專利名稱：用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測技術領域的方法，特別是一種用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯 酮毒素的方法。
背景技術：
玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone， ZEN)是鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產生 的次級代謝產物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麥、大麥、高梁、黑麥等谷物，也可 存在于食用含ZEN飼料的動物組織中，包括牛奶、雞蛋等。玉米赤霉烯酮毒素與自發(fā)性乳腺 癌，輸卵管和子宮水腫、增生，精細胞畸變、凋亡等疾病有關。玉米赤霉烯酮毒素具有分布 廣泛、殘留時間長、難處理、和其他毒素一起有增強毒性的現(xiàn)象。加入WT0之后，農產品及 相關食品的國際貿易量日益增加，隨之對進出口產品的生物安全性的要求也越來越高，為了 保證這類產品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關、生產企業(yè)、監(jiān)督部門等部門 迫切需要一種快速簡便的玉米赤霉烯酮毒素檢測方法。
膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標志物，應用抗原抗體反應的一種免疫標記技術。 膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑如白磷、單寧酸/檸檬酸鈉和檸檬酸三鈉等作用下(本 發(fā)明用的是檸檬酸三鈉作為還原劑)，聚合成特定大小的金顆粒，由于靜電作用成為一種穩(wěn) 定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。膠體金標記，實質上是蛋白質高分子被吸附到膠體金顆粒表 面的包被過程。吸附機理是膠體金顆粒表面的負電荷，與蛋白質分子的正電荷基團因靜電作 用而形成牢固結合。這種球型的膠體金顆粒具有高電子密度，能夠對多種生物高分子物質如 葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、BSA (牛血清白蛋白)等非共 價結合，形成可見的紫紅色，使其成為免疫反應的優(yōu)良標記物，因此廣泛應用于各種物質的 檢測。
酶聯(lián)免疫吸附實驗由于液相中的抗原(或抗體)需經擴散才能與固相上的抗原或抗體反 應，需較長時間，各個步驟需徹底地洗滌，并且需要特定的酶和底物顯色，因此耗時長，程 序繁瑣；高效液相色譜法因其對檢測樣品、儀器及操作人員的要求，不利于基層常規(guī)檢測使 用。膠體金免疫層析法能克服上述方法的不足，膠體金免疫層析試驗法利用抗原抗體反應原 理，膠體金標記示蹤物與固定在膜上的抗原或抗體形成復合物被截留而顯色，不需要特定的 酶和底物顯色，也不需要抗原抗體之間的較長時間的物理吸附，而根據顯色與否判定陰陽性結果，安全有效，簡單方便。
膠體金免疫層析試驗的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的膠體金標記。固定在 NC膜上的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，膠體金標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性， 又有示蹤的功能。在測定時，受檢樣品(測定其中的抗體或抗原)通過毛細作用向前移行與 金標墊上的抗原或抗體起反應。繼續(xù)向前移行，與固定在T線(檢測線)抗原或抗體結合形 成免疫復合物被截留而顯色，約為一條寬為lmm的棕紅色條帶，多余的金標抗體繼續(xù)向前移 動，與固定在C線(質控線)的二抗結合被截留而顯色，約為一條寬為lmm的棕紅色條帶。此 時T線形成金標復合物與標本中受檢物質的量呈一定的比例，故可根據T線呈現(xiàn)的顏色深淺進 行定性或半定量分析。本發(fā)明采用的是膠體金免疫層析試驗競爭結合法，是以ZEN的偶聯(lián)物 ZEN- 0VA (卵清白蛋白)固定T線，膠體金標記抗ZEN的單克隆抗體附著于金標墊，兔抗鼠的 多克隆抗體固定C線，將樣品液滴入樣本槽，根據T線的顯色與否來判定結果，C線的顯色與 否來判定試紙條的本身質量。
關于玉米赤霉烯酮毒素的檢測國內外已建立了多種方法。目前檢測ZEN的方法主要為高 效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)，液譜和質譜聯(lián)用法(LC-MS)。 然而，這些方法需要對檢測樣品進行嚴格的預處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同 時要求有專業(yè)的操作人員，不利于現(xiàn)場常規(guī)檢測使用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種快速檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法。 本發(fā)明可特異性檢測ZEN毒素，準確率高，檢測速度快，所需時間僅為5 10分鐘。 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟
