專利名稱：：用作糖尿病預測生物標志物的精氨酸加壓素激素原的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于預后生物標志物和預后測定方法領域。具體來說，本申請涉及糖尿病的預測和代謝綜合征的診斷。
背景技術：
：精氨酸加壓素(AVP)，也稱為抗利尿激素(ADH)，在下丘腦中產(chǎn)生，并在高血漿重量克分子滲透壓濃度、低血漿體積和低血壓的情況下從神經(jīng)垂體腺釋放。AVP結合到三種不同受體上(VlaR、VlbR和V2R)。VlaR廣泛表達(Nature1993:356:523-5)，而VlbR和V2R更特異地分別表達在垂體腺和腎臟集合管中(Nature1992:336-339和FEBSLett1994356=215-220)。AVP的抗利尿效應通過V2R介導，并且V2R的藥物阻斷在低鈉血癥和心力衰竭的治療中具有有利效應，而可在臨床上用于出血和低血壓病癥的AVP的血栓前和血管收縮效應，主要通過VlaR介導。此外，已經(jīng)提出AVP的作用與調節(jié)ACTH釋放(VlbR)、刺激肝臟糖原生成(VlaR)以及刺激胰島素和胰高血糖素分泌(VlaR)相關(Morel等，Nature1992；356(6369):523-6;deKeyzer等，F(xiàn)EBSletters1994；356(2-3):215-20；Ventura等，Journalofmolecularendocrinology1999；22(3):251_60)。以前對人類和動物模型的研究，已經(jīng)表明了AVP系統(tǒng)在葡萄糖體內平衡、胰島素抗性和糖尿病中的作用。在具有控制不良的糖尿病和高重量克分子滲透壓濃度的患者中，血漿AVP顯著升高(Lolait等，Nature1992；357(6376):336-9)，并且在健康對象中，AVP灌輸導致血糖水平增加(Schrier等，NEnglJMed2006；355(20):2099-112)。缺少VlaR的小鼠顯示出受損的葡萄糖耐受性、胰島素抗性和升高的AVP水平((iheorghiade等，Jama2007；297(12):1332-43；Federici等，Annalsofmedicine2007；39(5):346_58)，而缺少VlbR的小鼠具有與正常小鼠相比較低的禁食血漿葡萄糖水平和胰島素靈敏性升高的相反表型(Dunser等，Circulation2003；107(18):2313-9)。血管加壓素基因編碼前體蛋白(pre-pro-AVP)，其包含19個氨基酸的信號序列、精氨酸加壓素和兩個相關蛋白，即后葉激素運載蛋白II和一種糖肽一和肽素。和肽素是AVP前體C-端的無生物活性的切割產(chǎn)物，并以與AVP等摩爾的量產(chǎn)生。然而，與AVP相反，和肽素穩(wěn)定、具有長的半衰期、不與血小板結合，因此與AVP相比以明顯更高的濃度在血漿中發(fā)現(xiàn)，并且已經(jīng)提出將它作為評估血管加壓素釋放的可替選的診斷靶(StruckJ，MorgenthalerNG,BergmannΑ.“和肽素，一種源自于血管加壓素前體的穩(wěn)定的肽，在膿毒癥患者的血清中升高，，(Copeptin,astablepeptidederivedfromthevasopressinprecursor,iselevatedinserumofsepsispatients),Peptides.2005Dec；26(12)2500-4)。已經(jīng)將AVP描述為糖尿病的診斷標志物，并且使用I型糖尿病動物模型，已經(jīng)了解到AVP水平作為急性或慢性應激物與糖尿病相關(SimShinYi等，“在2型糖尿病大鼠的下丘腦室旁核和視上核中精氨酸加壓素(Avp)的增強表達”(Enhancedexpressionsofargininevasopressin(Avp)inthehypothalamicparaventricularandsupraopticnucleicoftype2diabeticrats,NeurochemRes(2008)33:833-841)。發(fā)明概述本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在精氨酸加壓素(AVP)激素原或其片段的相對增加的水平與存在代謝綜合征和發(fā)生糖尿病的風險之間存在關聯(lián)。在此背景下，由本發(fā)明提供了包含至少一種單克隆抗體的靈敏精確的和肽素測定方法。因此，本發(fā)明的主題是用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于鑒定具有發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的高風險的對象，或用于診斷對象代謝綜合征的體外方法，所述方法包含下列步驟a.提供來自所述對象的樣品，b.測定所述樣品中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平，c.使用精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的可能性，或用于從其推斷出所述對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于診斷所述對象的代謝綜合征。本發(fā)明的另一個主題是靈敏精確的和肽素測定方法。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于鑒定具有發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的高風險的對象，或用于診斷對象代謝綜合征的方法，所述方法包含下列步驟a.提供來自所述對象的樣品，b.測定所述樣品中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平，c.使用精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的可能性，或用于從其推斷出所述對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于診斷所述對象代謝綜合征。在本文中，“使用精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的可能性，或用于從其推斷出所述對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于診斷所述對象代謝綜合征”，可以具有“將精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平與對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征或與診斷所述對象代謝綜合征相關聯(lián)”的意義。在本發(fā)明所有情況的優(yōu)選實施方案中，所述對象是表觀健康的。當在本文中使用時，“表觀健康的”是指個體不患有糖尿病。在某些實施方案中，表觀健康的對象患有代謝綜合征。本發(fā)明的方法可用于診斷對象是否患有代謝綜合征。當在本文中使用時，術語“對象”是指活的人類或非人類生物體。在本文中，優(yōu)選情況下對象是人類對象。優(yōu)選情況下，所述對象是非糖尿病人。在非常特定的實施方案中，表觀健康的對象是以前沒有或沒有意識到具有心血管或冠狀動脈事件或心力衰竭或未患有心血管疾病的個體。冠狀動脈事件被定義為致死性或非致死性急性冠狀動脈綜合征，包括心肌梗塞或由缺血性心臟病引起的死亡。心血管事件被定義為致死性或非致死性急性冠狀動脈綜合征，包括心肌梗塞、致死性或非致死性中風或由心血管疾病引起的死亡。此外，在非常特定的實施方案中，表觀健康的對象可以不患有急性傳染病。在另一個非常特定的實施方案中，表觀健康的對象可能患有心血管疾病和/或可能已具有心血管或冠狀動脈事件或心力衰竭。在某些實施方案中，他們可能患有傳染病。在一個實施方案中，對象表現(xiàn)出受損的禁食血糖(受損的禁食葡萄糖)，即血液中的禁食葡萄糖水平(禁食血糖(FBG)或禁食血液糖(FBS))低于6.1但高于5.4mmol/L。因此，在特別優(yōu)選實施方案中，所述對象是禁食血糖低于6.lmmol/L但高于5.4mmol/L的非糖尿病人。在另一個特別優(yōu)選實施方案中，所述對象是沒有受損的禁食血糖的對象。因此，在特別優(yōu)選實施方案中，所述對象是禁食血糖低于5.4mmol/L的對象。禁食血糖在對象最后一次攝入食物后至少8小時、典型在最后一次食物攝入后8至10小時測量。本文中的(禁食)血糖水平根據(jù)全血葡萄糖水平給出。一般來說，可以在全血、血清或血漿中測量葡萄糖，但是參考值根據(jù)樣品的類型而有所不同。在本文中，精氨酸加壓素激素原或其片段的水平的測定(或測量或檢測)，使用下面解釋的診斷測定方法來進行。