專利名稱：：微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于化學(xué)成分定量檢測技術(shù)范圍的一種乙醇及還原糖含量的快速檢測方法，尤其涉及是結(jié)合3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrOSaliCyliCAcid，簡稱DNS)與還原糖的顯色反映和重鉻酸鉀對還原糖及乙醇的氧化反應(yīng)而建立的一種定量快速檢測乙醇的新方法。
背景技術(shù)：
：乙醇濃度是燃料乙醇、酒類等微生物發(fā)酵中重要的過程參數(shù)，直接影響著發(fā)酵過程的優(yōu)化調(diào)控以及發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量，發(fā)酵液中乙醇含量的快速準確測定是此類研究與生產(chǎn)的前提與基礎(chǔ)。盡管目前乙醇檢測方法較多，但是由于每種方法都存在較大的局限性，很難滿足燃料乙醇、酒類發(fā)酵研究與生產(chǎn)過程中乙醇濃度檢測的需要。目前測定乙醇濃度的方法有氣相色譜法，化學(xué)方法，比重法等，氣相色譜法儀器昂貴而不適應(yīng)基層單位的普及。化學(xué)方法有曙紅內(nèi)酯吸光度法，剛果紅顯色法，重鉻酸鉀法等，此類方法是利用某種物質(zhì)(曙紅、剛果紅、重鉻酸鉀)與乙醇之間發(fā)生顏色方應(yīng)，通過測定產(chǎn)物在某特定波長下的光吸收值，利用外標法求出乙醇的濃度。這些方法僅僅適用于樣品蒸餾后乙醇的測定，而微生物發(fā)酵液中成分較為復(fù)雜，如果直接用以上方法測定，樣品中所含的其他物質(zhì)將嚴重干擾測定結(jié)^o目前國內(nèi)食品衛(wèi)生檢驗方法多采用比重法。比重法在分析時須蒸餾，而樣品蒸餾過程費時費工，需要較大的樣品體積，難以高通量檢測多個樣品。而且蒸餾過程一方面常常伴有乙醇的揮發(fā)，另一方面難以將樣品中的乙醇完全蒸餾出來，所測結(jié)果準確性較差。為了促進燃料乙醇發(fā)酵工作的研究開發(fā)，為了便于跟蹤發(fā)酵過程、評估不同發(fā)酵條件的效應(yīng)，目前迫切需要一種能夠直接從微生物發(fā)酵液中快速檢測乙醇含量的方法，并以此方法建立相應(yīng)的快速檢測試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明專利針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種直接從微生物發(fā)酵液中檢測乙醇含量的定量檢測新方法，這一方法根據(jù)重鉻酸鉀對還原糖及乙醇的都能進行氧化反應(yīng)的特點，通過DNS對還原糖的氧化反應(yīng)計算出還原糖含量，扣除其在重鉻酸鉀中的反應(yīng)信號，從而得出樣品中乙醇的含量，所以此方法也被稱之為“還原糖扣除乙醇測定法”。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明專利采用的技術(shù)方案是1.對微生物發(fā)酵液進行預(yù)處理離心去除發(fā)酵液中的不溶性物質(zhì)，然后用三氯乙酸去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，再利用十六烷基三甲基溴化胺(HexadecyltrimethylammoniumBromide，簡稱CTAB)去除發(fā)酵液中的多糖，如此處理后的樣品中所含有的主要成分為乙醇和少量還原糖。2.用3，5_二硝基水楊酸建立還原糖標準曲線并檢測樣品中的還原糖含量3，5-二硝基水楊酸和還原糖的顏色反應(yīng)可以通過讀測A550光吸收檢驗，根據(jù)還原糖在3，5_二硝基水楊酸處理下的標準曲線將樣品中的還原糖準確定量。3.用重鉻酸鉀建立還原糖標準曲線并檢測樣品重鉻酸鉀屬于強氧化劑，既可以與樣品中的還原糖又可以和其中的乙醇發(fā)生氧化反應(yīng)，其氧化產(chǎn)物可以通過讀測0D585光密度檢驗。因此可以首先通過上述(2)描述的DNS方法計算出樣品中的還原糖含量，再根據(jù)重鉻酸鉀的還原糖標準曲線，計算出樣品中還原糖在重鉻酸鉀總氧化反應(yīng)信號中所占的部分。