專利名稱：特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物基因芯片的制備方法，尤其涉及一種生物蛋白檢測(cè)芯 片的制備方法，可以用于生物蛋白特異性分析，屬于生物信息工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
DNA是生命重要的遺傳物質(zhì)，人們對(duì)于DNA的研究和應(yīng)用正在不斷地深 入中，孕育出當(dāng)前熱門(mén)的一門(mén)基因芯片技術(shù)。該技術(shù)是將基因探針以微陣列的 方式通過(guò)化學(xué)修飾、固定在固相載體表面。
基因探針又稱"寡核苷酸探針"，是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異 核苷酸序列，它可以包括整個(gè)基因，可以僅僅是基因的一部分；也可以是DNA 本身，還可以是由之轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA。寡核苷酸探針是人工合成的，與己知基 因DNA互補(bǔ)的，長(zhǎng)度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基 酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。為 了確定寡核苷酸探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo) 記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)?，F(xiàn)有比較流行的標(biāo)記方式是采用熒光 基團(tuán)標(biāo)記，當(dāng)目標(biāo)核酸與基因芯片上的核苷酸片段雜交后，熒光信號(hào)的強(qiáng)度便 可以示出待檢樣品中特異性核酸的種類及濃度。
DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或 單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲得的DNA探針數(shù)量很多，包括細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)、真 菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針 和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。 以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比 值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感 性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細(xì)菌的基因組大小約 5xl06bp，約含3000個(gè)基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得 某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫(kù)的辦法，即將 細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫(kù)。然后用 多種其它菌種的DNA作探針來(lái)篩選，產(chǎn)生雜交信號(hào)的克隆被剔除，最后剩下 的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段。將此重 組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來(lái)源和功 能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的 篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫(kù)為可表達(dá)性，克隆菌落 或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來(lái)源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽(yáng)性克 隆，所得到多個(gè)陽(yáng)性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清 反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所 特有的。用這種表達(dá)文庫(kù)篩選得到的顯然只是特定基因探針。