精氨酸加壓素激素原(pro-AVP)的優(yōu)選片段是C-端pro_AVP(CT-pro-AVP或和肽素)，即覆蓋pro-AVP的107-145(pre-pro-AVP的126-164)氨基酸位置的翻譯后修飾(糖基化)的肽。在優(yōu)選實施方案中，精氨酸加壓素激素原(pro-AVP)的片段不是成熟的AVP。在方法的特別優(yōu)選實施方案中，測定和肽素的水平。在本文中，當在激素原和其他肽的上下文中提到時，術語“片段”是指可以從較大蛋白或肽得到的較小蛋白或肽，因此其包含較大蛋白或肽的部分序列。所述片段可以從較大蛋白或肽通過其一個或多個肽鍵的皂化作用而產(chǎn)生。精氨酸加壓素激素原(pro-AVP)的“片段”優(yōu)選是指長度為至少6個氨基酸、最優(yōu)選長度為至少12個氨基酸殘基的片段。這樣的片段優(yōu)選可以使用本文描述的免疫測定方法檢測。在本發(fā)明的文本中，在表述例如“激素原的水平”和類似表述中，術語“水平”是指在相應上下文中提到的分子實體的量，或在酶的情況下它也可以是指酶活性。本發(fā)明的方法尤其適用于預測發(fā)生II型糖尿病的風險。在一個實施方案中，對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險的預測或代謝綜合征的診斷，可以通過附加地測定和使用至少一種實驗室參數(shù)或其他標志物來改進，所述實驗室參數(shù)和其他標志物選自禁食血液或血漿葡萄糖、甘油三酯、HDL膽固醇或其亞級分、LDL膽固醇或其亞級分、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、胰島素、CRP、A型和B型利尿鈉肽以及包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP,proBNP、NT-proBNP的它們的前體及其片段、⑶F15、ST2、降鈣素原及其片段、腎上腺髓質素原及其包括ADM、PAMP、MR-proADM、CT-proADM的片段、內皮素原-I及其包括CT-proET-l、NT-proET-l、大內皮素-1和內皮素_1的片段。在本發(fā)明的特定實施方案中，附加測定了至少一種臨床參數(shù)，其選自年齡、性別、收縮壓、舒張壓、抗高血壓治療(AHT)、體重指數(shù)、腰圍、腰臀比、當前吸煙、糖尿病遺傳和以前的心血管疾病(CVD)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization)(WHO)的定義，糖尿病是當胰腺不能產(chǎn)生足夠胰島素、或當身體不能有效使用它所產(chǎn)生的胰島素時發(fā)生的慢性疾病。這導致血液中葡萄糖濃度升高(高血糖)。1型糖尿病(以前稱為胰島素依賴型或兒童糖尿病)的特征為胰島素生產(chǎn)不足。2型糖尿病(以前稱為非胰島素依賴型或成年糖尿病)由身體利用胰島素的效率低引起。它通常起因于體重超重和身體缺乏活動。2型糖尿病是一種代謝障礙，其主要特征為胰島素抗性、胰島素相對不足和高血糖。世界衛(wèi)生組織的糖尿病定義涉及單一升高的葡萄糖讀數(shù)和癥狀，換句話說在兩種情況的任一種下的升高值(i)禁食血漿葡萄糖>7.Ommol/1(126mg/dl)或(ii)使用葡萄糖耐受性測試(GTT)，口服藥劑后2小時血漿葡萄糖>11.lmmol/1(200mg/dl)。2型糖尿病常見的初始癥狀是呼氣中微弱的水果或蔬菜氣味。這由對胰島素缺乏響應、導致細胞內缺乏葡萄糖所誘導的酮病引起。它通常伴有高血糖水平，其也是對胰島素敏感性降低的結果。代謝綜合征是醫(yī)學病癥的組合，其增加發(fā)生心血管疾病和糖尿病的風險。它影響大量人群，并且普遍性隨年齡增加。某些研究估計在美國的患病率高達人群的25%。代謝綜合征也稱為代謝綜合征X、綜合征X、胰島素抗性綜合征、Reaven's綜合征和CHAOS(澳大利亞)。重要的是盡早鑒定具有代謝綜合征的個體，以便生活方式干預和治療可能阻止糖尿病和/或心血管疾病的發(fā)生。代謝綜合征下潛伏的原因對專家來說仍是挑戰(zhàn)。胰島素抗性和軀干性肥胖被認為是重要因素。遺傳、身體缺乏活動、衰老、前炎性狀態(tài)和激素變化也可能具有因果效應，但是它們的作用可能隨著種族組而變。由于代謝綜合征的機理原因的不確定性，關于代謝綜合征的定義存在大量混亂。代謝綜合征多種定義的存在已經(jīng)引起混亂，并產(chǎn)生了許多比較每種定義的優(yōu)點的研究和研究論文。根據(jù)國家膽固醇教育項目(NCEP)專家委員會關于成人高血液膽固醇的檢測、評估和治療的第三次報告的計劃概要(AdultTreatmentPanelIII)(JAMA.2001；285(19)J486-2497)，代謝綜合征被定義為存在下列要素中的三種或三種以上(1)腰圍在女性中彡88cm(35英寸)或在男性中彡102cm(40英寸)，O)BP彡130/85mmHg或進行高血壓治療，(3)禁食甘油三酯彡150mg/dL,(4)HDL膽固醇在男性中彡40mg/dL或在女性中彡50mg/dL,以及(5)禁食血糖彡110mg/dL或進行糖尿病治療。更近些時候由國際糖尿病聯(lián)盟(InternationalDiabetesFederation)給出了具有一些修改的定義(http://www.idf.orR/webdata/docs/IDFMetadeffinal,pdf)。因為定義代謝綜合征的目的是鑒定處于發(fā)生糖尿病和/或心血管疾病的高風險中的對象，因此與這些風險獨立相關的預后因子可以與代謝綜合征直接相關，并且在這種意義上用于診斷代謝綜合征的存在。因此，可用于獨立預測糖尿病發(fā)生的標志物、例如本發(fā)明中顯示的和肽素，必須在同時被當作代謝綜合征存在的診斷標志物(與其他診斷性實驗室和臨床參數(shù)一起)，并且甚至能夠預期它在將來將變成代謝綜合征定義的一部分。因此，對象樣品中精氨酸加壓素激素原或其片段的預定水平，可以與其他臨床和/或實驗室參數(shù)聯(lián)合，用于幫助將“代謝綜合征”定義為醫(yī)學病癥。換句話說，精氨酸加壓素激素原或其片段的水平可用作附加參數(shù)，以在決定性判據(jù)方面改進代謝綜合征的定義，因為上面概述的現(xiàn)有判據(jù)不是在所有情況下都產(chǎn)生令人滿意的結果。胰島素抗性(IR)是其中給定濃度的胰島素產(chǎn)生低于預期的生物學效應的狀態(tài)。胰島素抗性也已被任意定義為每天需要200或以上單位的胰島素才能獲得血糖控制并阻止酮病。由胰島素抗性引起的高血漿胰島素和葡萄糖水平，通常導致代謝綜合征和2型糖尿病，包括其并發(fā)癥。頂?shù)陌Y狀可以包括疲勞、大腦迷糊、注意力無法集中、低血糖、腸膨脹、嗜睡、體重增加、脂肪儲存、減肥困難、高血液甘油三酯水平、高血壓和抑郁。本發(fā)明還涉及如上所述的用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于鑒定具有發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的高風險的對象，或用于診斷對象代謝綜合征的方法，其中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平單獨地或與其他預后有用的實驗室或臨床參數(shù)組合，通過可以選自下列可選方案的方法，用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險或用于診斷代謝綜合征-與表觀健康對象群體中全部預定樣品中的精氨酸加壓素激素原或其片段的水平的中位數(shù)進行比較，-與表觀健康對象群體中全部預定樣品中的精氨酸加壓素激素原或其片段的水平的分位數(shù)進行比較，-根據(jù)Cox比例風險分析或使用風險指數(shù)計算例如NRI(凈重新分類指數(shù))或IDI(綜合鑒別指數(shù))進行計算。在優(yōu)選實施方案中，在診斷測定方法中、優(yōu)選通過免疫測定方法測定精氨酸加壓素(AVP)激素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平。特別優(yōu)選情況下，測定和肽素或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平。本發(fā)明還可以包含將個體的標志物(這里為精氨酸加壓素激素原或其片段例如和肽素)的水平與預定值進行比較。預定值可以采取各種形式。它可以是單一截止值，例如群體的中位數(shù)或平均值或75^9(^、95&或99&百分位數(shù)。它可以根據(jù)對比組來建立，例如一個規(guī)定組中的風險為另一個規(guī)定組中風險的兩倍。它可以是范圍，例如將測試群體等量(或不等量)地分組，例如低風險組、中風險組和高風險組，或分成四等分，最低的四分之一是具有最低風險的個體，最高的四分之一是是具有最高風險的個體。在所選的特定群體中，預定值可以隨著他們的嗜好、種族、遺傳等而變化。例如，表觀健康的非吸煙者群體(沒有可檢測的疾病，特別是沒有糖尿病)可以與吸煙群體或其成員患有糖尿病的群體具有不同的標志物“正常”范圍。因此，所選的預定值可以考慮個體所屬類別。本
