專(zhuān)利名稱：：雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，屬于對(duì)中藥材進(jìn)行定量檢測(cè)的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：雞眼睛為省沽油科植物野鴉椿Euscaphisjaponica(Thunb.)Di卯el帶花或果的枝葉，其原植物分布江南各省和云南東北部，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)，《四川中藥志》用其果實(shí)或種子。雞眼睛為貴州少數(shù)民族用藥，性辛、甘、平，具理氣止痛，消腫散結(jié)，祛風(fēng)止癢的功效，現(xiàn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10108(ZD-0108)-2002(試行)血脈通膠囊中的主要藥材之一。血脈通膠囊(WS-10108(ZD-0108)-2002)具有活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)功能，臨床用于冠心病、心絞痛，心血瘀阻證，已獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利一項(xiàng)(ZL02133416.1)。但是文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)關(guān)于雞眼睛藥材的研究較少，基礎(chǔ)研究薄弱，缺乏可靠的定性定量方法和可供使用的對(duì)照品，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)中僅對(duì)其進(jìn)行了簡(jiǎn)單的薄層鑒別。因此以雞眼睛為主藥開(kāi)發(fā)的制劑血脈通膠囊，其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，特別是未對(duì)處方主藥雞眼睛進(jìn)行含量測(cè)定等項(xiàng)目的檢測(cè)，因而不能很好地確保其臨床用藥的有效性及安全性，需要進(jìn)一步研究，提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法。本發(fā)明在同一色譜條件下對(duì)雞眼睛藥材中的多種成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，使得雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法更具整體性、特征性和穩(wěn)定性，為有效控制雞眼睛藥材的質(zhì)量以及雞眼睛藥材的再開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明所述雞眼睛為省沽油科植物野鴉椿Eusc即hisjaponica(Thunb.)Di卯el帶花或果的枝葉。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法為采用高效液相色譜法或超高效液相色譜法，在同一色譜條件下對(duì)雞眼睛藥材中所含的鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-|3-0-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷五個(gè)成分中的至少兩個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。所述含量測(cè)定方法是以鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-0-l3-D-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-0-l3-D-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-a-D-阿拉伯糖苷五種對(duì)照品中的至少兩種為對(duì)照，以乙腈H3P0jK溶液=6100:940為流動(dòng)相梯度洗脫的高效液相色譜法或超高效液相色譜法。具體的含量測(cè)定方法包括以下步驟(1)色譜條件色譜柱為BEHC18柱；乙腈_H3P04水溶液梯度洗脫；柱溫為20°C50°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為220480nm;(2)對(duì)照品溶液的制備分別稱取鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-|3-0-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品中的至少兩種，加甲醇溶解后置同一容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液；(3)供試品溶液的制備取雞眼睛藥材粉末適量，精密稱定，加甲醇適量，提取28h，濃縮后用甲醇稀釋?zhuān)霉┰嚻啡芤海?4)測(cè)定方法按照步驟(1)所述色譜條件測(cè)定，即得。前述步驟(1)的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為儀器WatersACQUITYUPLC色譜儀；色譜柱:ACQUITYUPLCBEHC18柱;流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%1%1^04水溶液，按A:B=6100:940進(jìn)行梯度洗脫；流速0.2mL/min;柱溫40。C;檢測(cè)波長(zhǎng)235260nm;進(jìn)樣量1UL;理論塔板數(shù)計(jì)算均在160000以上。流動(dòng)相梯度洗脫過(guò)程中，洗脫液的A、B相變化為開(kāi)始時(shí)，A相6%，B相94%，穩(wěn)定lmin;第19min時(shí)，A相35%，B相65%;第22min時(shí)，A相100%，B相為0。即按下表1進(jìn)行洗脫表1流動(dòng)相梯度洗脫表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>前述步驟(2)對(duì)照品溶液的制備為分別稱取鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-|3-0-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品中的至少兩種，加甲醇溶解，得對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液，置同一容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得濃度《0.lmg/ml的溶液，即得對(duì)照品溶液。所述五種對(duì)照品均是采用常規(guī)的植化方法從雞眼睛藥材中提取分離所得。前述步驟(3)供試品溶液的制備為精密稱定雞眼睛藥材粉末約lg，置于索氏提取器中，加甲醇提取28h，用少量甲醇洗滌提取器，洗液與提取液合并、濃縮并轉(zhuǎn)移至量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。根據(jù)相關(guān)資料記載，雞眼睛藥材中含有的鞣花酸類(lèi)成分，其母核均為鞣花酸，具有活血化瘀、阻斷致癌物的致癌、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管生成和抗氧化等作用，且在藥材中相對(duì)含量較高。