專利名稱：一種檢測Legumain蛋白判斷卵巢癌預(yù)后的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種醫(yī)學(xué)診斷用的方法，具體的說是一種檢測卵巢癌組織中Legumain 蛋白來判斷卵巢癌是良性還是惡性以及預(yù)后的方法，該方法是通過免疫檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)的， 屬于臨床免疫診斷方法，特別是運(yùn)用免疫組化方法檢測Legumain蛋白從而判斷卵巢癌是 良性還是惡性以及預(yù)后的方法。
背景技術(shù)：
卵巢癌是威脅婦女健康的重要惡性腫瘤疾病，其早期無典型癥狀及體征，目前臨 床如遇可疑情況都可借助于現(xiàn)代影像學(xué)檢查和廣義的腫瘤標(biāo)記物檢查及早作出診斷。在卵 巢腫瘤中惡性卵巢腫瘤占25%，對其惡性程度的快速診斷可以對治療產(chǎn)生積極的作用。
Legumain是一絲氨酸蛋白酶，是asparaginyl endop印tidase家族中的成員之 一。它首先被證明在植物的種子芽苞形成中起著重要作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)它也存在于寄生蟲 和哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)。然而近來我們發(fā)現(xiàn)Legumain在處于缺氧(Hypoxia)應(yīng)激狀態(tài)下極 高的表達(dá)于腫瘤組織中，而在相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)極低或不表達(dá)。進(jìn)一步我們還發(fā)現(xiàn) 在腫瘤組織中，表達(dá)Legumain的TAMs在腫瘤新生血管細(xì)胞上高度表達(dá)，而非在培養(yǎng)的腫瘤 細(xì)胞系中表達(dá)。而更為重要的是Legumain過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移情況高度相 關(guān)。通過對120例病例的臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)，Legumain表達(dá)的高低與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)， 即表達(dá)越高，惡性程度越強(qiáng)，預(yù)后越差(見表1)。
表lLegumain在卵巢腫瘤組織中表達(dá)情況的分析
組別總例數(shù)陰性弱陽性強(qiáng)陽性p值
正常組201190
良性組207130<0.001
交界組202135
惡性組6002337 惡性組VS交界組(x 2 = 12. 212， p < 0. 05);惡性組VS良性腫瘤組(x 2 = 35. 704， p<0.01);惡性組VS正常組(x 2 = 45.500， p < 0.01);交界組VS良性腫瘤組高于良性 腫瘤組(x2 = 7.778， p < 0.05);交界組VS正常組(x 2 = 11. 958， p < 0. 05);良性腫瘤 組VS正常組(x2 = 10616， p > 0. 05)。結(jié)果表明Legumain隨著卵巢腫瘤轉(zhuǎn)向惡性，表達(dá) 量明顯增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明通過免疫組化的方法檢測病理組織中的Legumain分子， 以此判斷卵巢癌的預(yù)后。具體的講就是，通過對病理組織的免疫組化反應(yīng)，檢測該組織中 Legumain分子的表達(dá)數(shù)量，根據(jù)免疫組化反應(yīng)的結(jié)果來判斷卵巢癌的預(yù)后。
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其技術(shù)內(nèi)容包括免疫組化反應(yīng)和顯微鏡觀察等步驟。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 1.脫蠟和水化 具體步驟如下 ①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘， ②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘， ③組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘， ④組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘， ⑤組織切片置于95%乙醇中浸泡10分鐘， ⑥組織切片置于80%乙醇中浸泡10分鐘， ⑦組織切片置于自來水中浸泡1分鐘， ⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。 2.抗原修復(fù)，將10mM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入
組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。 3.用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。 4.將3%雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置10分鐘，甩去多余液體。 5.用超純水洗2次，各五分鐘 6.滴加封閉液(正常山羊血清，5XBSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液 體。 7.滴加一抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置1小時。 8. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。 9.滴加二抗(1 : 100) 50 ii L，室溫靜置0. 5小時。 10. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。 11.滴加三抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置0. 5小時。 12. TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。 13. DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色， 后用自來水沖洗io分鐘。 14.蘇木精復(fù)染20秒，自來水沖洗10分鐘。 15脫水、透明 具體步驟如下 ①組織切片置于80%乙醇中浸泡30秒， ②95%乙醇中浸泡3分鐘， ③無水乙醇中11浸泡5分鐘， ④無水乙醇I浸泡5分鐘， ⑤二甲苯11中浸泡5分鐘， 二甲苯I浸泡5分鐘， 16.樹脂封片、鏡檢。


圖1在惡性腫瘤檢測結(jié)果中Leg咖ain主要在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中的高表達(dá)。 圖2在良性腫瘤檢測結(jié)果中Legumain主要在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中的低表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實(shí)施例1 樣本某婦女卵巢腫瘤的組織切片。 1.脫蠟和水化 具體步驟如下 ①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘， ②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘， ③組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘， ④組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘， ⑤組織切片置于95%乙醇中浸泡10分鐘， ⑥組織切片置于80%乙醇中浸泡10分鐘， ⑦組織切片置于自來水中浸泡1分鐘， ⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。 2.抗原修復(fù)，將10mM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入