技術領域：
的普通專業(yè)人員可以使用不超出常規(guī)的實驗來選擇適合的范圍和類別。在本發(fā)明方法的具體實施方案中，精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平的使用包含將精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平與閾值水平進行比較，由此當精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平高于所述閾值水平時，在對象中預測了糖尿病和/或代謝綜合征，或鑒定到對象具有發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的高風險。其他優(yōu)選的截止值是例如正常群體的90th、95th或99th百分位數(shù)。通過使用比75th百分位數(shù)更高的百分位數(shù)，人們可以減少鑒定到的假陽性對象的數(shù)量，但是人們可能錯過鑒定到具有中等、盡管仍然增加的風險的對象。因此，人們可以根據(jù)被認為更加合適的是以也鑒定到“假陽性”為代價而鑒定大多數(shù)有風險對象，還是以錯過幾個具有中等風險的對象為代價而主要鑒定高風險對象，來調整截止值。通過使用個體的和肽素值和其他預后性實驗室和臨床參數(shù)來計算個體風險的其他數(shù)學可能性是例如NRI(凈重新分類指數(shù))或IDI(綜合鑒別指數(shù))。指數(shù)可以按照Pencina的文獻來計算(PencinaMJ等“評估新標志物的增加預測能力從ROC曲線下面iRiLlS^^^"(Evaluatingtheaddedpredictiveabilityofanewmarker:fromareaundertheROCcurvetoreclassificationandbeyond),StatMed.2008；27157-172)。例如，樣品中和肽素水平為5.04pmol/L(即表觀健康對象參比群體的中位數(shù)濃度)或以上，優(yōu)選高于7.93pmol/L(即表觀健康對象參比群體的Q3/Q4邊界濃度)，可以指示患者發(fā)生糖尿病的升高的風險。本文中的Q1、Q2、Q3和Q4是指表觀健康對象參比群體的四分位數(shù)。在其他具體方面，本發(fā)明涉及用于診斷對象代謝綜合征的方法，所述方法包括下列步驟a.提供來自所述對象的樣品b.測定所述樣品中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平，c.測定與代謝綜合征的診斷相關的其他臨床和/或實驗室參數(shù)，d.將與其他臨床和/或實驗室參數(shù)聯(lián)合的精氨酸加壓素激素原或其片段的水平與代謝綜合征的診斷相關聯(lián)。本發(fā)明的范圍內還包括測定樣品中和肽素水平的測定方法，用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險或診斷代謝綜合征。優(yōu)選情況下，測定方法所具有的總測定不精確性，在低于2.2pmol/L的濃度下為20%CV，在高于該濃度的正常范圍濃度下低于20%CVdn/或在低于9pmol/l的濃度下為10%CV，并且在高于該濃度的正常范圍濃度下低于10%CV。在另一個優(yōu)選實施方案中，在靜息時在健康的禁食女性白人群體的血清和血漿中測定到的中位數(shù)和肽素濃度下，測定方法具有最高12%的總測定不精確性。在上述測定方法的優(yōu)選實施方案中，測定方法包含兩種抗和肽素抗體，其中至少一種抗體是單克隆抗體或其片段或重組變體。本發(fā)明還涉及用于測定樣品中和肽素水平的測定方法，其中測定方法包含兩種抗和肽素抗體，其中至少一種抗體是單克隆抗體或其片段或重組變體。優(yōu)選情況下，測定方法包含單克隆和多克隆抗體。在本發(fā)明的測定方法的另一個優(yōu)選實施方案中，一種單克隆抗體與代表前血管加壓素原的132-147位的肽中包含的表位結合。通過本發(fā)明的方法或通過使用本發(fā)明的測定方法獲得的標志物的水平，可以本
技術領域：
的專業(yè)人員熟知的各種方式進行分析。例如，可以將獲得的每個測定結果與“正?！敝祷虮砻魈囟膊』蚪Y果的值進行比較。具體的診斷/預后可以取決于每個測定結果與這種值的比較，所述值可以被稱為診斷或預后“閾值”。在某些實施方案中，用于一種或多種診斷或預后指示物的測定方法，僅僅通過測定方法中指示物的存在或不存在與病癥或疾病相關聯(lián)。例如，可以設計測定方法，使得只有當高于特定目標閾值濃度時才出現(xiàn)陽性信號，并且低于該濃度時測定方法不提供高于背景的信號。診斷和/或預后測試的靈敏度和特異性不僅取決于測試的分析“質量”，而且還取決于構成異常結果的定義。在實踐中，典型地通過將“正?！?即表觀健康的)和“患病”群體(即患有糖尿病、胰島素抗性和/或代謝綜合征的患者)的變量值對其相對頻率進行作圖，計算出受試者工作特征曲線(R0C曲線)。對于任何特定標志物來說，患有或未患疾病的對象的標志物水平分布可能交疊。在這些條件下，測試不能以100%準確性絕對辨別正常與疾病，并且交疊的區(qū)域表示測試不能辨別正常與疾病的地方。選擇一個閾值，高于它(或低9于它，取決于標志物隨著疾病如何變化)時測試被認為是異常的，低于它時測試被認為是正常的。ROC曲線下的面積是感覺到的測量值將允許正確鑒定病癥的概率的度量。即使在測試結果不一定給出準確數(shù)字的情況下，ROC曲線也能使用。只要人們能夠對結果排序，人們即能產(chǎn)生ROC曲線。例如，在“患病”樣品上進行的測試的結果可以按照程度排序(例如1=低，2=正常，3=高)。這種排序可以與“正?！比后w中的結果相關聯(lián)，并產(chǎn)生ROC曲線。這些方法在本
技術領域：
中是公知的。參見例如Hanley等，Radiology143:29-36(1982)。優(yōu)選情況下，所選的閾值能夠提供的ROC曲線面積大于約0.5、更優(yōu)選大于約0.7、更優(yōu)選大于約0.8、更優(yōu)選大于約0.85，并且最優(yōu)選大于約0.9。在該上下文中，術語“約”是指給定測量值的+/-5%。ROC曲線的水平軸表示(1-特異性)，其隨著假陽性率而增加。曲線的垂直軸表示靈敏度，其隨著真陽性率而增加。因此，對于所選的具體截止值來說，可以測定(ι-特異性)的值，并可以獲得相應的靈敏度。ROC曲線下的面積是測量到的標志物水平將允許正確鑒定疾病或病癥的概率的度量。因此，ROC曲線下的面積可用于確定測試的有效性。在某些實施方案中，不依賴于組中的一個或多個標志物的具體閾值來確定從對象獲得的標志物水平分布情況是否指示了特定診斷/預后。相反，本發(fā)明可以利用標志物組“分布情況”作為不可分割的整體進行評估。這種標志物組中變化的特定“指紋”組合形式能夠有效用作特定的診斷或預后指示物。正如在本文中討論的，變化的組合形式可以從單一樣品或組的一個或多個成員的時間變化(或組的響應值)獲得。這里的組是指一組標志物。正如在本文后面所描述的，組的響應值優(yōu)選通過對在各種截止值下特定標志物組的靈敏度對組的1_(特異性)進行ROC曲線作圖來確定。在這些方法中，來自對象的標志物測量值的分布情況合在一起，被認為提供了診斷或預后的全局概率(表示成數(shù)字分值或風險百分率)。在這樣的實施方案中，標志物的某些子集的增加可能足以在一個患者中指示特定診斷/預后，而標志物的不同子集的增加可能足以在另一個患者中指示相同或不同的診斷/預后。也可以向組中的一個或多個標志物施加權重因數(shù)，例如，當標志物在鑒定特定診斷/預后中效用特別高時，可以將其權重成使得在給定水平下，它單獨即足以傳遞陽性結果的信號。同樣，可以施加權重因數(shù)，以使特定標志物的任何給定水平都不足以傳遞陽性結果的信號，而只有當另一個標志物也有助于分析時才傳遞結果的信號。在某些實施方案中，標志物和/或標志物組被選擇成表現(xiàn)出至少約70%的靈敏度、更優(yōu)選至少約80%的靈敏度、更優(yōu)選至少約85%的靈敏度、更優(yōu)選至少約90%的靈敏度以及最優(yōu)選至少約95%的靈敏度，與至少約70%的特異性、更優(yōu)選至少約80%的特異性、更優(yōu)選至少約85%的特異性、更優(yōu)選至少約90%的特異性以及最優(yōu)選至少約95%的特異性的組合。在特別優(yōu)選實施方案中，靈敏度和特異性兩者均為至少約75%、更優(yōu)選至少約80%、更優(yōu)選至少約85%、更優(yōu)選至少約90%以及最優(yōu)選至少約95%。在這種情況下，術語“約”是指給定測量值的+/_5%。在其他實施方案中，陽性似然比、陰性似然比、機會比或風險比被用作測試的預測風險或診斷疾病的能力的度量。在陽性似然比的情況下，值為1表示在“患病”和“對照”組二者的對象中陽性結果可能性相等；值大于1表示在患病組中陽性結果可能性更大；值小于1表示在對照組中陽性結果可能性更大。