步驟一，將ZEN (玉米赤霉烯酮毒素)半抗原通過活潑酯法分別與BSA (牛血清白蛋白)和
0VA (卵清白蛋白)偶聯(lián)，得到ZEN的偶聯(lián)物ZEN-BSA和ZEN-OVA;
步驟二，利用ZEN-BSA為免疫原，采用常規(guī)方法制備抗ZEN的單克隆抗體；
步驟三，用檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，用該膠體金標記經過透析除鹽處理的
抗ZEN的單克隆抗體；
步驟四，將步驟三所得的已標記的單克隆抗體噴涂到金標墊上，將ZEN-OVA噴涂到T線， 兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到C線，組裝成試紙條，干燥；
步驟五，將待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，將上清滴入試紙條的樣本槽中，獲取 T線和C線的顯色，鑒定，得到結果。
步驟三中，所述膠體金的制備方法具體為將100ml的0.005。/。HAuCl4溶液加熱至沸騰，之后加入O. 5 lml的P/。檸檬酸三鈉水溶液，煮沸7 10min，最后加三蒸水至100ml，制備得 到40nm的膠體金溶液；其中，百分數(shù)為重量體積百分數(shù)。
步驟三中，所述標記具體為在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入單克隆抗體，使其 終濃度達到40ug/mL， 25。C下孵育5min，用O. lmol/L K2C03調節(jié)膠體金溶液的pH為9. 0，然后 加入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 10000rpm離心20min，棄上清，再用O. OlmM pH為9. 0的 Tris緩沖液恢復，重復1次，之后將沉淀重懸于原體積的l/10的0.01mM pH為9. O的Tris緩沖 液中，最后加入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 4。C儲存?zhèn)溆?；其中，百分?shù)為重量體積百分 數(shù)。
步驟四中，所述干燥為37"C烘箱干燥。 步驟五中，所述甲醇為體積分數(shù)為80%的甲醇。 步驟五中，所述離心為2500g離心15分。
步驟五中，所述鑒定具體為在C線上出現(xiàn)棕紅色條帶，待測樣品中含玉米赤霉烯酮毒 素；在T線和C線上均出現(xiàn)棕紅色條帶，待測樣品中不含玉米赤霉烯酮毒素。
本發(fā)明是鑒于待測樣品若有ZEN毒素，由于毛細效應向前層析移動，樣品液中的ZEN與金 標單克隆抗體形成的復合物，競爭了T線上抗原與金標單克隆抗體結合的機會，所以膠體金 不能或僅少量能被T線上的抗原截流而沉積，故而以T線不顯色或顯色很淺來判定樣品中有 ZEN;相應地待測樣品若沒有ZEN， T線則顯色，呈現(xiàn)出清晰的紅色條帶，由此判定食品、動 物產品等檢測樣品中ZEN的含量。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明檢測對象單一且針對性強，準確 率高。檢測速度快，所需時間短，只需5 10分鐘、不需經培訓的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明 方法來檢測，滿足糧食儲存銷售機構、出入境、海關等檢驗部門快速、正確地判斷ZEN毒素 含量的要求，并且便于基層推廣和運用。


圖l為本發(fā)明實施例試紙條的結構圖； 圖2為本發(fā)明實施例試紙條的結果圖； 其中，a為陽性結果示意圖，b為陰性結果示意圖。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施， 給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未 注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
本實例首先將ZEN連接到OVA或BSA上獲得具有免疫原性的完全抗原，并通過透析及超濾 離心純化該抗原；將該BSA與ZEN偶聯(lián)的抗原ZEN-BSA作為免疫原免疫Balb/C小鼠制備單克隆 抗體，并用0VA與ZEN偶聯(lián)的抗原ZEN-0VA作為包被抗原采用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗測定抗 ZEN抗體效價；純化單克隆抗體；用1% (W/V)的檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，并標 記純化的單克隆抗體蛋白；按金標單克隆抗體、ZEN-0VA偶聯(lián)抗原、兔抗鼠多克隆抗體噴涂 金標墊、檢測線(T線)、質控線(C線)，然后組裝成試紙條，置37'C烘箱烘干，存放-2(TC 冰箱保存?zhèn)溆?；檢測時，待試紙條于密封包裝中恢復至室溫后，將測試端插入樣品液中，5 10分鐘觀察結果。
