劉亞軍,濤夏,高麗萍申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學