在陰性似然比的情況下，值為1表示在“患病”和“對照”組二者的對象中陰性結果可能性相等；值大于1表示在測試組中陰性結果可能性更大；值小于1表示在對照組中陰性結果可能性更大。在某些優(yōu)選實施方案中，標志物和/或標志物組優(yōu)選被選擇成表現(xiàn)出至少約1.5或以上或約0.67或以下、更優(yōu)選至少約2或以上或約0.5或以下、更優(yōu)選至少約5或以上或約0.2或以下、更優(yōu)選至少約10或以上或約0.1或以下，以及最優(yōu)選至少約20或以上或約0.05或以下的陽性或陰性似然比。在這種情況下，術語“約”是指給定測量值的+/_5%。在機會比的情況下，值為1表示在“患病”和“對照”組二者的對象中陽性結果可能性相等；值大于1表示在患病組中陽性結果可能性更大。值小于1表示在對照組中陽性結果可能性更大。在某些優(yōu)選實施方案中，標志物和/或標志物組優(yōu)選被選擇成表現(xiàn)出至少約2或以上或約0.5或以下、更優(yōu)選至少約3或以上或約0.33或以下、更優(yōu)選至少約4或以上或約0.25或以下、更優(yōu)選至少約5或以上或約0.2或以下以及最優(yōu)選至少約10或以上或約0.1或以下的機會比。在這種情況下，術語“約”是指給定測量值的+/_5%。在風險比的情況下，值為1表示在“患病”和“對照”組二者中終點(例如死亡)的相對風險相等；值大于1表示在患病組中風險更高；值小于1表示在對照組中風險更高。在某些優(yōu)選實施方案中，標志物和/或標志物組優(yōu)選被選擇成表現(xiàn)出至少約1.1或以上或約0.91或以下、更優(yōu)選至少約1.25或以上或約0.8或以下、更優(yōu)選至少約1.5或以上或約0.67或以下、更優(yōu)選至少約2或以上或約0.5或以下以及最優(yōu)選至少約2.5或以上或約0.4或以下的風險比。在這種情況下，術語“約”是指給定測量值的+/_5%。專業(yè)技術人員將會理解，將診斷或預后指示物與診斷或與將來臨床結果的預后風險相關聯(lián)，是一種統(tǒng)計學分析。例如，標志物水平大于X可以傳遞患者與水平低于或等于X的患者相比更可能遭受不利后果的信號，正如通過統(tǒng)計學顯著性水平所確定的。此外，標志物濃度從基線水平的改變可以反映患者的預后，并且標志物水平變化的程度可能與不利事件的嚴重性相關。統(tǒng)計學顯著性通常通過比較兩個或多個群體并確定置信區(qū)間和/或ρ值來確定。參見例如Dowdy和Wearden，《用于研究的統(tǒng)計學》(StatisticsforResearch),JohnWiley&Sons，NewYork，1983。本發(fā)明的優(yōu)選置信區(qū)間是90%、95%、97.5%、98%、99%,99.5%,99.9%和99.99%,而優(yōu)選的ρ值是0.1、0·05,0.025,0.02,0.01,0.005、0.001和0.0001。在其他實施方案中，可以進行多次診斷或預后標志物的測定，并使用標志物的時間變化確定診斷或預后。例如，可以在初始時間測定對象樣品中的標志物濃度，并在第二個時間從第二個對象樣品再次測定。在這樣的實施方案中，從初始時間到第二個時間標志物的增加可以指示特定的診斷或特定的預后。同樣地，從初始時間到第二個時間標志物的減少可以指示特定的診斷或特定的預后。當在本文中使用時，術語“樣品”是指出于對目標對象例如患者進行診斷、預后或評估的目的而獲得的體液樣品。優(yōu)選的測試樣品包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、痰液和胸膜腔積液。此外，本
技術領域：
的專業(yè)人員將會認識到，某些測試樣品在分級或純化步驟、例如將全血分離成血清或血漿組分后，可以更容易地分析。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品和尿液樣品，或上面提到的任何樣品的提取物。優(yōu)選情況下，樣品是血液樣品，最優(yōu)選為血清樣品或血漿樣品。當在本文中用于指稱診斷和預后標記物的用途時，術語“相關聯(lián)”是指將患者中標記物的存在或量，與其在已知患有給定病癥或已知具有給定病癥風險的人、或已知沒有給定病癥的人中的存在或量進行比較。正如上面討論的，可以將患者樣品中的標志物水平與已知與特定預后相關的水平進行比較。樣品的標志物水平被說成已經(jīng)與診斷相關聯(lián)；也就是說，專業(yè)技術人員可以使用標志物水平確定患者是否具有特定類型的診斷，并做出相應應答?？商孢x地，樣品的標志物水平可以與已知與良好結果(例如不存在疾病等)相關的標志物水平進行比較。在優(yōu)選實施方案中，標志物水平的分布情況與總體概率或特定結果相關聯(lián)。本發(fā)明還涉及用于將患者分層到風險組中的方法，所述方法包含上面描述的步馬聚ο本發(fā)明還涉及任何上述測定方法的應用，用于預測對象發(fā)生II型糖尿病的風險。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的方法中使用免疫測定法，其中使用至少一種抗和肽素抗體或其片段或重組變體來測定樣品中和肽素或其分子變體的水平。優(yōu)選情況下，至少一種抗和肽素抗體是單克隆抗體。優(yōu)選情況下，免疫測定法是夾心測定法，并且其中除了第一種抗和肽素抗體之外，還使用了第二種抗和肽素抗體來測定樣品中和肽素或其分子變體的水平。優(yōu)選情況下，至少一種所述抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明的范圍內還包括針對血管加壓素或其片段或其前體或所述前體的片段的捕獲探針的體外應用，用于預測表觀健康對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于診斷對象代謝綜合征。優(yōu)選情況下，捕獲探針針對位于pre-pro-AVP的U6-164位氨基酸中的一個或多個表位。本發(fā)明還涉及單克隆抗體或其片段或重組變體，其與表示pre-pro-AVP的第132-147位的肽中包含的表位結合。所述單克隆抗體的片段或重組變體顯示出所述單克隆抗體與pre-pro-AVP的至少80%的親和性。優(yōu)選情況下，所述單克隆抗體的片段或重組變體顯示出所述單克隆抗體與表示pre-pro-AVP的132-147位置的肽中包含的表位的至少80%的親和性。這是本發(fā)明的優(yōu)選先決條件，因為僅僅上面提到的片段或重組變體即可與單克隆抗體同樣有用地提供本發(fā)明的測定方法，所述測定方法所具有的總測定不精確性，在低于2.2pmol/L的濃度下為20%CV，在高于該濃度的正常范圍濃度下低于20%CV，和/或在低于9pmol/l的濃度下為10%CV，并且在高于該濃度的正常范圍濃度下低于10%CV。如果至少一種抗體是單克隆抗體或其表現(xiàn)出所述單克隆抗體與表示pre-pro-AVP的132-147位的肽中包含的表位的至少80%的親和性的片段或重組變體，則可以提供這種測定方法。本發(fā)明還涉及針對精氨酸加壓素激素原或其片段的捕獲探針的應用，用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于診斷代謝綜合征。優(yōu)選情況下，捕獲探針針對位于前血管加壓素原(pre-pro-AVP)的126-164氨基酸位置中的一個或多個表位。另一種情況下，本發(fā)明涉及任何上述測定方法或方法的應用，用于針對糖尿病、胰島素和/或代謝綜合征的預防性療法中。pre-pro-AVP的氨基酸序列提供在SEQIDNO:1中(圖1)。和肽素的氨基酸序列提供在SEQIDNO:2中(圖幻。和肽素可以被糖基化。Pre-pro-AVP是精氨酸加壓素激素原(pro-AVP，SEQIDNO:3，圖3)及其片段(包括精氨酸加壓素，后葉激素運載蛋白II和和肽素)的前體肽。除了pro-AVP之外，pre-pro-AVP還包含N-端19個氨基酸的信號序列。除非另有指明，否則本文中的所有序列指定是指pre-pro-AVP的序列。當在本文中提到時，“測定方法”或“診斷測定方法”可以是在診斷學領域中應用的任何類型的測定方法。這樣的測定方法可以基于待檢測被分析物與具有一定親和性的一種或多種捕獲探針的結合。對于捕獲分子與目標靶分子之間的相互作用來說，親和常數(shù)優(yōu)選大于IO8W10在本發(fā)明的文本中，“捕獲分子”是可用于結合來自樣品的目標靶分子、即被分析物(即在本發(fā)明的情況下是心血管肽)的分子。因此，捕獲分子必須在空間上和表面特征例如表面電荷、疏水性、親水性、路易斯供體和/或受體是否存在等方面適當塑造，以特異性結合目標靶分子。因此，結合可以由例如捕獲分子與目標靶分子之間的離子、范德華、JI-JI、δ-JI、疏水或氫鍵相互作用或兩種以上上面提到的相互作用的組合來介導。在本發(fā)明的情形中，捕獲分子可以例如選自核酸分子、糖類分子、RNA分子、蛋白質、抗體、肽或糖蛋白。