因此為更好地控制雞眼睛藥材的質(zhì)量，保證藥物療效，本申請(qǐng)人參照中國(guó)藥典，選定鞣花酸類(lèi)成分作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，建立了相應(yīng)的多成分含量測(cè)定方法。為了確保本發(fā)明含量測(cè)定方法科學(xué)、合理、可行，申請(qǐng)人對(duì)其進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)研究和考察—、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1、儀器與試藥司世ACQUITYUPLC(美國(guó)沃特世公司，包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Epower2工作站)；Agilent1100高效液相色譜儀系列(美國(guó)安捷倫科技公司，包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Chemstation工作站)；梅特勒1/10萬(wàn)電子天平(AE240);超純水(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)。鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-0-0-阿拉伯糖苷和3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-P-D-葡萄糖苷對(duì)照品，均是采用常規(guī)的植化方法從雞眼睛藥材中提取分離制備所得，經(jīng)理化分析和波譜鑒定，UPLC峰面積歸一化法計(jì)算，其純度均大于98X。乙腈(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用雞眼睛藥材由貴州益康制藥有限公司提供，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院龍慶德副教授鑒定為省沽油科植物雞眼睛Euscaphisj即onica(Th皿b.)Di卯el的干燥枝。標(biāo)本存于貴州省中藥民族藥研究開(kāi)發(fā)中心。2、儀器及色譜柱的選擇由于超高效液相色譜(UPLC)使用1.7iim顆粒度的色譜柱填料，能夠獲得更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內(nèi)柱效保持恒定，因而有利于提高流動(dòng)相流速，縮短分析時(shí)間，提高分析通量，這種固定相還減少了表面殘余硅羥基，適合于中藥復(fù)雜體系的分析。因此試驗(yàn)比較了高效液相色譜(HPLC)法和超高效液相色譜(UPLC)法。通過(guò)上述兩種儀器分析和兩種色譜柱得到的雞眼睛藥材色譜圖結(jié)果可見(jiàn)，采用UPLC和小顆粒填料的色譜柱，其色譜峰的分離度、峰形和靈敏度等均優(yōu)于HPLC，且分析時(shí)間縮短近1/3，故優(yōu)選采用UPLC測(cè)定雞眼睛藥材的含量。3、流動(dòng)相的選擇由于所測(cè)定的成分極性相差較大，流動(dòng)相等度洗脫較為困難，因此試驗(yàn)采用梯度洗脫，鞣花酸類(lèi)化合物含有酚羥基，以有機(jī)溶劑_水為流動(dòng)相，色譜峰拖尾嚴(yán)重，故選用乙腈-O.1%1%磷酸系統(tǒng)，譜圖中絕大部分色譜峰型對(duì)稱、分離度好、分析時(shí)間短。在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)乙腈(A)-O.1%1%磷酸(B)流動(dòng)相系統(tǒng)的梯度條件進(jìn)行了優(yōu)化，流動(dòng)相按照下表2所述規(guī)則進(jìn)行梯度洗脫。表2梯度洗脫流動(dòng)相配比變化程序表6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在4個(gè)洗脫梯度中，所得的色譜峰峰型對(duì)稱、分離度良好，特別是用梯度4對(duì)所分析的化合物分離較好，故采用梯度4進(jìn)行洗脫。4、測(cè)定波長(zhǎng)的選擇鞣花酸類(lèi)成分均具有紫外吸收，試驗(yàn)選擇紫外檢測(cè)器。經(jīng)UPLC-PDA測(cè)定，其中3，3'-二甲氧基鞣花酸，3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-|3-0-木糖苷，3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-0-0-阿拉伯糖苷，3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷在紫外245nm有最大吸收(見(jiàn)圖2-圖5)，鞣花酸在紫外254nm有最大吸收，但在245nm也有較大吸收(見(jiàn)圖1)，綜合考慮選擇245nm為含量測(cè)定波長(zhǎng)。5、柱溫的選擇試驗(yàn)考察了色譜柱溫度為35°C、40°C、45°C時(shí)對(duì)雞眼睛藥材色譜分離效果的影響，色譜圖整體面貌相差較小，所選定的上述柱溫對(duì)色譜峰的分離影響不大。綜合考慮各個(gè)局部分離度，優(yōu)先選擇柱溫40°C。6、優(yōu)化后的色譜條件通過(guò)對(duì)儀器、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化考察的基礎(chǔ)上，獲得了能適用于多成分含量測(cè)定的色譜條件儀器WatersACQUITYUPLC色譜儀(包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Epower2工作站)；色譜柱:ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.lmmX100mm，1.7iim);流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%1%H3P04，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速0.2mL/min;柱溫40。C;檢測(cè)波長(zhǎng)245nm;進(jìn)樣量1iiL;理論塔板數(shù)計(jì)算均在160000以上。二、對(duì)照品溶液的制備分別稱取鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-0-!3-D-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-0-0-阿拉伯糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-e-D-木糖苷J(rèn)，3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品20.23、8.84、4.78、13.30和6.58mg，分別置五個(gè)25mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各lmL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液。三、供試品溶液的制備1、提取溶媒的選擇由于鞣花酸類(lèi)化合物在甲醇中溶解性較好，因此選用甲醇作為提取溶劑。