實施例
步驟一，抗原的制備
(1) 免疫抗原的制備取0. 33ml(3mg/ml)ZEN，混合于1.2ml吡啶中，加入2mg 0-羧甲 基羥胺，室溫攪拌反應24h。真空干燥后，加入4ml蒸餾水，并使其溶解，調整pH至8.0。未 反應的ZEN用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相調pH至3. 0，用 乙酸乙酯抽提(10ml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，棄水相。酯相用無水硫酸鈉濾過 后吹干。吹干后的結晶物溶于O. 5ml堿性氧化鋁處理過的二氧六環(huán)中。稱取20mgBSA溶于
0. 7ml 0. 05mol/L (pH7. 2)的PBS中，將兩溶液于4。C緩慢混合。lmg NHS禾口2mg DCC溶于 0.2ml二氧六環(huán)中，并緩慢滴加此溶液。將混合后的溶液放置室溫攪拌反應16h。調pH至6.0 ，通風櫥中吹干，緩慢滴加DCC溶液(2mgDCC溶于0.2ml二氧六環(huán)中)。室溫攪拌反應48h。 最后用PBS透析2 3d， -2(TC保存。
(2) 包被抗原的制備類似免疫抗原的制備，將BSA換為0VA即可。 步驟二，單克隆抗體的制備
將ZEN-BSA完全抗原溶解于PBS中，測定完全抗原中載體蛋白的濃度。將抗原與等量的弗 氏完全佐劑充分乳化，皮下注射免疫6周齡Balb/C小鼠，每只O. lml; 二免兩周后，改用弗 氏不完全佐劑，用同樣的方法和劑量，進行免疫；三免，操作同二免。免疫5天后眼底靜脈采血測效價，效價達到1:10000以上時加強免疫腹腔注射不加佐劑的抗原O. lml，三天后處 死小鼠，取其脾臟，與骨髓瘤細胞融合。用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞。通過小鼠 腹腔注射雜交瘤細胞來大量制備小鼠腹水，腹水經過過濾、離心初步純化后，采用辛酸法和 親和層析法純化腹水。
步驟三，膠體金的制備及單克隆抗體的標記
先將100ml的0. 005% (W/V) HAuC14溶液加熱至沸騰，迅速加入O. 5 lml的1% (W/V)檸 檬酸三鈉水溶液，開始有些藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7 10min出現(xiàn)透 明的酒紅色，最后加三蒸水至100ml，就這樣制備了40nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢， 確保制備的金顆粒盡量使其大小一致，均勻，顆粒直徑在40nm左右，否則重新制備。
待標記的抗體蛋白用O. 005mol/L的氯化鈉溶液透析48小時除鹽，然后用制備好的40nm的 膠體金來標記多克隆抗體蛋白。具體步驟為①向攪拌中的膠體金溶液里迅速加入抗體蛋白 使其終濃度達到40ug/mL， 25。C室溫下孵育5min;②用0. lmol/L K2C03調節(jié)金溶液的pH為 9.0，然后加入10% (W/V) BSA至終濃度O. 1%來穩(wěn)定膠體金溶液，反應5min;③10000rpm離心 20min，棄上清，再用0.01mMTris (pH=9.0)的緩沖液恢復，重復1次，以除去未與金顆粒 結合的抗體；④最后一次離心后將沉淀重懸于原體積的l/10的0.01mM Tris (pH=9.0)緩沖 液中，最后加入BSA至終濃度為O. 1% (W/V) ， NaN3至終濃度0. 02% (W/V) ， 4"C儲存?zhèn)溆谩?以上操作中應注意， 一切溶液中不應含雜質微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。
步驟四，膠體金試紙條的組裝
將標記好的單克隆抗體蛋白噴涂到金標墊上，噴涂ZEN-OVA偶聯(lián)抗原到T線，噴涂二抗到 C線，然后組裝好試紙條，37'C烘箱干燥，置4'C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ嚰垪l的組裝順序如附圖l ，試紙條的組裝順序如附圖l，由下到上的順序為l為塑料底襯、2為硝酸纖維素膜、3為金標 墊、4為樣品墊、5為吸水墊。
步驟五，膠體金試紙條的使用及結果判定
把待檢樣品滴入試紙條的樣本槽中，由于毛細效應，液體的層析方向向上，若待檢液中 含ZEN，當待測液進入測試端時，由于毛細效應往前移動，ZEN與金標墊上的金標單克隆抗體 (Au-Ab)形成Au-Ab- ZEN二聯(lián)復合物，復合物在NC膜上繼續(xù)層析泳動，無法與檢測線(T 線)上的ZEN-OVA偶聯(lián)抗原結合而不能被固定在T線抗原截留下來，無法形成可見的棕紅色條 帶；Au-Ab- ZEN復合物由于層析作用，繼續(xù)迀移向前，與固定在質控線(C線)上的兔抗鼠 多克隆抗體結合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶，進行定性判定；根據檢測線顯色深 淺程度來大概判定檢測到的ZEN含量，屬于半定量，然后再結合酶聯(lián)免疫試驗進行定量，如圖2中a所示。