優(yōu)選情況下，捕獲分子是抗體，包括其與目標靶或分子具有足夠親和性的片段，并包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體或其源自于變體鏈的長度為至少12個氨基酸的片段的化學和/或生物化學修飾的衍生物。優(yōu)選的檢測方法包括各種格式的免疫測定法，例如放射免疫測定法(RIA)、化學發(fā)光和熒光免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、基于Luminex的珠子陣列、蛋白質微陣列測定法，以及快速檢測格式例如免疫層析條樣試驗。測定法可以是均相或非均相測定法、競爭和非競爭性夾心測定法。在特別優(yōu)選的實施方案中，測定法采用夾心測定法形式，其是非競爭性免疫測定法，其中待檢測和/或定量分子與第一抗體并與第二抗體結合。第一抗體可以結合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或條上，并且第二抗體是例如用染料、放射性同位素或反應性或催化活性部分標記的抗體。然后通過適合的方法測量與被分析物結合的標記抗體的量。“夾心測定法”所涉及的通用組合物和步驟是已確立的，并為專業(yè)技術人員所公知。(《免疫測定手冊》(TheImmunoassayHandbook),DavidWildElsevierLTD，Oxford；第三片反(2005年5月)，ISBN-13:978-0080445267；HultschigC等，CurrOpinChemBiol.2006Feb；10(1):4-10.PMID:16376134)，在此引為參考。在特別優(yōu)選實施方案中，測定方法包含兩種捕獲分子，優(yōu)選為都作為分散相存在于液體反應混合物中的抗體，其中第一種標記組分附著在第一種捕獲分子上，其中所述第一種標記組分是基于熒光或化學發(fā)光淬滅或擴增的標記系統(tǒng)的一部分，并且所述標記系統(tǒng)的第二種標記組分附著于第二種捕獲分子上，使得當兩種捕獲分子與被分析物結合后產(chǎn)生可測量信號，允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心復合物。在更優(yōu)選情況下，所述標記系統(tǒng)包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或化學發(fā)光染料、特別是花青類型的染料的組合。在本發(fā)明的情形中，基于熒光的測定方法包含使用染料，所述染料可以例如選自FAM(5-或6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占噸、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯熒光素(HEX)、TET、6-羧基-4，，5，-二氯-2，，7，-二甲氧基熒光素(J0E)、N，N，N',N'-四甲13基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、5_羧基羅丹明_6G(R6G5)、6_羧基羅丹明-6G(RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、BODIPY染料例如BODIPYTMR、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯并亞胺類例如Hoechst33258；菲啶類例如德克薩斯紅、雅吉瓦黃、AlexaFluor、PET、溴化乙錠、吖啶類染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、嚇啉染料、聚甲炔染料等。在本發(fā)明的情形中，基于化學發(fā)光的測定方法包含根據(jù)化學發(fā)光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化學技術百科全書》(Encyclopediaofchemicaltechnology)H四片反，J.I.KroschwitzΜ.Howe-GrantJohnWiley&Sons，1993，vol.15，p.518-562中，在此引為參考，包括在551-562頁中的引用文獻。優(yōu)選的化學發(fā)光染料是吖啶酯。將其中測定方法包含單克隆和多克隆抗體的最優(yōu)選實施方案與包含兩種多克隆抗體的測定方法進行比較。為了比較性評估兩種測定方法的精確度，通過對具有各種和肽素濃度的22個人類血清樣品進行雙份測量，確定了測定的總不精確性。這些數(shù)據(jù)由6位不同操作人員在12次測定操作中產(chǎn)生，在兩個不同實驗室中使用2個不同批次的試劑。得到的精確性情況顯示在圖4和5中。對于多克隆/多克隆測定方法來說，在2.2pmol/L下獲得20%CV,在9pmol/L下獲得10%CV0相反，對于單克隆/多克隆測定方法來說，在0.75pmol/L下獲得20%CV，在2.9pmol/L下獲得10%CV。健康禁食女性在靜息時的和肽素濃度中位數(shù)已被報道是3.2pmol/L(BhandariSS,LokeI，DaviesJE，SquireIB,StruckJ,NgLL.“性別和腎功能影響健康個體中和肽素的血菜/K平，，(Genderandrenalfunctioninfluenceplasmalevelsofcopeptininhealthyindividuals),ClinSci(Lond).2008Jul22.[印刷版前的電子版])和3.7pmol/L(MorgenthalerNG,StruckJ,AlonsoC,BergmannΑ.“用于測量和肽素、一種源自于血管力口壓素前體的穩(wěn)定肽的測定方法”(Assayforthemeasurementofcopeptin,astablepeptidederivedfromtheprecursorofvasopressin),ClinChem.2006Jan；52(1)112-9)。在本文的分析中，在3.2pmol/L下的總測定不精確性被確定為對于多克隆/多克隆測定方法來說是15%，而對于單克隆/多克隆測定方法來說使9.5%。因此，顯然單克隆/多克隆測定方法更適合于評估正常群體中的和肽素水平。兩種測定方法在下面詳細描述測定方法1(多克隆/多克隆)采用化學發(fā)光/包被管格式的和肽素的測定按照描述進行(MorgenthalerNG,StruckJ,AlonsoC,BergmannΑ.“用于測量和肽素、一種源自于血管加壓素前體的穩(wěn)定月太的測定方法”(Assayforthemeasurementofcopeptin,astablepeptidederivedfromtheprecursorofvasopressin),ClinChem.2006Jan；52(1):112_9)。簡單來說，將管用針對表示前血管加壓素原的132-147位置的肽產(chǎn)生的純化的綿羊多克隆抗體進行包被Oμg/管)。針對表示前血管加壓素原的149-164位置的肽產(chǎn)生的純化的綿羊多克隆用MACN-吖啶-N-羥基琥珀酰亞胺-酯標記并用作示蹤劑。將表示pre-pro-AVP的132-164位置的肽在正常馬血清中稀釋，用作標準品。免疫測定法通過將50μ1樣品/標準品與200μ1示蹤劑在包被管中在室溫下溫育2小時來進行。將管用ImlLUMItest清洗溶液(B.R.Α.H.Μ.S.AG,HennigsdorfGermany)清洗4次，并使用LB952T照度計(Berthold,BadWildbachGermany)測量結合的化學發(fā)光。雕誠2(1械械)產(chǎn)生了單克隆抗體094/1A7)，其具有位于前血管加壓素原132-147相應位置中的和肽素中的表位。抗體使用標準程序按照描述產(chǎn)生(HarlowΕ,LaneD，《抗體實驗指南》(Antibodies-ALaboratoryManua)，ColdSpringHarborLaboratory,148頁ff，ISBN0-87969-314-。簡單來說，將表示前血管加壓素原的132-164位置的化學合成并在N-端延伸了附加的半胱氨酸殘基的肽，使用Sulfo-MBS交聯(lián)劑與BSA偶聯(lián)。使用該偶聯(lián)物對Balb/c小鼠進行免疫接種并加強。將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞系融合，并通過其分泌識別覆蓋前血管加壓素原的132-147位置的肽的抗體的能力，篩選產(chǎn)生抗和肽素抗體的雜交瘤細胞。將陽性篩選到的雜交瘤細胞重新克隆，產(chǎn)生了幾個雜交瘤細胞系，它們中的一個產(chǎn)生單克隆抗體^4/1Α7，其被進一步使用。使用單克隆抗體代替在上面描述的多克隆/多克隆測定方法中使用在固相上的多克隆抗體。所有其他測定方法組分和測定方法的執(zhí)行與上面描述的多克隆/多克隆測定方法相比沒有改變。