組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。 3.用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。 4.將3%雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置10分鐘，甩去多余液體。 5.用超純水洗2次，各五分鐘 6.滴加封閉液(正常山羊血清，5% BSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液體。 7.滴加一抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置1小時。 8. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。 9.滴加二抗(1 : 100) 50 ii L，室溫靜置0. 5小時。 10. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。 11.滴加三抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置0. 5小時。 12. TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。 13. DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色， 后用自來水沖洗io分鐘。 14.蘇木精復(fù)染20秒，自來水沖洗10分鐘。 15脫水、透明 具體步驟如下 ①組織切片置于80%乙醇中浸泡30秒， ②95%乙醇中浸泡3分鐘， ③無水乙醇中11浸泡5分鐘， 無水乙醇I浸泡5分鐘，
⑤二甲苯11中浸泡5分鐘， ⑥二甲苯I浸泡5分鐘， 16.樹脂封片、鏡檢。 鏡檢結(jié)果如圖l所示。 可見該組織切片中Leg咖ain的表達(dá)程度較高，有明顯棕黃色顆粒，為Leg咖ain檢
測陽性結(jié)果，后經(jīng)病理檢測結(jié)果為惡性腫瘤。 實(shí)施例2 樣本某婦女惡性卵巢腫瘤的組織切片。 1.脫蠟和水化 具體步驟如下 ①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘， ②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘， ③組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘， ④組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘， ⑤組織切片置于95%乙醇中浸泡10分鐘， ⑥組織切片置于80%乙醇中浸泡10分鐘， ⑦組織切片置于自來水中浸泡1分鐘， ⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。 2.抗原修復(fù)，將10mM的Citrate Buffer (pH 6. 0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入
組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。 3.用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。 4.將3%雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置10分鐘，甩去多余液體。 5.用超純水洗2次，各五分鐘 6.滴加封閉液(正常山羊血清，5XBSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液 體。 7.滴加一抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置1小時。 8. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。 9.滴加二抗(1 : 100) 50 ii L，室溫靜置0. 5小時。 10. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。 11.滴加三抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置0. 5小時。 12. TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。 13. DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色， 后用自來水沖洗io分鐘。 14.蘇木精復(fù)染20秒，自來水沖洗10分鐘。 15脫水、透明 具體步驟如下 ①組織切片置于80%乙醇中浸泡30秒， @95%乙醇中浸泡3分鐘， ③無水乙醇中11浸泡5分鐘，
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無水乙醇I浸泡5分鐘， ⑤二甲苯I1中浸泡5分鐘， ⑥二甲苯I浸泡5分鐘， 16.樹脂封片、鏡檢。 鏡檢結(jié)果如圖2所示。 可見該組織切片中Leg咖ain的表達(dá)程度較低，無明顯棕黃色顆粒，為Leg咖ain檢 測陰性結(jié)果，后經(jīng)病理檢測結(jié)果為良性腫瘤。
權(quán)利要求
一種檢測Legumain蛋白判斷卵巢癌預(yù)后的方法，其特征在于，一種檢測Legumain蛋白判斷卵巢癌預(yù)后的方法所檢測的目標(biāo)蛋白是Legumain蛋白分子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測Legumain蛋白判斷卵巢癌預(yù)后的方法，其特征在于，使用免疫組化的方法檢測卵巢腫瘤組織中Legumain蛋白分子的方法，其具體技術(shù)方法如下1. 脫蠟和水化，具體步驟如下① 組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘，② 組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘，③ 組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘，④ 組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘，⑤ 組織切片置于95%乙醇中浸泡10分鐘，⑥ 組織切片置于80%乙醇中浸泡10分鐘，⑦ 組織切片置于自來水中浸泡1分鐘，⑧ 組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。`2. 抗原修復(fù)，將10mM的Citrate Buffer (pH 6.0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。
3. 用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。
4. 將3%雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置IO分鐘，甩去多余液體。
5. 用超純水洗2次，各五分鐘
6. 滴加封閉液(正常山羊血清，5XBSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液體。
7. 滴加一抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置1小時。
8. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。
9. 滴加二抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置0. 5小時。
10. TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。
11. 滴加三抗(1 : 100)50iiL，室溫靜置0. 5小時。
12. TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。
13. DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達(dá)到滿意效果后放入清水中終止染色，后用自來水沖洗IO分鐘。
14. 蘇木精復(fù)染20秒，自來水沖洗10分鐘。
15.脫水、透明，具體步驟如下①組織切片置于80%乙醇中浸泡30秒，@95%乙醇中浸泡3分鐘，③無水乙醇中II浸泡5分鐘， 無水乙醇I浸泡5分鐘，⑤ 二甲苯II中浸泡5分鐘，⑥ 二甲苯I浸泡5分鐘，
16.樹脂封片、鏡檢。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種醫(yī)學(xué)診斷用的方法，具體地說是一種檢測卵巢癌組織中Legumain蛋白來判斷卵巢癌預(yù)后的方法，該方法是通過免疫檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，屬于臨床免疫診斷方法，特別是運(yùn)用免疫組化方法檢測Legumain蛋白從而判斷卵巢癌預(yù)后的方法。具體的技術(shù)方案是通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的Legumain蛋白含量，在顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)的產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定Legumain蛋白的含量。并且以此進(jìn)一步判斷卵巢癌預(yù)后的免疫檢測方法。本發(fā)明所載明的方法對卵巢癌的臨床診斷具有實(shí)際意義。
文檔編號G01N21/84GK101726602SQ20091022910
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者劉寅, 劉艷華, 向榮, 呂丹, 張舒, 李娜, 李雪菲, 王麗娜, 賈現(xiàn)培, 馬雪明 申請人:南開大學(xué)