若待測液不含ZEN，金標墊的金標鼠單克隆抗體繼續(xù)向前移動，則與檢測線(T線)的 ZEN-0VA結合，形成Au-Ab-ZEN-OVA而被截留，形成可見的棕紅色條帶，多余的金標單克隆體 繼續(xù)層析向上，與固定在質控線(C線)上的二抗結合形成二聯(lián)復合物被截留下來，形成可 見的棕紅色條帶，如圖2中b所示。
本實施例的方法可直接檢測樣品中的ZEN，不需要專業(yè)培訓，操作方便、快速，5 10分 鐘即可獲得結果，能快速、簡便、及時地檢測ZEN的目的。
權利要求
1、一種用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將ZEN半抗原通過活潑酯法分別與BSA和OVA偶聯(lián)，得到ZEN的偶聯(lián)物ZEN-BSA和ZEN-OVA；步驟二，利用ZEN-BSA作為免疫原，采用常規(guī)方法制備抗ZEN的單克隆抗體；步驟三，用檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，用該膠體金標記經過透析除鹽處理的抗ZEN的單克隆抗體；步驟四，將步驟三所得的已標記的單克隆抗體噴涂到金標墊上，將ZEN-OVA噴涂到T線，兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到C線，組裝成試紙條，干燥；步驟五，將待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，將上清滴入試紙條的樣本槽中，獲取T線和C線的顯色，鑒定，得到結果。
2、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征 是，步驟三中，所述膠體金的制備方法具體為將100ml的0.005。/。HAuC14溶液加熱至沸騰， 之后加入O. 5 lml的P/。檸檬酸三鈉水溶液，煮沸7 10min，最后加三蒸水至100ml，制備得 到40nm的膠體金溶液；其中，百分數(shù)為重量體積百分數(shù)。
3、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步驟三中，所述標記具體為在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入單克隆抗體，使其終濃度達到40ug/mL， 25。C下孵育5min，用0. lmol/L K2C03調節(jié)膠體金溶液的pH為，9.0，然后加入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 10000rpm離心20min，棄上清，再用 O.OlmM pH為9.0的Tris緩沖液恢復，重復1次，之后將沉淀重懸于原體積的1/10的 0. OlmM pH為9. O的Tris緩沖液中，最后加入10。/。BSA至BSA的終濃度為0. 1%， 4。C儲存?zhèn)溆?;其中，百分數(shù)為重量體積百分數(shù)。
4、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步驟四中，所述干燥為37'C烘箱干燥。
5、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步驟五中，所述甲醇為體積分數(shù)為80%的甲醇。
6、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步驟五中，所述離心為2500g離心15分。
7、 根據權利要求l所述的用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步驟五中，所述鑒定具體為在C線上出現(xiàn)棕紅色條帶，說明待測樣 品中含玉米 赤霉烯酮毒素；在T線和C線上均出現(xiàn)棕紅色條帶，說明待測樣品中不含玉米赤霉烯酮毒 素。
全文摘要
一種檢測技術領域的用膠體金免疫層析試檢測玉米赤霉烯酮毒素的方法，包括如下步驟將ZEN半抗原通過活潑酯法分別與BSA和OVA偶聯(lián)，得到ZEN的偶聯(lián)物ZEN-BSA和ZEN-OVA；利用ZEN-BSA作為免疫原，采用常規(guī)方法制備抗ZEN的單克隆抗體；用檸檬酸三鈉還原法制備40nm的膠體金，用該膠體金標記經過透析除鹽處理的抗ZEN的單克隆抗體；將步驟三所得的已標記的單克隆抗體噴涂到金標墊上，將ZEN-OVA噴涂到T線，兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到C線，組裝成試紙條，干燥；將待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，將上清滴入試紙條的樣本槽中，獲取T線和C線的顯色，鑒定，得到結果。本發(fā)明可特異性檢測ZEN毒素，準確率高，檢測速度快，所需時間僅為5～10分鐘。
文檔編號G01N33/577GK101650368SQ20091030780
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月27日 優(yōu)先權日2009年9月27日
發(fā)明者嚴亞賢, 孫建和, 君 王, 王元凱 申請人:上海交通大學