使用本發(fā)明的方法和測定法，能夠確定對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險。在其他情況下，優(yōu)選與其他臨床和/或實驗室參數(shù)組合，可以在對象中進行代謝綜合征的診斷。從本發(fā)明的方法和測定法的結果，可以為對象選擇適合的治療或預防策略。具有發(fā)生代謝綜合征和/或糖尿病的高風險的對象，被建議改變其生活方式，例如適度減少其每日卡路里攝入量、改變膳食組成和/或增加體力活動。由本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的對象樣品中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平與其發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險之間的關聯(lián)性，表明了血管加壓素系統(tǒng)在葡萄糖體內平衡和糖尿病發(fā)展中的作用。血管加壓素(及其激素原及其片段)的水平升高與糖尿病和代謝綜合征相關。血管加壓素的效應具體來說可能通過Vlb受體(VlbR)介導。因此，本發(fā)明還涉及通過抑制VlbR受體來治療或預防代謝綜合征和/或糖尿病。本發(fā)明涉及VlbR拮抗劑在代謝綜合征和/或糖尿病的治療和/或預防中的應用。特別優(yōu)選的VlbR拮抗劑可以選自抗體和小分子?？赡艿腣lbR接抗體可以在專業(yè)技術人員已知的結合測定法中，通過例如使用放射性受體測定法鑒定其IC5tl值來鑒定。附圖描述圖1:pre-pro-AVP的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。Ml:CT-pro-AVP(和肽素)的氨基酸序列(SEQIDNO2)。Ml:pro-AVP的氨基酸序列(SEQIDNO3)。Si:多克隆/多克隆抗體和肽素測定方法的精確性情況。將測定間變差系數(shù)(CV[%])對和肽素濃度[pmol/L]進行作圖。分別標出了使用10%和20%CV測定的和肽素濃度。圖5單克隆/多克隆抗體和肽素測定方法的精確性情況。將測定間CV[%]對和肽素濃度[pmol/L]進行作圖。分別標出了使用10%和20%CV測定的和肽素濃度。S6高血漿和肽素與糖尿病獨立相關。將糖尿病的OR對和肽素水平的四分位數(shù)進行作圖。對下列因素進行了調整年齡、性別、TG、HDL、SBP、DBP、ΑΗΤ、BMI、腰圍、W/H、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、CRP、以前的CVD。Ml高血漿和肽素是將來糖尿病的獨立預測因子(已知患有糖尿病或基線時FBG>6.OmM的對象被排除)。效果不依賴于基線葡萄糖。將易發(fā)生糖尿病的OR對和肽素水平的四分位數(shù)進行作圖。對下列因素進行了調整年齡、性別36、皿1^、58、08^!11\810、腰圍、W/H、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、CRP、以前的CVD、吸煙、糖尿病遺傳、fP-胰島素和fB-葡萄糖。M8高血漿和肽素是將來糖尿病的獨立預測因子(已知患有糖尿病或基線時FBG>5.4mM的對象被排除)。效果不依賴于基線葡萄糖，并且在排除ire后保持增強。將發(fā)生糖尿病的OR對和肽素水平的四分位數(shù)進行作圖。對下列因素進行了調整年齡、性別、TG、HDL、SBP、DBP、AHT、BMI、腰圍、W/H、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、CRP、以前的CVD、吸煙、糖尿病遺傳、fP-胰島素和fB-葡萄糖。M9使用a)年齡、性別、BMI和DM遺傳的組合以及b)向該組合中添加和肽素來預測將來糖尿病的ROC圖。使用a)年齡、性別、SBP、BMI、腰圍、葡萄糖、TG、HDL和DM遺傳的組合以及b)向該組合中添加和肽素來預測將來糖尿病的ROC圖。Mll在非糖尿病對象(n=4377)中禁食血糖水平(mmol/L)與使用95%置信區(qū)間下的平均值表示的增加的血漿和肽素的四分位數(shù)相關。P(線性趨勢)<0.001。MI2在非糖尿病對象(n=4377)中禁食胰島素葡萄糖水平(mU/L)與使用95%置信區(qū)間下的平均值表示的增加的血漿和肽素的四分位數(shù)相關。P(線性趨勢)<0.001。實施例實施例1臨床研究Malm0飲食與癌癥研究(TheMalmSDietandCancerstudy)(MDC)是基于群體的前瞻性組群，由1991-1996年間接受調查的28，449人構成。從該組群中，隨機選擇6103人進行頸動脈疾病的流行病學研究，其被稱為MDC心血管組群(MDC-CC)。在MDC-CC的M05個對象中獲得禁食血漿樣品。在這些對象中，4742個個體中的協(xié)變量完整數(shù)據(jù)可用，包括糖尿病的已知風險因子、潛在的混淆物以及血漿中的和肽素(P-和肽素)(表1)。基線檢查時的糖尿病被定義為自己報告的醫(yī)生診斷、或使用抗糖尿病藥物或禁食血糖(FBG)^6.lmmol/L.所有血漿和血液分析在過夜禁食的樣品中進行。FBG通過己糖激酶-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶方法在全血中測量。LDL膽固醇按照Friedewald的公式計算。在儲存于-80°C的禁食血漿樣品中，我們使用上面描述的測定方法2(單克隆/多克隆)測量和肽素。C-反應蛋白(CRP)通過高靈敏度測定法測量(Tina-quantCRP,RocheDiagn0StiCS，BaSel，SWitzerland)。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C使用粒子增強的免疫濁度測定法(NLatexCystatinC,DadeBehring,IL)測量。在仰臥位休息10分鐘后使用水銀柱血壓計測量血壓。吸煙由自己提供的調查問卷引出，其中當前吸煙被定義為在過去一年中的任何吸煙。以前的心血管疾病被定義為在基線檢查之前存在心肌梗塞或中風。糖尿病遺傳由調查問卷引出，并被定義為在至少一個一級親屬中具有已知糖尿病。在基線檢查后直到2007年6月的新發(fā)糖尿病通過三個登記中心查定(1)位于MalmG大學醫(yī)院臨床化學科的MalmGHbAlc登記中心(MHR)，其分析并分類從1990年及以后在大Malm6地區(qū)的學術和非學術護理中獲得的所有HbAlc樣品。在MHR中，如果個體使用瑞典Mono-S標準化系統(tǒng)時具有至少兩次>6.0%的HbAlc記錄，相當于根據(jù)美國國itlim&M自t示}tu雙目(USNationalGlycohemoglobinStandardizationProgram)(NGSP)m7.0%,或至少三次彡5.5%HbAlc記錄(相當于根據(jù)NGSP的6.5%)，則他們被定義為患有糖尿病。(2)瑞典國家糖尿病登記中心(TheSwedishNationalDiabetesRegister)(NDR)，其始于1996年，并在2007年覆蓋瑞典所有糖尿病患者的約50%；(3)Scania地區(qū)的地方登記中心，Malmo是該地區(qū)的主要城市(糖尿病2000登記中心)(LindholmE，EurJEpidemiol200117:983-989)，其始于2000年，并在2001年覆蓋Scania地區(qū)所有糖尿病患者的約25%。在基線檢查前沒有出現(xiàn)在三個登記中心的任一個中，在MDC-CC中基線檢查時按照我們的判據(jù)沒有糖尿病(即沒有自己報告的醫(yī)生診斷的糖尿病史，沒有抗糖尿病治療，基線檢查時FBG<6.Ommo1/L)，并且在MDC-CC中基線檢查后直到2007年6月的任何時間作為糖尿病患者登記在NDR或糖尿病2000登記中心中，或滿足我們在MHR中基于HbAlc的糖尿病判據(jù)的對象，被分類為新發(fā)糖尿病人。研究方案得到Limd大學倫理委員會的批準。所有參加者提供了書面知情同意書。統(tǒng)計學對于所有計算使用了SPSS統(tǒng)計學軟件(14.0版)。連續(xù)變量中的整組式差異，如果正態(tài)分布使用student'st-檢驗進行檢驗并報告為平均值士SD，而如果不是正態(tài)分布則使用Marm-Whitney檢驗進行檢驗，并報告為中位數(shù)和四分位數(shù)間范圍。二歧變量中的差異使用卡方檢驗進行檢驗。在非糖尿病對象中禁食葡萄糖和胰島素的線性趨勢高于P-和肽素四分位數(shù)的P-值，使用轉換為自然對數(shù)的禁食胰島素濃度進行線性回歸進行評估。我們使用了原始和多變量調整過的邏輯回歸來測試在整個組群中(n=4742)，Ρ-和肽素四分位數(shù)的增加(Ql和肽素-Q4和肽素、Ql和肽素是參比類別)是否與基線時的糖尿病相關。