血糖儀在快速檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)血糖儀在快速檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性中的應(yīng)用，其檢測(cè)方法包括如下步驟：1)制備微生物菌液；2)將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養(yǎng)基和待測(cè)樣本混合并孵育；3)用血糖儀檢測(cè)待測(cè)樣本中葡萄糖的濃度；4)評(píng)價(jià)待測(cè)樣本的生物毒性。血糖儀用于樣品中葡萄糖濃度檢測(cè)時(shí)具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低廉、便于操作等特點(diǎn)。因而血糖儀結(jié)合微生物用于樣本生物毒性的檢測(cè)，具有省時(shí)，經(jīng)濟(jì)，易于操作的特點(diǎn)，且為生物毒性檢測(cè)的提供了新的途徑，同時(shí)還為污水和污染土壤的治理方案確定提供依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
血糖儀在快速檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及急性生物毒性檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及基于微生物對(duì)葡萄糖消耗的程 度，利用血糖儀快速檢測(cè)環(huán)境污染物的生物毒性。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著環(huán)境污染問(wèn)題的日漸突出，生物毒性檢測(cè)，尤其是生物毒性的快速檢測(cè)，其重 要性愈發(fā)凸顯。傳統(tǒng)上用魚(yú)和水蚤來(lái)檢測(cè)生物毒性，但往往響應(yīng)慢、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高。微生 物繁殖速度快，價(jià)格低廉，是檢測(cè)生物毒性的理想材料。
[0003] 目前利用微生物檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性的方法可分為兩大類(lèi)：比色法和電化學(xué) 法。
[0004] 顧名思義，比色法根據(jù)色度的深淺判斷生物毒性的相對(duì)大小，最成功的范例是 Microtox?.和 Toxi-Chromo test?。Microtox'利用的是費(fèi)希爾弧菌（Vibrio fischeri)。 費(fèi)希爾弧菌是發(fā)光細(xì)菌的一種，主要生存在海水環(huán)境中，能天然發(fā)出熒光。當(dāng)有毒物質(zhì)存在 時(shí)，其所發(fā)出的熒光的強(qiáng)度減弱，因而根據(jù)熒光的強(qiáng)弱即可判斷出某一物質(zhì)毒性的相對(duì)大 小。Toxi-Chromo_test?_;利用誘導(dǎo)過(guò)的大腸桿菌。誘導(dǎo)過(guò)的大腸桿菌能表達(dá)半乳糖苷 酶，該酶對(duì)重金屬離子有較高的敏感度，并且能水解特定的底物進(jìn)而產(chǎn)生顏色。當(dāng)有毒物質(zhì) 存在時(shí)，0 _半乳糖苷酶被抑制，從而被水解的底物量減少，形成的顏色較淺，根據(jù)顏色的深 淺即可判斷出某一物質(zhì)生物毒性的相對(duì)大小。盡管MicrotOX?和Toxi-Chromo test?.均 已商業(yè)化，但仍然只存在很大的限制：首先，需要專(zhuān)門(mén)的分光光度計(jì)，成本高，不利于廣泛應(yīng) 用；其次，費(fèi)希爾弧菌菌種稀有，價(jià)格昂貴。大腸桿菌的誘導(dǎo)過(guò)程復(fù)雜，對(duì)操作人員也存在潛 在的安全風(fēng)險(xiǎn)。
[0005] 電化學(xué)法主要利用苯醌、鐵氰化鉀等電子介體。電子介體能參與微生物的呼吸作 用被還原，還原態(tài)的電子介體在電極表面氧化產(chǎn)生氧化電流。有毒物質(zhì)的存在會(huì)抑制微生 物的呼吸作用，從而被還原的電子介體量減少，導(dǎo)致最終的氧化電流降低。因此，根據(jù)氧化 電流的大小可以判斷某一物質(zhì)生物毒性的相對(duì)大小。但電化學(xué)方法需要電化學(xué)工作站等專(zhuān) 業(yè)儀器，價(jià)格昂貴。同時(shí)，電化學(xué)法要求操作人員對(duì)電化學(xué)知識(shí)有一定的了解，并且對(duì)電化 學(xué)工作站有較高的熟練度。這些都限制了電化學(xué)方法的應(yīng)用和推廣。
[0006] 因此，需要提供一種成本低廉，易于操作的檢測(cè)環(huán)境污染物急性生物毒性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種血糖儀在快速檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性中的應(yīng)用。
[0008] 優(yōu)選地，血糖儀為便攜式血糖儀，更優(yōu)選為商業(yè)化的便攜式血糖儀。
