專利名稱：總蕓苔素含量的液相色譜測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物生長調(diào)節(jié)劑含量的液相色譜測定方法，尤其是蕓苔素的液相色譜測定方法，屬于色譜分析檢測技術領域。
背景技術：
目前，蕓苔素類物是植物生長調(diào)節(jié)劑類物質(zhì)，有促進植物細胞伸長、分裂、提高結(jié)實率和全面調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的作用。對糧、棉、油、麻、果、菜及食用菌有明顯的增產(chǎn)效果，目前國內(nèi)外在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中均已廣泛應用。天然蕓苔素類物由于其來源于自然，具有高效、無毒、無污染的優(yōu)點，是今后綠色農(nóng)藥的發(fā)展方向。
從天然物質(zhì)中提取的蕓苔素是一類物質(zhì)，目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)并認可的天然蕓苔素已有近50多種，總稱為蕓苔素類物，時至今日，迫切需要一種能較準確地測定其總量的檢測方法，但由于目前尚不能準確測其總量，因而對商品的生產(chǎn)和應用帶來很大的盲目性，是不利的。
國內(nèi)外有人報導了蕓苔素的測定方法，如“高效液相色譜法測定22S，23S，23R表高油菜素內(nèi)酯”；“高效液相色譜法測定檳榔花粉中的蕓苔素內(nèi)酯”；“丙酰蕓苔素內(nèi)酯的氣相色譜分析”“Anal ChimActa，1990；228(1)；101”；“AnalSci，1988；4(5)；533；CA，109；226035W”等?？偨Y(jié)如下他們都是將蕓苔素類物中的某一種物質(zhì)，如蕓苔素內(nèi)酯(BR)、表蕓苔素內(nèi)酯(ep-BR)、表高蕓苔素內(nèi)酯(BR-120)、丙酰蕓苔素內(nèi)酯、扁豆甾醇內(nèi)酯、高扁豆甾醇內(nèi)酯、栗甾酮等衍生化后，使用色譜法測定(氣相色譜或液相色譜)，使用的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器等。在衍生化方面，使用下列衍生化試劑1-氰基異吲哚-2-間-苯硼酸、9一菲硼酸、二甲氨基萘-5-磺酰硼酸、二茂鐵硼酸、萘硼酸和苯硼酸等，其方法的特點是測定蕓苔素衍生化后生成的蕓苔素衍生物的量，來對該種蕓苔素定量。
另外，國內(nèi)外目前應用的這類方法，對組分相對單一的產(chǎn)品，如用合成方法生產(chǎn)的某一種蕓苔素原藥和產(chǎn)品或用提取方法得到的某一種蕓苔素的分析來說是適用的，方法準確，結(jié)果令人滿意，但只能測定該種蕓苔素的含量。對從天然物質(zhì)中提取的蕓苔素類物來說，是不適用的，原因很簡單，從天然物質(zhì)中提取的蕓苔素是多種蕓苔素的混合物，組分可能多達幾種到數(shù)十種，想用上述測定單一含量的方法來測定其總含量是不可能的，也是不現(xiàn)實和無操作性的，目前市面上還無所有上述各蕓苔素標準品的成品。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有蕓苔素類物中總蕓苔素含量不能準確測定的不足，本發(fā)明提供一種利用液相色譜測定蕓苔素類物衍生化后剩余的衍生化試劑的量，來對蕓苔素類物的總量進行定量的方法。
本發(fā)明解決此技術問題所采用的技術方案是總蕓苔素含量的液相色譜測定方法，所用儀器、試劑、色譜條件、樣品處理、測定及計算步驟如下 儀器 高效液相色譜儀；手動進樣器；紫外-可見光檢測器；數(shù)據(jù)處理機； 試劑 甲醇或乙腈；乙酸乙酯(A.R)；蕓苔素類物標準品；苯硼酸類物標準品；天然蕓苔素類物和制劑； 色譜條件 色譜柱6.0mm I.d.×150mm不銹鋼柱，內(nèi)裝
填料； 流動相組成體積比甲醇(乙腈)∶水＝60～90∶40～10； 流速0.7～1ml/min； 檢測波長UV222～270nm； 柱溫室溫； 樣品處理 (1)苯硼酸類物標準品溶液的配制 準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯定容為V1； (2)蕓苔素類物標準品溶液的配制 準確稱取15.0mg蕓苔素類物標準品M2，準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1，一并放入燒杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇或乙酸乙酯定容為V2； (3)天然蕓苔素類物試樣溶液的配制 