在基線時沒有糖尿病的對象中(n=4377)，原始和多變量邏輯回歸被用于測試P-和肽素四分位數(shù)的增加(Ql和肽素-Q4和肽素、Ql和肽素是參比類別)是否與被定義為屬于禁食胰島素的最高四分位數(shù)的胰島素、以及與新發(fā)糖尿病相關。最后，在禁食葡萄糖沒有受損的對象中(禁食血漿葡萄糖6.lmmol/L,對應于FBG<5.5mmol/L)(η=3702)，檢驗了P-和肽素四分位數(shù)的增加與新發(fā)糖尿病風險之間的關聯(lián)。來自邏輯回歸分析的數(shù)據(jù)被表示成機會比(OR)和95%置信區(qū)間(Cl)。雙邊P-值<0.05被認為是統(tǒng)計學顯著的。為了評估P-和肽素在預測新發(fā)糖尿病中的靈敏度和特異性高于經(jīng)典的糖尿病預測因子組，我們使用個人模型(年齡、性別、BMI和糖尿病遺傳)和臨床模型(個人模型+收縮壓、甘油三酯、HDL、腰圍和FBG)，在兩種模型的每個中加入和不加入P-和肽素，對受試者工作特征(ROC)曲線下的面積進行了比較。結果在基線檢查時患有糖尿病的患者(n=365)中，只有報告了醫(yī)生診斷的糖尿病或治療史，而大多數(shù)(71%)根據(jù)基線檢查時FBG彡6.lmmol/L被分類為患有糖尿病。在患有糖尿病的患者中，與非糖尿病對象相比P-和肽素較高(表1)。在群體的非糖尿病人部分中，F(xiàn)BG隨著和肽素而增加(圖11)。在原始模型和對除了禁食血漿胰島素濃度之外在糖尿病患者與對照之間的單變量比較中顯著不同的所有基線特征(表1)進行調整后的模型(模型1調整)兩者中，隨著和肽素四分位數(shù)的增加，糖尿病的OR逐漸增加(表2)(圖176)。在非糖尿病對象中，胰島素的血漿濃度隨著P-和肽素的四分位數(shù)逐漸增加(圖12)，并且在原始分析和包括模型1的協(xié)變量和FBG的擴展的模型1調整后兩者中，胰島素抗性的OR(在群體的非糖尿病人部分種禁食血漿胰島素的最高四分位數(shù))隨著P-和肽素增加(表2)。在基線時沒有糖尿病的對象中，四分位數(shù)邊界處的和肽素濃度如下Q1/Q23.13pmol/L,Q2/Q3:5.05pmol/L,Q3/Q4:7.94pmol/L。在跟蹤中，在基線時沒有糖尿病的對象中(n=4377)，174位對象發(fā)展出新發(fā)糖尿病，在基線時沒有受損的禁食葡萄糖的對象(n=3702)中，79位對象發(fā)展出新發(fā)糖尿病(表3)。在發(fā)展出新發(fā)糖尿病的對象中，與不屬于基線時無糖尿病對象和基線時無受損禁食葡萄糖對象兩者的對象相比，基線時的P-和肽素明顯更高(表3)。在基線時無糖尿病對象(圖7)和無受損禁食葡萄糖對象(圖8)兩者中，在原始分析中以及對模型1進行協(xié)變量和禁食胰島素、FBG、吸煙、糖尿病遺傳和LDL進行調整后，發(fā)生新發(fā)糖尿病的概率隨著P-和肽素四分位數(shù)而增加(表4)。在基線時無糖尿病對象中，當將和肽素添加到糖尿病預測的個人模型和臨床模型中時，用于預測將來糖尿病的受試者工作特征(ROC)曲線下面積分別從69.4增加至71.0%(P=O.08)和從83.2增加至84.1%(P=O.007)。在基線時無受損禁食葡萄糖的對象中，當將和肽素添加到用于糖尿病預測的個人模型和臨床模型時，用于預測將來糖尿病的ROC曲線下面積分別從66.3增加至71.3%(P=0.03)(圖9)和從78.3增加至80.5%(P=0.04)(圖10)。討論這里，我們在基于大型群體的組群中證實，在糖尿病患者中P-和肽素顯著升高，并且在非糖尿病對象中、即在具有肯定不影響重量克分子滲透壓濃度的FBG水平的對象中，P-和肽素隨著FBG線性增加。在非糖尿病對象中，在P-和肽素與胰島素抗性(通過禁食血漿胰島素所估算的)之間存在強的分類排列關系，并且這些關系不依賴于大量混淆性因子，包括FBG。此外，在跟蹤過程中，基線時的P-和肽素是發(fā)生新發(fā)糖尿病的強的風險因子。重要的是，這種關系不依賴于基線時廣范圍的公知糖尿病風險因子，包括FBG和禁食胰島素，后兩者與P-和肽素具有強的分類排列關系。當組群限于無受損禁食葡萄糖的對象時，P-和肽素與新發(fā)糖尿病之間的關系被加強，盡管事實上幾乎一半的新發(fā)糖尿病病例發(fā)生在基線時具有受損禁食葡萄糖的對象中。正如所預計的，F(xiàn)BG是新發(fā)糖尿病的最強風險因子。在完全調整過的模型中，基線時FBG每lmmol/L的增加使將來糖尿病的風險增加，其OR為11.4(95%CI7.4-17.(表4)。牢記這一點，令人印象深刻的是在無受損禁食葡萄糖的對象中，在完全調整基線協(xié)變量包括FBG后，和肽素的最高比最低四分位數(shù)與新發(fā)糖尿病的3.6的OR相關(表4)。重要的是，在無受損禁食葡萄糖的對象中，當向經(jīng)典的糖尿病風險因子模型添加P-和肽素時，存在ROC曲線下面積的2.2-4.0%的顯著增加，表明P-和肽素改進了糖尿病的個體風險預測的靈敏度和特異性。在包含具有受損禁食葡萄糖的對象的較大樣品中，P-和肽素對ROC曲線下面積的增加不太顯著。在包含具有較高FBG水平的對象(即具有受損的禁食葡萄糖的對象)的分析中ROC曲線下面積的較少增加，可能是由于FBG在FBG水平接近6.lmmol/L的診斷限度時是更有力的糖尿病預測因子，而對糖尿病沒有診斷性的標志物例如P-和肽素，可能在更早的糖尿病前狀態(tài)中更好地傳遞糖尿病易感性的信號。重要的是，在具有正常FBG的對象中，新的風險標志物作為將來糖尿病風險的篩選工具更加重要，因為由于高FBG的公知的強糖尿病預測價值，具有受損禁食葡萄糖的對象無論如何通常受到旨在預測糖尿病的醫(yī)療關注。因此，我們的發(fā)現(xiàn)表明，向已建立的用于預測糖尿病的篩選工具添加P-和肽素，可能具有臨床價值。我們沒有關于新發(fā)糖尿病的亞型的數(shù)據(jù)，但是，由于在我們的群體中非糖尿病人部分的平均年齡為57歲以及P-和肽素與胰島素抗性之間的強的分類排列關系，我們推測P-和肽素的升高指示2型糖尿病而不是1型糖尿病的風險。除了與糖尿病預測有關聯(lián)之外，我們的發(fā)現(xiàn)表明了AVP系統(tǒng)在糖尿病的病理生理學中的作用，并可能用于開發(fā)新的抗糖尿病治療方案。動物研究已經(jīng)顯示，缺少VlaR(VlaR-/")的小鼠顯示出升高的AVP水平、葡萄糖不耐受性和胰島素抗性，而缺少VlbR(VlbR-/")的小鼠獲得相反表型，具有較低的FBG和升高的胰島素敏感性。基于這些動物數(shù)據(jù)和我們自己發(fā)現(xiàn)的高P-和肽素與升高的FBG、胰島素抗性和將來糖尿病的升高的風險之間的關聯(lián)性，可以推斷，作為VlaR水平上AVP抗性或其他情況的結果而升高的AVP，通過刺激VlbR而造成胰島素抗性和糖尿病。事實上，V2R的藥理學阻斷這種通過對下丘腦-神經(jīng)垂體軸的負反饋增加AVP分泌的有力刺激，與患有低鈉血癥的患者中在用托伐普坦進行的30天治療期間高血糖事件增加5倍有關。因此，AVP的升高，無論其下潛伏的機制如何，都可能通過刺激VlbR造成葡萄糖體內平衡受損。這些發(fā)現(xiàn)為在人類中研究AVP系統(tǒng)的藥理學操作與葡萄糖代謝的關系提供了正當理由。在MDC-CC中新發(fā)糖尿病病例的數(shù)量可能似乎低于預期。有三個重要原因最可能解釋這種現(xiàn)象。(1)在MDC研究中的參與率只有40%，結果，MDC群體與背景群體相比較為健康并包括不成比例的更多女性(Manjer2001)。結果，我們描述的P-和肽素與新發(fā)糖尿病之間的關系可能被低估了。(我們在三個登記中心觀察到的糖尿病發(fā)病率是基于人們主動尋求健康護理這一先決條件而不是基于葡萄糖水平的群體篩選，導致與通過測量FBG進行的常規(guī)糖尿病篩查研究中所觀察到的相比發(fā)病率較低。此外，與我們對新發(fā)糖尿病的定義相反，MDC-CC在基線檢查時的糖尿病定義包括測量FBG。事實上，在被定義患有糖尿病的對象中，71%沒有報告糖尿病或抗糖尿病治療史，而是僅僅根據(jù)FBG進行診斷。排除這些在基線檢查前沒有意識到他們患有糖尿病的大量糖尿病患者，進一步顯著降低了跟蹤期間新發(fā)糖尿病的發(fā)病率。(3)盡管存在上面討論的問題，但我們的研究可能漏掉了許多事實上在衛(wèi)生護理系統(tǒng)中被診斷具有糖尿病的新發(fā)病例。MHR記錄從1990年及以后在大MalmS地區(qū)的所有HbAlc值，但是，我們錯過了在大Malm5地區(qū)被診斷為糖尿病但是沒有測量HbAlc或如果HbAlc僅僅測量了一次或如果在重復的情形中它只或多或少升高的病例。作為在MDC-CC基線檢查后搬出大Malm5地區(qū)的結果而不能在MHR中檢測到的新發(fā)糖尿病，將有相當大的機會被全國范圍的NDR和/或地區(qū)性糖尿病2000登記中心檢測到，特別是被NDR檢測到，因為該登記中心據(jù)估計覆蓋了2007年瑞典所有糖尿病患者的50%。然而，NDR和糖尿病2000登記中心的覆蓋率仍是不完全的。