準(zhǔn)確、及時(shí)、高效、靈敏的醫(yī)學(xué)診斷在人類戰(zhàn)勝疾病的過(guò)程中扮演著一個(gè) 關(guān)鍵角色，這是對(duì)疾病進(jìn)行治療和調(diào)控的前提。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，包括免疫層 析法、電化學(xué)發(fā)光、表面等離子共振技術(shù)、石英晶體微天平、同位素標(biāo)記 (RIA)、酶標(biāo)記(ELISA)等分析技術(shù)，均不能同時(shí)滿足制樣簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅 速和靈敏度高等要求。隨著基因芯片技術(shù)研究的深入開(kāi)展， 一種用于特異性蛋白檢測(cè)、由熒光分子標(biāo)記的單鏈DNA探針為檢測(cè)手段的基因檢測(cè)芯片，在這
些疾病的前期診療及后期療效復(fù)檢中的作用，己得到了充分的理論證明。但長(zhǎng) 期以來(lái)，對(duì)此項(xiàng)技術(shù)的研究?jī)H限于理論，而通過(guò)實(shí)驗(yàn)室制備并對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)的 深入研究一直沒(méi)有得以展開(kāi)。為此，尋求一種實(shí)驗(yàn)室可操作的制備方法，為特 異性蛋白檢測(cè)芯片的工業(yè)化制造突破障礙，是從事該領(lǐng)域工作的科研人員的一 項(xiàng)重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于突破現(xiàn)有技術(shù)的瓶頸，提供一種特異性蛋白檢測(cè)芯片的 制備方法，通過(guò)該種實(shí)驗(yàn)室可實(shí)施的制備手段，可以提高對(duì)待檢試液中低濃度 的特異性蛋白檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，提供更具體、更量化的實(shí)驗(yàn)方案支持。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于將至少類條修飾有熒光分 子的單鏈DNA探針化學(xué)修飾在貴重金屬基片表面，使標(biāo)記的熒光分子的熒光 被貴重金屬表面淬滅，處于熒光"關(guān)"的狀態(tài)，具體步驟如下
I、根據(jù)特異性蛋白的種類多樣性，篩選出分別與之特異性結(jié)合的一類或 多類單鏈DNA探針；
II 、采用不同的熒光分子針對(duì)性地修飾各類單鏈DNA探針一端；
III、將熒光分子修飾過(guò)的其中一類或多類單鏈DNA探針通過(guò)化學(xué)鍵合固
定在貴重金屬基片表面，制成特異性蛋白檢測(cè)芯片。
上述本發(fā)明技術(shù)方案第二步中，熒光分子采用熒光范圍覆蓋整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)
的CdSe量子點(diǎn)、或CdS量子點(diǎn)、或CdTe量子點(diǎn)、或CdSe/ZnS量子點(diǎn)、或CdSe/CdS量子點(diǎn)、或CdSe/CdS/ZnS量子點(diǎn)、或CdTe/CdS量子點(diǎn)、或 CdTe/ZnS量子點(diǎn)、或CdTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)，或者包括但不局限于吲哚類菁染 料、花青染料的各種有機(jī)熒光分子。
上述本發(fā)明技術(shù)方案第三步中，具有特異性結(jié)合一類特異性蛋白功能的多 類單鏈DNA探針在貴重金屬基片表面的不同區(qū)域呈陣列排布，用于某一類特 異性蛋白的檢測(cè)；或者具有特異性結(jié)合一類以上特異性蛋白功能的多類單鏈 DNA探針在貴重金屬基片表面的不同區(qū)域呈陣列排布，并以特異性蛋白種類所 對(duì)應(yīng)的單鏈DNA探針?lè)纸M，用于一類以上特異性蛋白的檢測(cè)。并且，所述貴 重金屬基片采用金薄膜、銀薄膜、或者由金納米顆?；蜚y納米顆粒涂布的玻片 而所述化學(xué)鍵合包括但不限于巰基與貴重金屬表面形成配位鍵、或氨基與羧基 之間形成酰胺鍵，或者巰基與碳碳雙鍵之間的加成等。
本發(fā)明的顯著進(jìn)步在于通過(guò)單鏈DNA探針與病變的蛋白質(zhì)之間特異性 的相互作用改變貴重金屬基片表面和熒光分子之間的距離，引起熒光分子熒光 強(qiáng)度的顯著改變，從而實(shí)現(xiàn)利用單鏈DNA探針對(duì)特異性蛋白的高靈敏檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)單鏈DNA探針與特異性蛋白之間的特異性相互作用改變貴重 金屬表面和熒光分子之間的距離，引起熒光分子熒光強(qiáng)度的顯著改變，并基于 該特性制備特異性蛋白的檢測(cè)芯片。
本發(fā)明特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，詳細(xì)過(guò)程是1)針對(duì)不同的重 大疾，篩選出與之特異性蛋白專門(mén)特異性結(jié)合的一類或多類單鏈DNA探針； 2)采用不同顏色的熒光分子針對(duì)性地修飾單鏈DNA探針一端；3)利用上述
7由熒光分子修飾過(guò)的單鏈DNA探針修飾固定到貴重金屬基片表面，使其修飾
的熒光分子熒光處于"關(guān)"的狀態(tài)，完成特異性蛋白檢測(cè)芯片的制作。該檢測(cè)