固體試樣配制準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1，按樣品∶苯硼酸類物＝1.0～2.0∶1的比例，準確稱取粉狀樣品M3，一并放入燒杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇或乙酸乙酯定容為V3； 液體試樣配制準確吸取1.0～2.0ml液體樣品M3放入燒杯中，在80℃水浴中蒸發(fā)至干，然后準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1加入燒杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇或乙酸乙酯定容為V3； 苯硼酸類物峰面積與質(zhì)量關系的確定 (1)在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml苯硼酸類物標準品溶液V4，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀釋至刻度V5，搖勻，取10μl進樣V6，進行液相色譜測定，測出苯硼酸類物峰面積S1； (2)與苯硼酸類物標準品質(zhì)量M1相當?shù)姆迕娣eZ1為 苯硼酸類物峰面積與蕓苔素類物標準品的質(zhì)量關系 (1)在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml蕓苔素類物標準品溶液V7，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀釋至刻度V8，并搖勻，取10μl進樣V9，進行液相色譜測定，測出剩余苯硼酸類物的峰面積S2； (2)剩余的苯硼酸類物的總峰面積Z2為 (3)蕓苔素類物標準品質(zhì)量M2所消耗苯硼酸類物的總峰面積Z3為 (4)蕓苔素類物標準品質(zhì)量M2與苯硼酸類物的峰面積的關系R1為 苯硼酸類物峰面積與天然蕓苔素類物試樣溶液的質(zhì)量關系 (1)在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml天然蕓苔素類物試樣溶液V10，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀釋至刻度V11，搖勻，取10μl進樣V12，進行液相色譜測定，測出剩余苯硼酸類物的峰面積S3； (2)天然蕓苔素類物試樣溶液剩余苯硼酸類物的總峰面積Z4為 (3)天然蕓苔素類物試樣溶液中蕓苔素類物消耗苯硼酸類物的總峰面積Z5為 (4)天然蕓苔素類物試樣溶液中蕓苔素類物相當于蕓苔素類物標準品的質(zhì)量A為 天然蕓苔素類物試樣中總蕓苔素類物含量，按下式計算 式中 X-試樣中總蕓苔素類物含量，mg/g(固體樣)或mg/ml(液體樣)； M2-蕓苔素類物標準品的質(zhì)量，mg； M3-天然蕓苔素類物試樣的質(zhì)量，g(固體樣)或ml(液體樣)； S1-苯硼酸類物標準品溶液測定中苯硼酸類物的峰面積； S2-蕓苔素類物標準品溶液測定中剩余的苯硼酸類物的峰面積； S3-天然蕓苔素類物試樣溶液測定中剩余的苯硼酸類物的峰面積。
本發(fā)明用測定蕓苔素類物衍生化后剩余的衍生化試劑的量，來測定蕓苔素類物總量。衍生化試劑為苯硼酸類物，此類物質(zhì)能與蕓苔素類物產(chǎn)生定量的衍生化反應。
本發(fā)明的有益效果是，較好地解決了從天然物質(zhì)中提取的蕓苔素類物中蕓苔素總量的測定，對科學地指導科研、生產(chǎn)和應用具有很大的意義和價值。
具體實施例方式 實施方式一 儀器為日本島津LC-6A高效液相色譜儀；7125手動進樣器；C-R3A紫外-可見光檢測器；數(shù)據(jù)處理機； 試劑甲醇(色譜試劑)；蕓苔素類物標準品為蕓苔素內(nèi)酯(BR)標準品；苯硼酸類物標準品為苯硼酸標準品，天然蕓苔素類物和制劑； 色譜條件 色譜柱6.0mm I.d.×150mm不銹鋼柱，內(nèi)裝
填料； 流動相組成體積比甲醇∶水＝80∶20；流動相經(jīng)0.5μm濾膜過濾后使用； 流速0.7～1ml/min； 檢測波長UV 222nm； 柱溫室溫； 樣品處理按發(fā)明內(nèi)容中的步驟進行 按樣品處理(1)苯硼酸類物標準品溶液的配制方法，制成苯硼酸標準品溶液備用； 按樣品處理(2)蕓苔素類物標準品溶液的配制方法，制成BR標準品溶液備用； 按樣品處理(3)天然蕓苔素類物試樣溶液的配制方法中固體試樣配制方法，準確稱取10.0mg苯硼酸標準品和準確稱取12.0mg粉狀樣品，一并放入燒杯中，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇定容，制成天然蕓苔素類物試樣溶液備用； 