[0009] 血糖儀在檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性中的應(yīng)用，其檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0010] 1)制備微生物菌液；
[0011] 2)將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養(yǎng)基和待測(cè)樣本混合并孵育；
[0012] 3)用血糖儀檢測(cè)待測(cè)樣本中葡萄糖的濃度；
[0013] 4)評(píng)價(jià)待測(cè)樣本的生物毒性。
[0014] 所述微生物為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌或真菌；其中所述革蘭氏陰性菌為大 腸桿菌、嗜冷桿菌、亞硝化單胞菌，優(yōu)選為大腸桿菌；所述革蘭氏陽(yáng)性菌為枯草芽孢桿菌、變 形桿菌、放線菌，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌；所述真菌為酵母菌、白色念珠菌、白色隱形菌，優(yōu)選 為酵母菌。
[0015] 其中制備微生物菌液的方法包括：
[0016] 1)將微生物接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
[0017] 2)收集菌體，獲得菌體沉淀；
[0018] 3)洗滌菌體沉淀；
[0019] 4)用分散液分散菌體沉淀。
[0020] 上述方法中，培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域所公知的適于微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基， 例如大腸桿菌接種的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基、S0B培養(yǎng)基或S0C培養(yǎng)基等，優(yōu)選LB培養(yǎng)基；所述 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LBG培養(yǎng)基，優(yōu)選為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基； 所述酵母菌的培養(yǎng)基為YH)培養(yǎng)基、YPED培養(yǎng)基、YPEG培養(yǎng)基等，優(yōu)選YH)培養(yǎng)基。
[0021] 進(jìn)一步地，培養(yǎng)微生物的條件也是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，大腸桿菌的培養(yǎng) 條件為37°C于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h ;枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件為37°C于牛肉膏蛋白胨培 養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)；酵母菌的培養(yǎng)條件為30°C于YH)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)。
[0022] 在上述方法中，優(yōu)選地，用離心法收集培養(yǎng)的菌體，以獲得菌體沉淀。
[0023] 菌體沉淀的洗滌溶液可采用常規(guī)的緩沖液，以去除菌體培養(yǎng)中可能影響后續(xù)測(cè)試 結(jié)果的物質(zhì)。如磷酸緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、HEPEs緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液或氯化鈉 溶液。優(yōu)選地，所述洗滌溶液為〇. 85%的氯化鈉溶液、PBS溶液、TBS溶液或TBE溶液。
[0024] 優(yōu)選地，所述分散液為水溶液、氯化鈉溶液或培養(yǎng)基，優(yōu)選為水溶液。
[0025] 葡萄糖是大部分微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有毒物質(zhì)的存在會(huì)抑制微生物的 生長(zhǎng)和繁殖，使得微生物對(duì)葡萄糖的消耗量降低。因此，根據(jù)葡萄糖消耗量的多少，即可判 斷出某一物質(zhì)毒性的相對(duì)大小。血糖儀是目前已大規(guī)模生產(chǎn)推廣的專(zhuān)門(mén)用于人體血液中葡 萄糖含量的便攜式設(shè)備，能夠快速的檢測(cè)血液中葡萄糖的濃度，因而我們提出利用血糖儀 檢測(cè)待測(cè)樣品中的葡萄糖濃度，優(yōu)選地用商業(yè)化的血糖儀檢測(cè)污染物對(duì)菌體的生物毒性。
[0026] 優(yōu)選地，用抑制率評(píng)價(jià)待測(cè)樣本中生物毒性，抑制率的計(jì)算公式如下所示：抑制率 (% ) = (Nc-Ne)/NcX100%
[0027] 其中Ne為第一待測(cè)樣本的葡萄糖濃度，Ne為第二待測(cè)樣本的葡萄糖濃度。