芯片的工作原理是加入檢測(cè)樣品，當(dāng)被檢測(cè)的樣品中沒(méi)有目標(biāo)的特異性蛋白 時(shí)，熒光分子的熒光沒(méi)有變化，仍然處于"關(guān)"的狀態(tài)；當(dāng)被檢測(cè)的樣品中含 有與單鏈DNA探針特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)，熒光分子的熒光將處于"開(kāi)"的 狀態(tài)，熒光強(qiáng)度呈數(shù)量級(jí)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性蛋白的高靈敏檢測(cè)。
其中，步驟1)貴重金屬采用金納米顆粒、或銀納米顆粒、或金薄膜、或 銀薄膜。
步驟2)量子點(diǎn)采用CdSe量子點(diǎn)、或CdS量子點(diǎn)、或CdTe量子點(diǎn)、或 CdSe/ZnS量子點(diǎn)、或CdSe/CdS量子點(diǎn)、或CdSe/CdS/ZnS量子點(diǎn)、或 CdTe/CdS量子點(diǎn)、或CdTe/ZnS量子點(diǎn)、或CdTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)，或者包括 但不局限于吲哚類菁染料、花青染料的各種有機(jī)熒光分子。上述熒光分子的熒 光范圍可以覆蓋整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)，從紫色到紅色。
步驟3)中具有特異性結(jié)合一類特異性蛋白功能的多類單鏈DNA探針可在 貴重金屬基片表面的不同區(qū)域呈陣列排布，用于某一類特異性蛋白的檢測(cè)。并 且其排布后的化學(xué)鍵合具有多樣性，可以包括但不限于巰基與貴重金屬表面形 成配位鍵、氨基與羧基之間形成酰胺鍵、或者巰基與碳碳雙鍵之間的加成等。
步驟4)中具有特異性結(jié)合一類以上特異性蛋白功能的多類單鏈DNA探針 在貴重金屬基片表面的不同區(qū)域呈陣列排布，并以特異性蛋白種類所對(duì)應(yīng)的單 鏈DNA探針?lè)纸M，用于一類以上特異性蛋白的檢測(cè)。
步驟5)中加入檢測(cè)樣品后，當(dāng)被檢測(cè)樣品中含有與單 DNA特異性作用 的特異性蛋白時(shí)，引起熒光分子熒光強(qiáng)度的顯著變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高靈敏檢測(cè)。歩驟3)中可以利用不同熒光的熒光分子分別標(biāo)記同一種特異性蛋白對(duì)應(yīng)
的多條單鏈DNA探針，如果樣品檢測(cè)后，多種熒光分子的熒光強(qiáng)度都出現(xiàn)顯 著增強(qiáng)，可以定量地判斷被檢測(cè)個(gè)體含有此類特異性蛋白的含量，為治療提供 更具體、更量化的方案。步驟4)中可以利用不同熒光的熒光分子分別多種特 異性蛋白對(duì)應(yīng)的多條單鏈DNA探針，如果樣品檢測(cè)后，多種熒光分子的熒光 強(qiáng)度都出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，可以判斷被檢測(cè)個(gè)體含有多類特異性蛋白。 實(shí)施例l:
將10u L濃度為10ii M的單鏈DNA探針修飾在10nm厚的金膜表面，其 中單鏈DNA的另一端修飾了綠色熒光的量子點(diǎn)。檢測(cè)前量子點(diǎn)的熒光被金納 米薄膜淬滅。加入血樣，5分鐘后對(duì)樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，如果綠色熒光 增強(qiáng)，說(shuō)明血樣中含有該DNA對(duì)應(yīng)病變一的特異性蛋白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì) 算得到血樣中該病變一特異性蛋白的濃度。
實(shí)施例2:
將10 "L濃度為10uM的單鏈DNA探針修飾在30nm的銀納米粒子表 面，其中單鏈DNA的另一端修飾了紅色熒光的有機(jī)染料分子Cy3。 Cy3的熒 光被銀納米粒子淬滅。加入血樣，5分鐘后對(duì)樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，如果 紅色熒光增強(qiáng)，說(shuō)明血樣中含有該DNA對(duì)應(yīng)病變二的特異性蛋白。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線，計(jì)算得到血樣中該病變二特異性蛋白的濃度。
實(shí)施例3:
分別將10 U L濃度為10 P M的單鏈DNA探針1和單鏈DNA探針2修飾 在30nm厚的金納米粒子表面，其中單鏈DNA探針1的另一端修飾了綠色熒 光的Cy3，單鏈DNA探針2的另一端修飾了紅色熒光的Cy5。兩種熒光都被金納米粒子淬滅。加入血樣，5分鐘后對(duì)樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，如果兩種 熒光分子的熒光強(qiáng)度都增強(qiáng)，說(shuō)明血樣中含有兩種探針都對(duì)應(yīng)病變?nèi)奶禺愋?蛋白，或者含有兩種探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)病變?nèi)筒∽兯牡奶禺愋缘鞍祝徊⒏鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線，計(jì)算得到血樣中一種或多種特異性蛋白的濃度。