4、用重鉻酸鉀建立乙醇標準曲線并計算樣品中乙醇含量從重鉻酸鉀總氧化反應(yīng)信號中減去還原糖與重鉻酸鉀反應(yīng)所占的部分，得出重鉻酸鉀與樣品中乙醇反應(yīng)的信號強度，根據(jù)乙醇與重鉻酸鉀反應(yīng)的標準曲線，計算出樣品中乙醇的濃度。本發(fā)明方法中所說的微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法的試劑盒，用于上述所述的應(yīng)用領(lǐng)域，包括樣品預(yù)處理所需試劑、還原糖檢測反應(yīng)試劑、重鉻酸鉀氧化反應(yīng)試劑、還原糖標準品、乙醇標準品、反應(yīng)終止液、微孔板、用法說明等。需要進步一說明的是本發(fā)明方法中所說的微生物發(fā)酵液主要是指由真菌(包括酵母)、細菌(包括運動發(fā)酵單胞菌)、真菌或細菌提取液、真菌或細菌發(fā)酵酶系統(tǒng)產(chǎn)生的任何含有乙醇的發(fā)酵液或反應(yīng)液，發(fā)酵所用的營養(yǎng)物質(zhì)主要是指農(nóng)產(chǎn)品粗加工材料，也可以是組分明確的培養(yǎng)基。本發(fā)明方法中所說的還原糖是指含有半縮醛或半縮酮結(jié)構(gòu)、能夠還原斐林試劑的糖，以葡萄糖為代表，其中所說的還原糖標準溶液通常采用葡萄糖配制，但是也可以采用其他單一的還原糖或不同還原糖的混合物配制。本發(fā)明方法中所說的檢測還原糖的方法是利用還原糖具有還原性的特點而對其進行檢測。本發(fā)明方法中所說的檢測還原糖的方法最好為DNS方法，但也可以是其他方法。本發(fā)明方法中所說的定量檢測方法，在檢測微生物乙醇發(fā)酵結(jié)果、跟蹤發(fā)酵進程、鑒定不同發(fā)酵條件的效應(yīng)等方面的應(yīng)用，應(yīng)用領(lǐng)域包括乙醇發(fā)酵原理和發(fā)酵工藝的探索、飲用乙醇類產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)、工業(yè)乙醇類產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)、燃料乙醇類產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)等。本發(fā)明專利所說的試劑盒還原糖檢測反應(yīng)試劑為3，5-二硝基水楊酸試劑。本發(fā)明方法中所說的還原糖是指含有半縮醛或半縮酮結(jié)構(gòu)、能夠還原斐林試劑的糖，以葡萄糖為代表。本發(fā)明專利公開了在微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒，不需要精密的檢測儀器，就能直接從微生物發(fā)酵液中檢測乙醇的含量，方法簡便靈敏度高、特異性好、快速簡便，高通量、尤其適用于同時檢測多個樣品。本方法除了檢測乙醇濃度，同時也連帶得到發(fā)酵液中還原糖的濃度。這一方法能夠廣泛應(yīng)用在檢測微生物乙醇發(fā)酵結(jié)果、跟蹤發(fā)酵進程、鑒定不同發(fā)酵條件的效應(yīng)等方面。根據(jù)這一方法的原理，能夠開發(fā)、生產(chǎn)、調(diào)配和包裝相應(yīng)的檢測產(chǎn)品，包括完整試劑盒和試劑盒的組成部分。圖1為DNS法制備葡萄糖標準曲線圖；圖2為重鉻酸鉀法制定葡萄糖標準曲線圖3為重鉻酸鉀法制定乙醇標準曲線圖；具體實施例方式下面以實施例具體說明本專利檢測步驟1、配制DNS和重鉻酸鉀溶液DNS溶液將6.3g的3，5_二硝基水楊酸和262mL的2molNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至lOOOmL，貯存于棕色瓶中1周后穩(wěn)定，備用。重鉻酸鉀溶液用8N的硫酸使重鉻酸鉀飽和。2、配制乙醇和葡萄糖標準樣液乙醇標準樣液將4mL無水乙醇加入96mL純凈水中配制成4%溶液，然后用純凈水將其進行2倍系列稀釋至2%、1%、0.5%、0.25%,0.125%,0.0625%,0.03125%,0.015625%,0.007813%的乙醇溶液。