[0028] 第一待測(cè)樣本和第二待測(cè)樣本的孵育時(shí)間與孵育溫度相同。優(yōu)選地，檢測(cè)環(huán)境污 染物生物毒性的方法所用的微生物為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌時(shí)，孵育溫度為37°C ;優(yōu)選 地，檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性的方法所用的微生物為真菌時(shí)，孵育溫度為30°C。
[0029] 優(yōu)選地孵育時(shí)間為30-90分鐘。優(yōu)選地，微生物為大腸桿菌時(shí)，孵育時(shí)間為60分 鐘；優(yōu)選地，微生物為枯草芽孢桿菌時(shí)，孵育時(shí)間為30-90分鐘；優(yōu)選地，微生物為真菌時(shí)， 孵育時(shí)間為30-90分鐘。
[0030] 當(dāng)?shù)谝淮郎y(cè)樣本和第二待測(cè)樣本為不同的環(huán)境污染物樣本時(shí)，抑制率表示環(huán)境污 染物間生物毒性的相對(duì)大小。
[0031] 第一待測(cè)樣本可為對(duì)照樣本，所述對(duì)照樣本是指將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養(yǎng) 基和對(duì)照溶液混合并孵育，其中對(duì)照溶液為水溶液、培養(yǎng)基、氯化鈉溶液，優(yōu)選為水溶液。此 時(shí)抑制率表示的是第二待測(cè)樣本相對(duì)于對(duì)照樣本的生物毒性的大小。
[0032] 另外本方法也可用于檢測(cè)不同物質(zhì)的生物毒性，可將待測(cè)物質(zhì)配置成不同濃度 的待測(cè)樣本，檢測(cè)不同待測(cè)樣本的葡萄糖濃度，并計(jì)算每個(gè)樣本的抑制率，繪制葡萄糖 濃度-抑制率的曲線，根據(jù)抑制率曲線，可以算出最大半數(shù)抑制濃度IC 5。(maximum half inhibition concentration)，即當(dāng)抑制率為50 %時(shí)物質(zhì)的濃度。IC5。是評(píng)價(jià)某一物質(zhì)生物 毒性大小的重要指標(biāo)。
[0033] 所述環(huán)境污染物為有機(jī)污染物、無(wú)機(jī)污染物或二者的混合物；優(yōu)選地，所述無(wú)機(jī)污 染物是可溶于水的無(wú)機(jī)化合物，如重金屬鹽、無(wú)機(jī)酸、無(wú)機(jī)堿等有毒物質(zhì)；優(yōu)選地，所述有機(jī) 污染物是難溶于水的有機(jī)化合物，如苯、苯酚、鄰苯基苯酚、二氯苯酚等。
[0034] 另外，本發(fā)明還可用于被治理污水的生物毒性的檢測(cè)，污水中含有多種生物毒性 物質(zhì)，如重金屬、有機(jī)污染物等。現(xiàn)在污水的治理包括用水生動(dòng)物來(lái)改善水質(zhì)，但是當(dāng)污水 的生物毒性高時(shí)，投放水生動(dòng)物無(wú)法存活，不但不能凈化污水還會(huì)造成經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)，因而 當(dāng)污水的生物毒性達(dá)到合理的范圍時(shí)，投放水生動(dòng)物才能達(dá)到進(jìn)一步改善水質(zhì)的目的。本 發(fā)明的方法能夠非常方便快捷的檢測(cè)污水的生物毒性，為污水治理方案的確定提供支持。
[0035] 不僅如此，本發(fā)明還可用于被污染土壤的生物毒性的檢測(cè)。受污染土壤中含有多 種生物毒性物質(zhì)，如重金屬離子、有機(jī)污染物等。目前土壤修復(fù)包括植物吸附、微生物修復(fù)、 生物聯(lián)合修復(fù)等方法。但這些方法只能在量上告知土壤中污染物的含量修復(fù)到了何種程 度，而不能告訴人們土壤修復(fù)到不同程度時(shí)所對(duì)應(yīng)的毒性。因此，通過(guò)土壤的生物毒性，能 進(jìn)一步指導(dǎo)土壤的修復(fù)工作，將土壤的修復(fù)程度及其對(duì)生物的影響結(jié)合起來(lái)，為土壤修復(fù) 提供更多的參考信息。
[0036] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0037] 本發(fā)明利用了目前已商業(yè)化使用的血糖儀對(duì)樣品中葡萄糖的含量進(jìn)行檢測(cè)。血糖 儀用于樣品中葡萄糖濃度檢測(cè)時(shí)具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低廉、便于操作等特點(diǎn)。因而血糖儀 結(jié)合微生物用于樣本生物毒性的檢測(cè)，具有省時(shí)，經(jīng)濟(jì)，易于操作的特點(diǎn)，且為生物毒性檢 測(cè)的提供了新的途徑，同時(shí)還為污水的治理方案確定提供依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0039] 圖1示出實(shí)施例1中基于微生物和商業(yè)化便攜式血糖儀檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性 的可行性驗(yàn)證。