2、提取方法試驗(yàn)比較了回流(2h)、超聲(lh)和索氏提取(2h)三種方式，結(jié)果三者UPLC圖譜基本一致，但從五個(gè)被測(cè)定成分含量值可知，索氏提取優(yōu)于回流提取和超聲提取，故采用以甲醇為溶劑、索氏提取的方法，見(jiàn)表3。同時(shí)，試驗(yàn)還對(duì)索氏提取時(shí)間(2h、4h、6h、8h)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，提取6h基本能將被測(cè)物質(zhì)提取完全，見(jiàn)表4。表3不同提取方法雞眼睛藥材含量測(cè)定結(jié)果(n=2)提取方法稱樣量")12345索氏提取1.035o.mi0.11050.10550.10920.0974回流提取1.0360.13020.09040.08810.08940.0865超聲提取1.0230.10150.07140.06430.06540.0741表4不同提取時(shí)間雞眼睛藥材含量測(cè)定結(jié)果(n=2)提取吋間(h)稱樣量")含量(i^/g)123421.0190.17010.10350.10510.10%0.090741.0370.28240.14210.13210.17890.170161.0280.4，0.22030.21320.26830.253581.0540.47350.23450.22580.28010.26783、供試品溶液制備方法的確定取雞眼睛藥材粉末約lg(過(guò)40目)，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流6h，用少量甲醇洗滌容器，洗液并入提取液，濃縮并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密量取對(duì)照品溶液0.4iiL、0.8iiL、1.4iiL、1.6iiL、1.8iiL，按上述優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鞣花酸線性關(guān)系測(cè)定回歸方程為Y=12492919.12X-61593.24，r=0.9998，線性范圍為0.0320.146iig，結(jié)果見(jiàn)表5。表5鞣花酸線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果進(jìn)樣序號(hào)進(jìn)樣量(ug)峰面積10.03234212520.0647334458<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷線性關(guān)系測(cè)定回歸方程為Y=6754214.29X-11023.60，r=0.9997，線性范圍為0.0140.063iig，結(jié)果見(jiàn)表6。表63，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0_P_D_葡萄糖苷線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷線性關(guān)系測(cè)定回歸方程為Y=6754214.29X-11023.60，r=0.9998，線性范圍為0.0080.036iig，結(jié)果見(jiàn)表7。表73，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0_a_D_阿拉伯糖苷線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-木糖苷線性關(guān)系測(cè)定回歸方程為Y=9068511.96X-18716.96，r=0.9998，線性范圍為0.0210.096iig，結(jié)果見(jiàn)表8。表83，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-木糖苷線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3，3'_二甲氧基鞣花酸線性關(guān)系測(cè)定回歸方程為Y=6953431.54X-9048.10，r=0.9998，線性范圍為0.0110.051iig，結(jié)果見(jiàn)表9。表93，3'-二甲氧基鞣花酸線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>五、精密度試驗(yàn)按本發(fā)明所述含量測(cè)定方法下的色譜條件，精密量取雞眼睛供試品溶液IPL，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)定鞣花酸(A)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷(B)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷(C)、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-P-D-木糖苷(D)、3，3'-二甲氧基鞣花酸(E)，記錄峰面積積分并計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表10。表10精密度試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)樣次數(shù)樣品峰面枳ABCDE11246596296470417124542719371245212636653009324064003768111267365301042403029吸8653781754im盟3015654037665546343800701269127300949405171553914均值126358730019240709855im376676RSD〔％)0.80.71.41.00.9由上表結(jié)果可知，本發(fā)明所述含量測(cè)定方法的精密度良好。六、重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)雞眼睛藥材供試品6份，照本發(fā)明所述含量測(cè)定方法下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液6份，分別測(cè)定，計(jì)算鞣花酸(A)、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-P-D-葡萄糖苷(B)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷(C)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-木糖苷(D)、3，3'_二甲氧基鞣花酸(E)的含量和RSD，結(jié)果見(jiàn)表11。表ll重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)樣品含量(呢/s)ABCDE10.47犯0.22540.22280.27830.257220.4柳0.21400.22900.26400.243130.44770.21530.23140.25590.2柳40.46000.21550.22120.26820.24970.45480.20650.21280.26960.24790.45210.21580.22460.25760.2450均值0.45570.21540.22360.26730.2慣RSD(%)2.42.82.92.72.0由上表結(jié)果可知，本發(fā)明所述含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。