葡萄糖標準樣液稱取80°C烘干至恒重的分析純葡萄糖lOOmg，加入純凈水溶解定容至100mL，然后用純凈水配制成2.5%U.25%,0.625%,0.3125%,0.15625%的標準葡萄糖溶液。3、制作標準曲線(l)DNS法葡萄糖標準曲線取上述標準葡萄糖溶液每個濃度200iiL，加600iiLDNS,100°C加熱lOmin,用流水沖洗至冷卻，取200yL于96孔板中，在550nm下測0D值，以光密度值為縱坐標，葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見圖1(2)重鉻酸鉀法葡萄糖標準曲線取上述標準葡萄糖溶液每個濃度溶液60yL，加入120iiL的重鉻酸鉀溶液，室溫反應(yīng)30min后，在585nm下讀測0D值，以光密度值為縱坐標，葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見圖2。(3)重鉻酸鉀法乙醇標準曲線取上述標準乙醇溶液每個濃度60uL，加入120uL的重鉻酸鉀溶液，室溫反應(yīng)30min后，在585nm下讀測0D值，以光密度值為縱坐標，乙醇濃度(％)為橫坐標，繪制乙醇標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見圖3。4、制備微生物發(fā)酵液配制發(fā)酵培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后按照10%的接種量接種。在適宜的溫度下發(fā)酵24h以后取lmL發(fā)酵液。5、預(yù)處理發(fā)酵液樣品將lmL發(fā)酵液室溫12000rpm離心5min，取0.5mL上清液，加入等體積的20%的三氯乙酸靜置30分鐘，室溫13000r/min離心lOmin，取上清液，若上清液存在懸浮物質(zhì)，可通過細菌濾器再次過濾。然后加入200yL的CTAB溶液，65°C水浴lOmin，室溫13000r/min離心lOmin，取上清液，并將獲得的樣品稀釋10倍，然后檢測。6、DNS法測定樣品中的還原糖從處理好得樣品中取200yL經(jīng)稀釋10倍的上清液于離心管中，加入600uLDNS溶液，混勻，100°C下加熱lOmin，用流水沖洗至冷卻，取200yL于96孔板中，在550nm下測0D值。采用實際數(shù)據(jù)，計算樣品中的還原糖濃度。7、重鉻酸鉀氧化法測定樣品從處理好的樣品中取60PL經(jīng)稀釋10倍上清液于96孔板中，加入120iiL重鉻酸鉀溶液，混勻，室溫下反應(yīng)30min，在585nm下測吸光度。采用實際數(shù)據(jù)，計算樣品的重鉻酸鉀氧化反應(yīng)總體0D585數(shù)值。8、計算還原糖在發(fā)酵液重鉻酸鉀氧化反應(yīng)中所占的信號強度(0D585數(shù)值)根據(jù)重鉻酸鉀法葡萄糖標準曲線，將樣品中的還原糖濃度轉(zhuǎn)換為重鉻酸鉀氧化反應(yīng)的0D585數(shù)值。(采用實際數(shù)據(jù)，計算樣品中還原糖的重鉻酸鉀0D585數(shù)值)9、計算樣品中的乙醇濃度用樣品的重鉻酸鉀氧化反應(yīng)總體0D585數(shù)值減去樣品中還原糖的重鉻酸鉀0D585數(shù)值，得出樣品中乙醇的重鉻酸鉀0D585數(shù)值。然后根據(jù)重鉻酸鉀法乙醇標準曲線，計算得出樣品中的乙醇濃度。10、驗證本方法結(jié)果通過蒸餾法或其他方面檢測該樣品中乙醇的含量，比較結(jié)果。為了驗證本檢測方法的準確性，我們將甘薯乙醇發(fā)酵的發(fā)酵液按照本專利的方法進行預(yù)處理，(標記為0號)。取0號液體2mL加入不同體積的無水乙醇，獲得13個不同乙醇濃度的樣品(標記為1-13)，然后使用本方法檢測其中的乙醇濃度，結(jié)果見表1，由表可知RSSEA法用于檢測發(fā)酵液中的乙醇濃度準確可靠。表1乙醇測量值與真實值的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明專利的實施過程是對傳統(tǒng)的DNS檢測還原糖方法、重鉻酸鉀檢測還原糖方法、重鉻酸鉀檢測乙醇方法進行了技術(shù)改進，使其具有使用樣品量少、一次測定樣品數(shù)多、測量準確快速等優(yōu)點。