[0040] 圖2示出實(shí)施例2中檢測(cè)不同濃度Cd2+對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0041] 圖3示出實(shí)施例3中檢測(cè)不同濃度As2+對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0042] 圖4示出實(shí)施例4中檢測(cè)不同濃度Pb2+對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0043] 圖5示出實(shí)施例5五中檢測(cè)不同濃度3, 5-二氯苯酚對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制 率曲線。
[0044] 圖6示出實(shí)施例6中檢測(cè)不同濃度鄰苯基苯酚對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制率曲 線。
[0045] 圖7示出實(shí)施例7中檢測(cè)不同濃度苯酚對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0046] 圖8示出實(shí)施例8中檢測(cè)不同濃度Cd2+對(duì)枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0047] 圖9示出實(shí)施例9中檢測(cè)不同濃度Pb2+對(duì)枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0048] 圖10示出實(shí)施例10中檢測(cè)不同濃度苯酚對(duì)枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制率曲 線。
[0049] 圖11示出實(shí)施例11中檢測(cè)不同濃度鄰苯基苯酚對(duì)枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制 率曲線。
[0050] 圖12示出實(shí)施例12中檢測(cè)不同濃度3, 5-二氯苯酚對(duì)酵母菌生物毒性的抑制率 曲線
[0051] 圖13示出實(shí)施例13中檢測(cè)不同濃度鄰苯基苯酚對(duì)酵母菌生物毒性的抑制率曲線
[0052] 圖14示出實(shí)施例14中檢測(cè)不同污水樣本對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制率
[0053] 圖15示出實(shí)施例15中檢測(cè)不同土壤樣本對(duì)大腸桿菌生物毒性的抑制率
【具體實(shí)施方式】
[0054] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō) 明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具 體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0055] 實(shí)施例1 :大腸桿菌與血糖儀檢測(cè)Cu2+的生物毒性
[0056] 大腸桿菌（ATCC 25922)在37°C于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，其中LB培養(yǎng)基的配 置方法如下：取0. 5g牛肉膏、lg蛋白胨和0. 5g氯化鈉溶于100mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至 7. 0-7. 4,于高壓蒸汽滅菌中120°C滅菌20min，自然冷卻。
[0057] 離心收集大腸桿菌，6000轉(zhuǎn)/分離心6min收集菌體；洗滌收集的大腸桿菌，用 0. 85%氯化鈉溶液將菌體重懸進(jìn)行清洗，再以5000轉(zhuǎn)/分離心5min收集菌體，重復(fù)一次 上述的清洗操作；最后將清洗后得到菌體分散于〇. 85%氯化鈉溶液中，得到濃度為0D_ = 2. 5的菌液。
[0058] 取5個(gè)體積為1. 5ml的離心管，分別編號(hào)為1、2、3、4、5。其中1作為對(duì)照樣本（即 不加任何毒物，但加入與有毒物質(zhì)相同體積的氯化鈉溶液），其余均為測(cè)試管。依次向各管 中加入100 y L的LB培養(yǎng)基，10 y L葡萄糖溶液（2% w/V)，80 y L濃度為0D6M= 2. 5大腸桿 菌菌液和10 y L不同濃度的Cu2+溶液。使各離心管中Cu 2+的終濃度依次為0、2、4、6、8mg/ L。將各離心管置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中60分鐘，然后用商業(yè)化便攜式血糖儀檢測(cè)各離心管 中葡萄糖的濃度。根據(jù)濃度的差異，即可算出不同濃度的Cu 2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑制 率，進(jìn)而得知Cu2+生物毒性的相對(duì)大小。
[0059] 實(shí)施例1的結(jié)果顯示，隨著銅離子濃度的增大，樣品中葡萄糖濃度也逐步升高，表 明Cu 2+對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖存在抑制作用，使得其對(duì)葡萄糖的消耗量降低，即抑制率在 升高。這也表明基于微生物和商業(yè)化便攜式血糖儀檢測(cè)環(huán)境污染物的生物毒性是可行的。
[0060] 實(shí)施例2 :大腸桿菌與血糖儀檢測(cè)Cd2+的生物毒性