七、穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取雞眼睛同一供試品溶液lyL，分別于0、l、2、4、8h測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表12。表12穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由上表結(jié)果可知，供試品溶液中被測(cè)成分8h內(nèi)穩(wěn)定。八、回收率試驗(yàn)取已測(cè)定含量的雞眼睛藥材6份(過(guò)40目篩)，每份約0.5g，精密稱定，分別精密加入五種對(duì)照品混合制得的混合對(duì)照品溶液lmL(五種對(duì)照品各自在混合對(duì)照品溶液中的濃度分別為鞣花酸對(duì)照品O.226mg/mL、3，3'_二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷對(duì)照品0.118mg/mL、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-0-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品0.121mg/mL、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-e-D-木糖苷對(duì)照品O.142mg/mL、3，3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品0.135mg/mL)，室溫?fù)]干，按本發(fā)明所述含量測(cè)定方法下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按本發(fā)明所述含量測(cè)定方法下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果回收率良好。鞣花酸回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表13;3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表14;3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表15;3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-|3-0-木糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表16;3，3'_二甲氧基鞣花酸回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表17。表13鞣花酸回收率試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)樣品含量加入量〔呢)測(cè)得量〔呢)回收率〔％)平均回收率ooRSD〔％)10.22610.22600.4,102.120.22390.22600.4412%■1530.22880.22600.4則98.522.740.23210.22600.4477%■380.23140.22600.453998.4460.22780.22600.艦3皿.1表143，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>九、樣品含量測(cè)定取不同批次的雞眼睛藥材供試品lg，精密稱定，照本發(fā)明所述含量測(cè)定方法下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按本發(fā)明所述含量測(cè)定方法下的色譜條件測(cè)定鞣花酸(A)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷(B)、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-a-D-阿拉伯糖苷(C)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-木糖苷(D)、3，3'-二甲氧基鞣花酸(E)的含量，計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表18。表18不同批次雞眼睛藥材含量測(cè)定結(jié)果(n=2)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>9個(gè)批次樣品中A的平均含量為0.4726mg/g，B的平均含量為0.3314mg/g，C的平均含量為0.2519mg/g，D的平均含量為0.4334mg/g，E的平均含量為0.3636mg/g，五個(gè)被測(cè)成分總平均含量為1.853mg/g。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，結(jié)合各系統(tǒng)適用性參數(shù)情況，并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法精確度、重復(fù)性、回收率等指標(biāo)均良好，提高了雞眼睛藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為雞眼睛藥材的再開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用高效液相色譜法或超高效液相色譜法，在同一色譜條件下對(duì)雞眼睛藥材中的多種成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，使得雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法更具整體性、特征性和穩(wěn)定性，而且該方法精密度高，重復(fù)性好，回收率高，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確，可有效控制雞眼睛藥材的質(zhì)量，從而確保其臨床用藥的有效性及安全性，為雞眼睛藥材的再開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。圖1是鞣花酸對(duì)照品溶液的紫外光譜圖。圖2是3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液的紫外光譜圖。圖3是3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品溶液的紫外光譜圖。圖4是3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-木糖苷對(duì)照品溶液的紫外光譜圖。圖5是3，3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品溶液的紫外光譜圖。圖6是鞣花酸(D、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷(2)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷(3)、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-木糖苷(4)、3，3'_二甲氧基鞣花酸(5)混合對(duì)照品溶液的^^色譜圖。