出于這些原因，我們將未知數(shù)量的事實上在跟蹤期間發(fā)生糖尿病的對象分類為非糖尿病人。另一方面，由于在MHR用于新發(fā)糖尿病的嚴格的HbAlc判據(jù)以及NDR和糖尿病2000登記中心的已被證明的有效性，我們對被我們分類為新發(fā)糖尿病病例的對象的終點的有效性充滿信心?；诘怯浿行牡男掳l(fā)糖尿病診斷的有效性得到下述事實的進一步支持，即在這些對象中，與根據(jù)三個登記中心沒有發(fā)生糖尿病的對象相比，在MDC-CC基線時大多數(shù)公知的糖尿病風險因子顯著升高(表3)。重要的是，當研究群體被限于在基線時無受損禁食葡萄糖的對象時，這些差異同樣確定，這排除了我們關于已確定的糖尿病風險因子和P-和肽素與新發(fā)糖尿病的關聯(lián)性的發(fā)現(xiàn)，僅僅由在MDC-CC基線檢查時幾乎具有糖尿病FBG的對象所造成這種可能性?？偠灾?，P-和肽素獨立于大范圍的已確定的糖尿病風險因子包括禁食葡萄糖和胰島素水平，來預測糖尿病。我們的發(fā)現(xiàn)表明了AVP系統(tǒng)在糖尿病發(fā)生中的作用，并可能與風險評估和新的抗糖尿病藥物療法有關聯(lián)。表1、患有和未患糖尿病的對象的基線特征權利要求1.一種用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于鑒定具有發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的高風險的對象，或用于診斷對象代謝綜合征的方法，其中所述對象是非糖尿病人，所述方法包含下列步驟a.提供來自所述對象的樣品，b.測定所述樣品中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平，c.使用精氨酸加壓素激素原或其片段的所述水平預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的可能性，或用于從其推斷出所述對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于診斷所述對象的代謝綜合征。2.權利要求1的方法，其中所述對象是表觀健康的。3.權利要求1到2的方法，其中所述對象是禁食血糖低于6.lmmol/L但高于5.4mmol/L的非糖尿病人。4.權利要求1到2的方法，其中所述對象是禁食血糖低于5.4mmol/L的對象。5.權利要求1-4的方法，其中確定對象發(fā)生II型糖尿病的風險。6.權利要求1到5的方法，其中對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險的預測或代謝綜合征的診斷，通過附加地測定并使用至少一種實驗室參數(shù)或其他標志物的水平來改進，所述其他標志物選自禁食血液或血漿葡萄糖、甘油三酯、HDL膽固醇或其亞級分、LDL膽固醇或其亞級分、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、胰島素、CRP、A型和B型利尿鈉肽以及包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP,proBNP、NT-proBNP的它們的前體及其片段、⑶F15、ST2、降鈣素原及其片段、腎上腺髓質素原及其包括ADM、PAMP、MR-proADM、CT-proADM的片段、內皮素原-I及其包括CT-proET-l、NT-proET-l、大內皮素-1和內皮素_1的片段。7.權利要求1到6的方法，其中附加地測定選自下列的至少一種臨床參數(shù)年齡、性別、收縮壓、舒張壓、抗高血壓治療(AHT)、體重指數(shù)、腰圍、腰臀比、當前吸煙、糖尿病遺傳性和以前的心血管疾病(CVD)。8.前述權利要求任一項的用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于鑒定具有發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的高風險的對象，或用于診斷對象代謝綜合征的方法，其中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平單獨地或與其他預后有用的實驗室或臨床參數(shù)組合，通過可以選自下列可選方案的方法，用于預測對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險或用于診斷代謝綜合征-與表觀健康對象群體中全部預定樣品中的精氨酸加壓素激素原或其片段的水平的中位數(shù)進行比較，-與表觀健康對象群體中全部預定樣品中的精氨酸加壓素激素原或其片段的水平的分位數(shù)進行比較，-根據(jù)Cox比例風險分析或使用風險指數(shù)計算例如NRI(凈重新分類指數(shù))或IDI(綜合鑒別指數(shù))進行計算。9.前述權利要求任一項的方法，其中樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品和尿液樣品，或任何上面提到的樣品的提取物。10.前述權利要求任一項的方法，其中通過診斷測定方法、優(yōu)選通過免疫測定法測定精氨酸加壓素(AVP)激素原或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平。11.前述權利要求任一項的方法，其中測定和肽素或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平。12.一種用于診斷對象代謝綜合征的方法，所述方法包括下列步驟a.提供來自所述對象的樣品，b.測定所述樣品中精氨酸加壓素激素原或其片段的水平，c.測定與代謝綜合征的診斷相關的其他臨床和/或實驗室參數(shù)，d.將與代謝綜合征的診斷相關聯(lián)的其他臨床和/或實驗室參數(shù)聯(lián)合的精氨酸加壓素激素原或其片段的水平與代謝綜合征的診斷相關聯(lián)。13.一種用于測定樣品中和肽素水平的測定方法，其中測定方法所具有的總測定不精確性，在低于2.2pmol/L的濃度下為20%CV,在高于2.2pmol/L的正常范圍濃度下低于20%CV，和/或在低于9pmol/l的濃度下為10%CV，并且在高于9pmol/l的正常范圍濃度下低于10%CV。14.一種用于測定樣品中和肽素水平的測定方法，其中測定方法在健康禁食女性白人群體靜息時的血清或血漿中測定到的中位數(shù)和肽素濃度下，具有最大12%的總測定不精確性。15.權利要求13或14任一項的用于測定樣品中和肽素水平的測定方法，其中測定方法包含兩種抗和肽素抗體，其中至少一種抗體是單克隆抗體或其片段或重組變體。16.一種用于測定樣品中和肽素水平的測定方法，其中測定方法包含兩種抗和肽素抗體，其中至少一種抗體是單克隆抗體或其片段或重組變體。17.權利要求15或16任一項的用于測定樣品中和肽素水平的測定方法，其中測定方法包含兩種抗和肽素抗體，其中至少一種抗體是單克隆抗體或其片段或重組變體，其與表示前血管加壓素原的第132-147位的肽中包含的表位結合。18.權利要求16或17任一項的測定方法，其中測定方法包含單克隆抗和肽素抗體或其片段或重組變體以及多克隆抗和肽素抗體或其片段變體。19.權利要求13到18的測定方法用于預測對象發(fā)生糖尿病的風險的應用。20.免疫測定法用于權利要求1到12的方法的應用，其中使用至少一種抗和肽素抗體或其片段或重組變體來測定樣品中和肽素或其分子變體的水平。21.權利要求20的免疫測定法的應用，其中免疫測定法是夾心測定法，并且其中使用第二種抗體來測定樣品中和肽素或其分子變體的水平。22.針對血管加壓素或其片段或其前體或其片段的捕獲探針用于預測表觀健康對象發(fā)生糖尿病和/或代謝綜合征的風險，或用于診斷代謝綜合征的應用。23.一種單克隆抗體或其片段或重組變體，其與表示前血管加壓素原的第132-147位的肽中包含的表位結合。24.單克隆抗體或其片段或重組變體，當以夾心格式使用在權利要求13到18的測定方法中時，導致總測定不精確性在低于2.2pmol/L的濃度下為20%CV，在高于2.2pmol/L的正常范圍濃度下低于20%CV，和/或在低于9pmol/l的濃度下為10%CV,并且在高于9pmol/l的正常范圍濃度下低于10%CV。25.VlbR拮抗劑，其用于預防代謝綜合征和/或糖尿病。26.權利要求25的VlbR拮抗劑，其中VlbR拮抗劑選自抗體和小分子。全文摘要本發(fā)明的主題是用于預測對象發(fā)生代謝綜合征和/或糖尿病的風險和用于診斷代謝綜合征的測定方法和體外方法，其包含測定對象樣品中的精氨酸加壓素激素原或其片段的水平。文檔編號G01N33/68GK102317788SQ200980143882公開日2012年1月11日申請日期2009年10月29日優(yōu)先權日2008年10月31日發(fā)明者克里斯托弗·牛頓-陳,奧勒·米蘭德,安德烈亞斯·貝格曼,托馬斯·J·王,約阿希姆·斯特魯克申請人:B.R.A.H.M.S有限公司,通用醫(yī)療公司