權(quán)利要求微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒，其特征在于所述的檢測方法為(1)對微生物發(fā)酵液進行預(yù)處理離心去除發(fā)酵液中的不溶性物質(zhì)，然后用三氯乙酸去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，再利用十六烷基三甲基溴化胺去除發(fā)酵液中的多糖，如此處理后的樣品中所含有的主要成分為乙醇和少量還原糖。(2)用3，5-二硝基水楊酸建立還原糖標準曲線并檢測樣品中的還原糖含量3，5-二硝基水楊酸和還原糖的顏色反應(yīng)可以通過讀測A550光吸收檢驗，根據(jù)還原糖在3，5-二硝基水楊酸處理下的標準曲線將樣品中的還原糖準確定量。(3)用重鉻酸鉀建立還原糖標準曲線并檢測樣品利用樣品中還原糖含量，根據(jù)重鉻酸鉀還原糖標準曲線，計算出樣品中還原糖在重鉻酸鉀總氧化反應(yīng)信號中所占的部分。(4)用重鉻酸鉀建立乙醇標準曲線并計算樣品中乙醇含量從重鉻酸鉀總氧化反應(yīng)信號中減去還原糖與重鉻酸鉀反應(yīng)所占的部分，得出重鉻酸鉀與樣品中乙醇反應(yīng)的信號強度，根據(jù)乙醇與重鉻酸鉀反應(yīng)的標準曲線，計算出樣品中乙醇的濃度。本發(fā)明專利試劑盒試劑包括樣品預(yù)處理所需試劑、還原糖檢測反應(yīng)試劑、重鉻酸鉀氧化反應(yīng)試劑、還原糖標準品、乙醇標準品、反應(yīng)終止液、微孔板。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒，其特征在于所述的微生物發(fā)酵液主要是指由真菌、細菌、真菌或細菌提取液、真菌或細菌發(fā)酵酶系統(tǒng)產(chǎn)生的任何含有乙醇的發(fā)酵液或反應(yīng)液，發(fā)酵所用的營養(yǎng)物質(zhì)主要是指農(nóng)產(chǎn)品粗加工材料，也可以是組分明確的培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒，其特征在于所述的還原糖是指含有半縮醛或半縮酮結(jié)構(gòu)、能夠還原斐林試劑的糖，以葡萄糖為代表，其中所說的還原糖標準溶液通常采用葡萄糖配制，但是也可以采用其他單一的還原糖或不同還原糖的混合物配制。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒，其特征在于所述的檢測還原糖的方法為3，5-二硝基水楊酸方法。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還原糖檢測反應(yīng)試劑為3，5-二硝基水楊酸試劑。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵液中乙醇含量的快速檢測方法及試劑盒，其特征在于所述的還原糖是指含有半縮醛或半縮酮結(jié)構(gòu)、能夠還原斐林試劑的糖，以葡萄糖為代表。全文摘要本發(fā)明公開了屬于化學(xué)成分定量檢測技術(shù)范圍的一種乙醇及還原糖含量的快速檢測方法，其步驟包括對微生物發(fā)酵液進行預(yù)處理，用DNS建立還原糖標準曲線并檢測樣品中的還原糖含量，用重鉻酸鉀建立還原糖標準曲線并檢測樣品，用重鉻酸鉀建立乙醇標準曲線并計算樣品中乙醇含量，本發(fā)明不需要精密的檢測儀器，就能直接從微生物發(fā)酵液中檢測乙醇的含量，具有精確度高、操作快速簡便、需用的樣品量及試劑量少、成本低、需用的儀器設(shè)備少、對環(huán)境的要求低，檢測過程不產(chǎn)生污染，一次檢測的樣品數(shù)多等優(yōu)點。文檔編號G01N21/78GK101825576SQ20091022588公開日2010年9月8日申請日期2009年11月30日優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日發(fā)明者丁鐵林,孫東旭,張鵬,陳才法申請人:無錫靈特生物技術(shù)有限責(zé)任公司