[0061] 按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)Cd2+對(duì)大腸桿菌的生物毒性。Cd2+終濃度分別為0、5、10、 15、20、25mg/L時(shí)造成的抑制率分別為0、18%、35%、53%、59%、65%，并算得0(1 2+的1(：5。為 14.2mg/L〇
[0062] 實(shí)施例3 :大腸桿菌與血糖儀檢測(cè)As2+的生物毒性
[0063] 按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)As2+對(duì)大腸桿菌的生物毒性。As 2+終濃度分別為0、1、2、 3、4、5、6、7mg/L 時(shí)造成的抑制率分別為 0、10%、15%、30%、40%、50%、60%、83%，并算得 As2+的 1C 5。為 5mg/L。
[0064] 實(shí)施例4 :大腸桿菌與血糖儀檢測(cè)Pb2+的生物毒性
[0065] 按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)Pb2+對(duì)大腸桿菌的生物毒性。Pb 2+終濃度分別為0、 25、50、75、100、125、150、175mg/L 時(shí)造成的抑制率分別為 0、16%，21%、27%、37%、42%、 53%、68%，并算得？132+的1(：5。為14311^/1。
[0066] 實(shí)施例5 :大腸桿菌與血糖儀檢測(cè)3, 5-對(duì)氯苯酚的生物毒性
[0067] 按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)3, 5-對(duì)氯苯酸對(duì)大腸桿菌的生物毒性。3, 5-對(duì)氯苯酸 終濃度為〇、5、10、15、20mg/L時(shí)造成的抑制率分別為0、13. 7%、36.4%、59%、72. 7%，可算 得3, 5-對(duì)氯苯酚的IC5。為13mg/L。
[0068] 實(shí)施例6 :大腸桿菌與血糖儀檢測(cè)鄰苯基苯酚的生物毒性
[0069] 按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)鄰苯基苯酸對(duì)大腸桿菌的生物毒性。鄰苯基苯酸終 濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45mg/L時(shí)造成的抑制率分別為0、5. 9%、12%、 17. 6%、23. 5%、30%、41. 2%、52. 9%、71%、82%，并算得鄰苯基苯酚的1(：5。為33.711^/1。
[0070] 實(shí)施例7 :大腸桿菌與血糖儀檢測(cè)苯酚的生物毒性
[0071] 按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)苯酚對(duì)大腸桿菌的生物毒性。苯酚終濃度分別為0、 10、20、40、60、80、120mg/L 時(shí)造成的抑制率分別為 0、4. 2%、16. 7%、33. 3%、41. 7%、50%、 62. 5 %、75 %，并算得苯酚的IC5。為80mg/L。
[0072] 實(shí)施例8 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測(cè)Cd2+的生物毒性
[0073] 枯草芽孢桿菌（CGMCC 1. 1086)在37°C于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)， 其中枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基的配置方法如下：取lg蛋白胨、〇. 3g牛肉膏和0. 5g氯化鈉溶于 100ml去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 4,于高壓蒸汽滅菌中120°C滅菌20min，自然冷卻。
[0074] 離心收集枯草芽孢桿菌，6000轉(zhuǎn)/分離心6min收集菌體；洗滌收集的枯草芽孢桿 菌，用PBS溶液將菌體重懸進(jìn)行清洗，再以5000轉(zhuǎn)/分離心5min收集菌體，重復(fù)一次上述 的清洗操作；最后將清洗后得到菌體分散于〇. 85%氯化鈉溶液中，得到濃度為0D_= 2. 5 的菌液。
[0075] 檢測(cè)Cd2+對(duì)枯草芽孢桿菌的生物毒性。取7個(gè)體積為1. 5mL的離心管，分別編號(hào) 為1、2、3、4、5、6、7,其中1作為對(duì)照樣本（即不加任何毒物，，但加入與有毒物質(zhì)相同體積的 水），其余均為測(cè)試組。依次向各個(gè)離心管中加入100 y L的培養(yǎng)液，10 y L葡萄糖溶液（2% W/V)，80 y L濃度為0D_= 2. 5的枯草芽孢桿菌菌液和10 y L不同濃度的Cd 2+溶液。使最 終各離心管中Cd2+的終濃度依次為0、5、10、15、20、25、30mg/L。將各離心管置于37°C恒溫 培養(yǎng)箱中60分鐘，然后用商業(yè)化便攜式血糖儀檢測(cè)各離心管中葡萄糖的濃度，根據(jù)濃度的 差異，即可算出不同濃度的Cd 2+對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑制率，上述不同的Cd2+算得的抑制 率分別為 〇、9. 3%、10%、14%、16. 3%、18. 6%、21%。
[0076] 實(shí)施例9 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測(cè)Pb2+的生物毒性