在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml苯硼酸標準溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10μl進樣，進行液相色譜測定，測出苯硼酸的峰面積S1＝1417989.9； 在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml BR標準品溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10μl進樣，進行液相色譜測定，測出BR標準品溶液剩余的苯硼酸的峰面積S2＝1007867.0； 在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml天然蕓苔素類物試樣溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10μl進樣，進行液相色譜測定，測出天然蕓苔素類物試樣溶液剩余的苯硼酸的峰面積S3＝983630.6； 總蕓苔素類物含量，按下式計算(以BR表示) 實施方式二 儀器、色譜條件同實施方式一； 試劑甲醇(色譜試劑)；蕓苔素類物標準品為表蕓苔素內(nèi)酯(ep-BR)標準品；苯硼酸類物標準品為苯硼酸標準品，天然蕓苔素類物和制劑； 樣品處理按發(fā)明內(nèi)容中的步驟進行 按樣品處理(1)苯硼酸類物標準品溶液的配制方法，制成苯硼酸標準品溶液備用； 按樣品處理(2)蕓苔素類物標準品溶液的配制方法，準確稱取15.0mgep-BR標準品和準確稱取10.0mg苯硼酸標準品，一并放入燒杯中，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇定容，制成ep-BR標準品溶液備用； 按樣品處理(3)天然蕓苔素類物試樣溶液的配制方法中液體試樣配制方法，準確吸取1.50ml液體樣品放入燒杯中，在80℃水浴中蒸發(fā)至于，然后準確稱取10.0mg苯硼酸標準品加入燒杯中，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇定容，制成天然蕓苔素類物試樣溶液備用； 在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml苯硼酸標準品溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10μl進樣，進行液相色譜測定，測出苯硼酸的峰面積S1＝1417635.2； 在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml ep-BR標準溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10μl進樣，進行液相色譜測定，測出ep-BR標準品溶液剩余的苯硼酸的峰面積S2＝1005934.2； 在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml天然蕓苔素類物試樣溶液，放入10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10μl進樣，進行液相色譜測定，測出天然蕓苔素類物試樣溶液剩余的苯硼酸的峰面積S3＝1062543.5； 總蕓苔素類物含量，按下式計算(以ep-BR計)
權利要求
1、一種總蕓苔素含量的液相色譜測定方法，其特征在于，所用儀器、試劑、色譜條件、樣品處理、測定及計算步驟如下
儀器
高效液相色譜儀；手動進樣器；紫外-可見光檢測器；數(shù)據(jù)處理機；
試劑
甲醇或乙腈；乙酸乙酯(A.R)；蕓苔素類物標準品；苯硼酸類物標準品；
天然蕓苔素類物和制劑；
色譜條件
色譜柱6.0mm I.d.×150mm不銹鋼柱，內(nèi)裝CLC-C18填料；
流動相組成體積比甲醇(乙腈)∶水＝6090∶40～10；
流速0.7～1ml/min；
檢測波長UV 222～270nm；
柱溫室溫；
樣品處理
(1)苯硼酸類物標準品溶液的配制
準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯定容為V1；
(2)蕓苔素類物標準品溶液的配制
準確稱取15.0mg蕓苔素類物標準品M2，準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1，一并放入燒杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇或乙酸乙酯定容為V2；
(3)天然蕓苔素類物試樣溶液的配制
固體試樣配制準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1，按樣品∶苯硼酸類物＝1.0～2.0∶1的比例，準確稱取粉狀樣品M3，一并放入燒杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇或乙酸乙酯定容為V3；