圖7是供試品溶液的UPLC色譜圖，色譜峰分別為鞣花酸(D、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-P-D-葡萄糖苷(2)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷(3)、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-木糖苷(4)、3，3'-二甲氧基鞣花酸(5)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例1:雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法為采用超高效液相色譜法，具體包括以下步驟(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)儀器WatersACQUITYUPLC色譜儀(包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Epower2工作站)；色譜柱:ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.lmmX100mm，1.7iim);流動(dòng)相A為乙腈，B為O.1%HsP04，按A:B=6100:940進(jìn)行梯度洗脫；流動(dòng)相梯度洗脫過(guò)程中，洗脫液的A、B相變化為開(kāi)始時(shí)，A相6%，B相94%，穩(wěn)定lmin;第19min時(shí)，A相35X，B相65X;第22min時(shí)，A相100X，B相為0;即按下表(表19)進(jìn)行洗脫表19流動(dòng)相梯度洗脫表時(shí)間(min)流動(dòng)相A(X)流動(dòng)相B(Q/iO06941694193565221000流速0.2mL/min;柱溫40。C;檢測(cè)波長(zhǎng)245nm;進(jìn)樣量1UL;理論塔板數(shù)計(jì)算均在160000以上。(2)對(duì)照品溶液的制備分別稱取鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-0-0-阿拉伯糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-0-!3-D-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品20.23mg、8.84mg、4.78mg、13.30mg、6.58mg，分別置五個(gè)25mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各lmL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得濃度《0.lmg/ml的溶液，即得對(duì)照品溶液。(3)供試品溶液的制備精密稱定雞眼睛藥材粉末約lg(過(guò)40目)，置于索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流6h，用少量甲醇洗滌提取器，洗液與提取液合并、濃縮并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。(4)測(cè)定法按照步驟(1)所述色譜條件測(cè)定，即得。本發(fā)明的實(shí)施例2:雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法也可以為采用超高效液相色譜法，具體包括以下步驟(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)儀器WatersACQUITYUPLC色譜儀；色譜柱:ACQUITYUPLCBEHC18柱;流動(dòng)相A為乙腈，B為1%H3P04，按A:B=6100:940進(jìn)行梯度洗脫；流動(dòng)相梯度洗脫過(guò)程中，洗脫液的A、B相變化為開(kāi)始時(shí)，A相6%，B相94%，穩(wěn)定lmin;第19min時(shí)，A相35%，B相65%;第22min時(shí)，A相100X，B相為0。流速0.2mL/min;柱溫35。C;檢測(cè)波長(zhǎng)235250nm;進(jìn)樣量1UL;理論塔板數(shù)計(jì)算均在160000以上。(2)對(duì)照品溶液的制備分別稱取鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-P-D-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，得對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液，置同一容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得濃度《0.lmg/ml的溶液，即得對(duì)照品溶液。(3)供試品溶液的制備精密稱定雞眼睛藥材粉末約lg，置于提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取8h，用少量甲醇洗滌提取器，洗液與提取液合并、濃縮并轉(zhuǎn)移至量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。(4)測(cè)定法按照步驟(1)所述色譜條件測(cè)定，即得。本發(fā)明的實(shí)施例3:雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法也可以為采用超高效液相色譜法，具體包括以下步驟(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)儀器WatersACQUITYUPLC色譜儀；色譜柱:ACQUITYUPLCBEHC18柱;流動(dòng)相A為乙腈，B為O.5XH3P04，按A:B=6100:940進(jìn)行梯度洗脫；流動(dòng)相梯度洗脫過(guò)程中，洗脫液的A、B相變化為開(kāi)始時(shí)，A相6%，B相94%，穩(wěn)定lmin;第19min時(shí)，A相35%，B相65%;第22min時(shí)，A相100%，B相為0。流速0.2mL/min;柱溫45。C;檢測(cè)波長(zhǎng)240260nm;進(jìn)樣量luL;理論塔板數(shù)計(jì)算均在160000以上。(2)對(duì)照品溶液的制備分別稱取鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，得對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液，置同一容量瓶中，加甲醇稀釋?zhuān)频脻舛取?.lmg/ml的溶液，即得對(duì)照品溶液。(3)供試品溶液的制備精密稱定雞眼睛藥材粉末約lg，置于提取器中，加甲醇超聲提取26h，用甲醇洗滌提取器，洗液與提取液合并、濃縮并轉(zhuǎn)移至量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。(4)測(cè)定法按照步驟(1)所述色譜條件測(cè)定，即得。本發(fā)明的實(shí)施例4:雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法還可以為采用高效液相色譜法，具體包括以下步驟(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)儀器高效液相色譜儀；色譜柱:BEHC18柱;流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%1%H3P04，按A:B=6100:940進(jìn)行梯度洗脫；流速0.2mL/min;柱溫35。