[0077] 按照實(shí)施例8的方法檢測(cè)Pb2+對(duì)枯草芽孢桿菌的生物毒性。Pb 2+的終濃度分別 為0、30、60、90、120、150、18011^/1時(shí)造成的抑制率分別為0、11.6%、14%、25.6%、34.9%、 48. 9 %、53. 5 %，并算得 Pb2+的 1C 5。為 157mg/L。
[0078] 實(shí)施例10 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測(cè)苯酚的生物毒性
[0079] 按照實(shí)施例8的方法檢測(cè)苯酚對(duì)枯草芽孢桿菌的生物毒性。苯酚的終濃度分別 為0、10、20、40、60、80、100、12011^/1時(shí)造成的抑制率分別為0,6.4%、8.5%、12.8%、17%、 19. 1%、20%、21. 3%〇
[0080] 實(shí)施例11 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測(cè)鄰苯基苯酚的生物毒性
[0081] 按照實(shí)施例8的方法檢測(cè)鄰苯基苯酚對(duì)枯草芽孢桿菌的生物毒性。鄰苯基苯酚 的終濃度分別為0、10、20、30、40、50、60mg/L時(shí)造成的抑制率分別為0、10.6%、15%、17%、 19. 1%、21. 3%、23. 4%〇
[0082] 實(shí)施例12 :酵母與血糖儀檢測(cè)3, 5-二氯苯酚的生物毒性
[0083] 酵母（S288C)在30°C于YH)培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，其中YH)培養(yǎng)基的配置方法 如下：分別將含2%葡萄糖溶液和含1 %酵母提取物溶液于高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌 20min，自然冷卻，然后將二者在無(wú)菌條件下混合。
[0084] 離心收集酵母，6000轉(zhuǎn)/分離心6min收集菌體；洗滌收集的酵母菌，用TBS溶液 將菌體重懸進(jìn)行清洗，再以5000轉(zhuǎn)/分離心5min收集菌體，重復(fù)一次上述的清洗操作；最 后將清洗后得到菌體分散于〇. 85%氯化鈉溶液中，得到濃度為0D_= 2. 5的菌液。
[0085] 檢測(cè)3, 5-二氯苯酚對(duì)酵母菌的生物毒性。取7個(gè)體積為1. 5mL的離心管，分別編 號(hào)為1、2、3、4、5。其中1作為對(duì)照樣本（即不加任何毒物，但加入與有毒物質(zhì)相同體積的 水），其余均為測(cè)試管。依次向各個(gè)離心管中加入100 yL的培養(yǎng)液，10 yL葡萄糖溶液（2% W/V)，80 y L濃度為0D_= 2. 5的酵母菌菌液和10 y L不同濃度的3, 5-二氯苯酚溶液。使 各離心管中3, 5-二氯苯酸的最終濃度依次為0、5、10、15、20mg/L。將各離心管置于30°C 恒溫培養(yǎng)箱中16小時(shí)，上述不同3, 5-二氯苯酚的濃度造成的抑制率分別為0、26%、39%、 52 %、78 %，并算得 3, 5-二氯苯酚的 IC5。為 14. 2mg/L。
[0086] 實(shí)施例13 :酵母與血糖儀檢測(cè)鄰苯基苯酚的生物毒性
[0087] 按照實(shí)施例12的方法檢測(cè)鄰苯基苯酸對(duì)酵母菌的生物毒性。鄰苯基苯酸的濃度 分別為 〇、10、20、30、40、50、60mg/L 時(shí)造成的抑制率分別為 0、17. 4 %、26 %、30 %、39. 1 %、 43. 5 %、52. 1 %，并可算得鄰苯基苯酚的IC5。為57. 6mg/L。
[0088] 由上述實(shí)施例可見(jiàn)，大腸桿菌、枯草桿菌和酵母可與血糖儀聯(lián)用來(lái)檢測(cè)重金屬和 有機(jī)化合物的生物毒性。
[0089] 實(shí)施例14 :環(huán)境污染物的檢測(cè)（污水）
[0090] 大腸桿菌的菌液制備如實(shí)施例1。
[0091] 從垃圾填埋場(chǎng)、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室無(wú)機(jī)廢液桶、電鍍廠分別取得污水10mL。取6個(gè)樣品 管，分別標(biāo)記為1、2、3、4，1號(hào)為對(duì)照管，2-4號(hào)管為污水待測(cè)樣本管，依次向各管中加入 100 y L的LB培養(yǎng)基，10 y L葡萄糖溶液（2% w/V)，80 y L濃度為0D600 = 2. 5的大腸桿菌 菌液，在1號(hào)管中加入10 y L蒸餾水，在2-4號(hào)管中依次加入10 y L從垃圾填埋場(chǎng)、化學(xué)實(shí) 驗(yàn)室無(wú)機(jī)廢液桶、電鍍廠取得的污水。將各離心管置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中60分鐘，然后用 商業(yè)化便攜式血糖儀檢測(cè)各離心管中葡萄糖的濃度。根據(jù)濃度的差異，即可算出不同污水 樣本對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑制率，分別為20%、32%和60%，進(jìn)而得知不同污水樣本的 生物毒性，同時(shí)通過(guò)對(duì)比不同污水樣本中葡萄糖濃度，可以比較不同污水樣本生物毒性的 尚低。