綜上所述，本發(fā)明利用單鏈DNA與特異性蛋白之間的相互作用，通過(guò)對(duì) 標(biāo)志性蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別，改變讀出光信號(hào)的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的有效、實(shí) 時(shí)、高靈敏檢測(cè)。通過(guò)微機(jī)電系統(tǒng)的集成，可以實(shí)現(xiàn)該技術(shù)方案應(yīng)用的芯片 化，進(jìn)而提供一種便攜式、高通量、高靈敏的重大疾病早期診斷芯片。
以上僅是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍不構(gòu)成任何限制。 凡采用等同變換或者等效替換而形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明權(quán)利保護(hù)范圍 之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于將至少類條修飾有熒光分子的單鏈DNA探針化學(xué)修飾在貴重金屬基片表面，使標(biāo)記的熒光分子的熒光被貴重金屬表面淬滅，處于熒光“關(guān)”的狀態(tài)，具體步驟如下I、根據(jù)特異性蛋白的種類多樣性，篩選出分別與之特異性結(jié)合的一類或多類單鏈DNA探針；II、采用不同的熒光分子針對(duì)性地修飾各類單鏈DNA探針一端；III、將熒光分子修飾過(guò)的其中一類或多類單鏈DNA探針通過(guò)化學(xué)鍵合固定在貴重金屬基片表面，制成特異性蛋白檢測(cè)芯片。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于步驟II中所述熒光分子采用熒光范圍覆蓋整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)的CdSe量子點(diǎn)、或CdS量子點(diǎn)、或CdTe量子點(diǎn)、或CdSe/ZnS量子點(diǎn)、或CdSe/CdS量子點(diǎn)、或CdSe/CdS/ZnS量子點(diǎn)、或CdTe/CdS量子點(diǎn)、或CdTe/ZnS量子點(diǎn)、或CdTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)，或者包括但不局限于吲哚類菁染料、花青染料的各種有機(jī)熒光分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于步驟III中具有特異性結(jié)合一類特異性蛋白功能的多類單鏈DNA探針在貴重金屬基片表面的不同區(qū)域呈陣列排布，用于某一類特異性蛋白的檢測(cè)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于步驟m中具有特異性結(jié)合一類以上特異性蛋白功能的多類單鏈DNA探針在貴重金屬基片表面的不同區(qū)域呈陣列排布，并以特異性蛋白種類所對(duì)應(yīng)的單鏈DNA探針?lè)纸M，用于一類以上特異性蛋白的檢測(cè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于步驟III中所述貴重金屬基片采用金薄膜、銀薄膜、或者由金納米顆粒或銀 納米顆粒涂布的玻片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在 于步驟III中所述化學(xué)鍵合包括巰基與貴重金屬表面形成配位鍵、氨基與羧基 之間形成酰胺鍵、或者巰基與碳碳雙鍵之間的加成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種特異性蛋白檢測(cè)芯片的制備方法，將至少一條修飾有熒光分子的單鏈DNA探針化學(xué)修飾在貴重金屬基片表面，使標(biāo)記的熒光分子的熒光被貴重金屬表面淬滅，處于熒光“關(guān)”的狀態(tài)，具體步驟為先根據(jù)特異性蛋白的種類多樣性，篩選出分別與之特異性結(jié)合的一類或多類單鏈DNA探針；再采用不同的熒光分子針對(duì)性地修飾各類單鏈DNA探針一端；最后將熒光分子修飾過(guò)的其中一類或多類單鏈DNA探針修飾固定在貴重金屬基片表面，制成特異性蛋白檢測(cè)芯片。通過(guò)單鏈DNA探針與病變的蛋白質(zhì)之間特異性的相互作用改變貴重金屬基片表面和熒光分子之間的距離，引起熒光分子熒光強(qiáng)度的顯著改變，從而實(shí)現(xiàn)利用單鏈DNA探針對(duì)特異性蛋白的高靈敏檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101666805SQ200910182190
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月15日
發(fā)明者王強(qiáng)斌 申請(qǐng)人:蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所