液體試樣配制準確吸取1.0～2.0ml液體樣品M3放入燒杯中，在80℃水浴中蒸發(fā)至干，然后準確稱取10.0mg苯硼酸類物標準品M1加入燒杯中，用甲醇或乙酸乙酯溶解后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，于80℃水浴反應0.5h，冷卻后，用甲醇或乙酸乙酯定容為V3；
苯硼酸類物峰面積與質(zhì)量關系的確定；
(1)在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml苯硼酸類物標準品溶液V4，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀釋至刻度V5，搖勻，取10μl進樣V6，進行液相色譜測定，測出苯硼酸類物峰面積S1；
(2)與苯硼酸類物標準品質(zhì)量M1相當?shù)姆迕娣eZ1為
苯硼酸類物峰面積與蕓苔素類物標準品的質(zhì)量關系
(1)在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml蕓苔素類物標準品溶液V7，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀釋至刻度V8，并搖勻，取10μl進樣V9，進行液相色譜測定，測出剩余苯硼酸類物的峰面積S2；
(2)剩余的苯硼酸類物的總峰面積Z2為
(3)蕓苔素類物標準品質(zhì)量M2所消耗苯硼酸類物的總峰面積Z3為
Z3＝Z1-Z2＝(S1-S2)×50×103
(4)蕓苔素類物標準品質(zhì)量M2與苯硼酸類物的峰面積的關系R1為
苯硼酸類物峰面積與天然蕓苔素類物試樣溶液的質(zhì)量關系
(1)在色譜條件相同的情況下，準確吸取0.50ml天然蕓苔素類物試樣溶液V10，放入10ml容量瓶中，用甲醇或乙酸乙酯稀釋至刻度V11，搖勻，取10μl進樣V12，進行液相色譜測定，測出剩余苯硼酸類物的峰面積S3；
(2)天然蕓苔素類物試樣溶液剩余苯硼酸類物的總峰面積Z4為
(3)天然蕓苔素類物試樣溶液中蕓苔素類物消耗苯硼酸類物的總峰面積Z5為
Z5＝Z1-Z4＝(S1-S3)×50×103
(4)天然蕓苔素類物試樣溶液中蕓苔素類物相當于蕓苔素類物標準品的質(zhì)量A為
天然蕓苔素類物試樣中總蕓苔素類物含量，按下式計算
式中
X-試樣中總蕓苔素類物含量，mg/g(固體樣)或mg/ml(液體樣)；
M2-蕓苔素類物標準品的質(zhì)量，mg；
M3-天然蕓苔素類物試樣的質(zhì)量，g(固體樣)或ml(液體樣)；
S1-苯硼酸類物標準品溶液測定中苯硼酸類物的峰面積；
S2-蕓苔素類物標準品溶液測定中剩余的苯硼酸類物的峰面積；
S3-天然蕓苔素類物試樣溶液測定中剩余的苯硼酸類物的峰面積。
2、根據(jù)權利要求1所述的總蕓苔素含量的液相色譜測定方法，其特征在于，所述的苯硼酸類物是硼酸的一類有機物，它們包括1-氰基異吲哚-2-間-苯硼酸、9一菲硼酸、二甲氨基萘-5-磺酰硼酸、二茂鐵硼酸、萘硼酸、苯硼酸或苯硼酸的類似物。
3、根據(jù)權利要求1所述的總蕓苔素含量的液相色譜測定方法，其特征在于，所述的蕓苔素類物是蕓苔素內(nèi)酯(BR)、表蕓苔素內(nèi)酯(ep-BR)、表高蕓苔素內(nèi)酯(BR-120)、扁豆甾醇內(nèi)酯、高扁豆甾醇內(nèi)酯、28-高蕓苔素內(nèi)酯、去甲蕓苔素內(nèi)酯、栗甾酮、扁豆甾酮、蕓苔素甾酮。
4、根據(jù)權利要求1所述的總蕓苔素含量的液相色譜測定方法，其特征在于，所述的試樣是從天然物質(zhì)中提取的蕓苔素類物和由其配成的制劑。
5、根據(jù)權利要求1所述的總蕓苔素含量的液相色譜測定方法，其特征在于，用測定蕓苔素類物衍生化后剩余的衍生化試劑的量，來測定蕓苔素類物總量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種總蕓苔素含量的液相色譜測定方法，屬于色譜分析檢測技術領域。它包括苯硼酸類物標準品溶液的配制；蕓苔素類物標準溶液的配制；天然蕓苔素類物試樣溶液的配制；在適當?shù)臈l件下，使苯硼酸類物與所有具有鄰羥基的蕓苔素進行衍生化反應。本發(fā)明較好地解決了從天然物質(zhì)中提取的蕓苔素類物中蕓苔素總量的測定，對科學地指導科研、生產(chǎn)和應用具有很大的意義和價值。適合對從天然物質(zhì)中提取的蕓苔素類物中蕓苔素總量的測定。
文檔編號G01N30/86GK101672831SQ20091016770
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權日2009年9月22日
發(fā)明者蔣捷先 申請人:蔣捷先