[0092] 實(shí)施例15 :環(huán)境污染物的檢測(cè)
[0093] 大腸桿菌的菌液制備如實(shí)施例1。
[0094] 從北京北四環(huán)某加油站、北京某試驗(yàn)田、海南某礦區(qū)附近分別取得污染土壤 5g(分別編號(hào)為樣品1、樣品2、樣品3)，將其分別加入1、2、3號(hào)10ml的容量瓶，加入蒸 餾水定容至l〇ml，顛倒混勻以充分溶解土壤中的污染物質(zhì)；然后將溶液轉(zhuǎn)移至離心管， 12000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，作為污染土壤待測(cè)樣本。取1、2、3、4個(gè) 樣品管，依次向各管中加入100 y L的LB培養(yǎng)基，10 y L葡萄糖溶液（2% w/V)，80 y L濃度 為0D600 = 2. 5的大腸桿菌菌液，在1號(hào)管中加入10 y L蒸餾水，在2-4號(hào)管中依次加入取 自北京北四環(huán)某加油站、北京某試驗(yàn)田、海南某礦區(qū)附近的污染土壤待測(cè)樣本l〇yL。將各 離心管置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中60分鐘，然后用商業(yè)化便攜式血糖儀檢測(cè)各離心管中葡萄 糖的濃度。根據(jù)濃度的差異，即可算出該三種不同污染土壤樣本對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的抑 制率，分別為23. 8%、4. 8%、16. 7%，進(jìn)而得知不同污染土壤樣本的生物毒性，同時(shí)通過(guò)對(duì) 比不同土壤樣本中葡萄糖濃度，可以比較不同污染土壤樣本生物毒性的高低。
[0095] 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì) 本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可 以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā) 明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 血糖儀在快速檢測(cè)環(huán)境污染物生物毒性中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測(cè)方法如下： 1) 制備微生物菌液； 2) 將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養(yǎng)基和待測(cè)樣本混合并孵育30-60min ; 3) 用市售的便攜式血糖儀檢測(cè)待測(cè)樣本中葡萄糖的濃度； 4) 評(píng)價(jià)待測(cè)樣本的生物毒性。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制備微生物菌液的方法包括： 1) 將微生物接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 2) 收集菌體，獲得菌體沉淀； 3) 洗滌菌體沉淀； 4) 用分散液分散菌體沉淀，制成微生物菌液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述微生物為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性 菌或真菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌、嗜冷桿菌 或亞硝化單胞菌，優(yōu)選為大腸桿菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陽(yáng)性菌為枯草芽孢桿菌、變形 桿菌或放線菌，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述真菌為酵母菌、白色念珠菌或白色隱 形菌，優(yōu)選為酵母菌。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中洗滌菌體沉淀的溶液為0. 85% 的氯化鈉溶液、PBS溶液、TBS溶液或TBE溶液。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟4)中用抑制率評(píng)價(jià)待測(cè)樣本的生物 毒性，所述抑制率的計(jì)算公式為抑制率（％ ) = (Nc-Ne)/NcX100% 其中Ne為第一待測(cè)樣本的葡萄糖濃度，Ne為對(duì)第二待測(cè)樣本的葡萄糖濃度。10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，于步驟4)中分散液為水溶液、培養(yǎng)基或 氯化鈉溶液。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK105821111SQ201510012584
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月9日
【發(fā)明人】只金芳, 方德煜, 高冠岳
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所