C45°C;檢測(cè)波長(zhǎng)235260nm;進(jìn)樣量luL;理論塔板數(shù)計(jì)算均在160000以上。(2)對(duì)照品溶液的制備分別稱取3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-0-l3-D-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解后置同一容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。(3)供試品溶液的制備取雞眼睛藥材粉末適量，精密稱定，加甲醇提取48h，濃縮后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。(4)測(cè)定法按照步驟(1)所述色譜條件測(cè)定，即得。1權(quán)利要求雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，其特征在于采用高效液相色譜法或超高效液相色譜法，在同一色譜條件下對(duì)雞眼睛藥材中所含的鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-阿拉伯糖苷五個(gè)成分中的至少兩個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。2.按照權(quán)利要求l所述雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，其特征在于所述含量測(cè)定方法是以鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-0-l3-D-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-0-l3-D-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-a-D-阿拉伯糖苷五種對(duì)照品中的至少兩種為對(duì)照，以乙腈H3P04水溶液=6100:940為流動(dòng)相梯度洗脫的高效液相色譜法或超高效液相色譜法。3.按照權(quán)利要求1或2所述雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)色譜條件色譜柱為BEHC18柱；乙腈-H3P04水溶液梯度洗脫；柱溫為20°C50°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為220480nm;(2)對(duì)照品溶液的制備分別稱取鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-|3-0-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品中的至少兩種，加甲醇溶解后置同一容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液；(3)供試品溶液的制備取雞眼睛藥材粉末適量，精密稱定，加甲醇適量，提取28h，濃縮后用甲醇稀釋?zhuān)霉┰嚻啡芤海?4)測(cè)定方法按照步驟(1)所述色譜條件測(cè)定，即得。4.按照權(quán)利要求3所述雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，其特征在于步驟(1)的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為儀器WatersACQUITYUPLC色譜儀；色譜柱ACQUITYUPLCBEHC18柱;流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%1%H3P04水溶液，按A:B=6100:940進(jìn)行梯度洗脫；流速0.2mL/min;柱溫40。C;檢測(cè)波長(zhǎng):235260nm;進(jìn)樣量lilL;理論塔板數(shù)計(jì)算均在160000以上。5.按照權(quán)利要求4所述雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，其特征在于流動(dòng)相梯度洗脫過(guò)程中，洗脫液的A、B相變化為開(kāi)始時(shí)，A相6X，B相94X，穩(wěn)定lmin;第19min時(shí)，A相35X，B相65X;第22min時(shí)，A相100X，B相為0。6.按照權(quán)利要求3所述雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，其特征在于步驟(2)對(duì)照品溶液的制備為分別稱取鞣花酸、3，3'_二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'_0-|3-0-木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'_0-|3-0-葡萄糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸_4'-O-a-D-阿拉伯糖苷對(duì)照品中的至少兩種，加甲醇溶解，得對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液，置同一容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得濃度《0.lmg/ml的溶液，即得對(duì)照品溶液。7.按照權(quán)利要求3所述雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，其特征在于步驟(3)供試品溶液的制備為精密稱定雞眼睛藥材粉末約lg，置于索氏提取器中，加甲醇提取28h，用少量甲醇洗滌提取器，洗液與提取液合并、濃縮并轉(zhuǎn)移至量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。全文摘要本發(fā)明提供了一種雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，即采用高效液相色譜法或超高效液相色譜法，在同一色譜條件下對(duì)雞眼睛藥材中所含的鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-阿拉伯糖苷五個(gè)成分中的至少兩個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。本發(fā)明在同一色譜條件下對(duì)雞眼睛藥材中的多個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，使得雞眼睛藥材中鞣花酸類(lèi)成分的含量測(cè)定方法更具整體性、特征性和穩(wěn)定性，而且該方法精密度高，重復(fù)性好，回收率高，可有效控制雞眼睛藥材的質(zhì)量，從而確保其臨床用藥的有效性及安全性，為雞眼睛藥材的再開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)G01N30/36GK101788537SQ20091030784公開(kāi)日2010年7月28日申請(qǐng)日期2009年9月28日優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日發(fā)明者蘭燕宇,劉智,張秋生,李勇軍,王愛(ài)民,高翔申請(qǐng)人:貴州益康制藥有限公司