專利名稱：流式微球檢測(cè)人心肌鈣蛋白t的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物物質(zhì)的分析方法，具體來(lái)說(shuō)，屬于流式細(xì)胞分析中的流式微球分 析技術(shù)方法。
背景技術(shù)：
心肌肌鈣蛋白是目前診斷心肌損傷、壞死時(shí)特異度最高和敏感性較高的生物標(biāo)志 物，在急性冠脈綜合征(ACS)的危險(xiǎn)分層中也有重要的應(yīng)用價(jià)值，是檢測(cè)心肌損傷和壞死 的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前，檢測(cè)人心肌鈣蛋白T的方法主要有1.免疫金標(biāo)法，能進(jìn)行快速定性 或半定量；2.電化學(xué)發(fā)光法，靈敏(最低檢測(cè)限10pg/mL)、精密，但試劑成本高，需價(jià)值昂 貴的電化學(xué)發(fā)光儀；3.免疫比濁法，實(shí)用、方便、快速、成本低，但是影響因素較多，如抗原 或者抗體過(guò)量，可以出現(xiàn)可溶性復(fù)合物，造成誤差，標(biāo)本中血脂含量影響濁度，造成假性增 高，不利于檢驗(yàn)方法的統(tǒng)一和比對(duì)；其它方法，如放免、酶免等，實(shí)用性差。目前臨床上檢測(cè) 人心肌鈣蛋白T方法眾多，也有一些專利技術(shù)方案，例如200720140932. 1號(hào)“人肌紅蛋白/ 肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙”、200720140929. X號(hào)“心肌鈣蛋白I顏色顆粒診 斷試紙”、200780010683. 7號(hào)“在有癥狀的患者中鑒別急性和慢性心肌壞死的工具和方法”、 200810036418. 2號(hào)“肌鈣蛋白I血清快速檢測(cè)試劑盒(膠體金法)”等，但都存在著標(biāo)準(zhǔn)化 問(wèn)題。流式細(xì)胞分析是以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或 微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(或微粒)的物理、生化、免疫、 遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能定性或定量檢測(cè)的一種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。流式微球分析技 術(shù)是使用單克隆抗體包被聚苯乙烯微球，捕獲檢測(cè)物，再加入熒光檢測(cè)抗體，具有敏感性 高，特異性強(qiáng)，最低檢測(cè)限可以達(dá)到10pg/ml。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供流式微球檢測(cè)人心肌鈣蛋白T的方法，實(shí)現(xiàn)在流式細(xì)胞儀 檢測(cè)微球上的熒光強(qiáng)度來(lái)間接檢測(cè)標(biāo)本中人心肌鈣蛋白T的含量。發(fā)明人提供的流式微球檢測(cè)人心肌鈣蛋白T的方法包括3個(gè)步驟，即先進(jìn)行微球 激活，再單克隆抗體偶聯(lián)，最后進(jìn)行人心肌鈣蛋白T的檢測(cè)；具體做法是激活微球后，制備 羧基化微球偶聯(lián)鼠抗人心肌鈣蛋白T的單克隆抗體，然后捕獲標(biāo)本中的人心肌鈣蛋白T， 再加入羊抗人肌鈣蛋白τ的多抗和FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的驢抗羊的免疫球蛋白 G(IgG)，F(xiàn)ITC的強(qiáng)度與微球捕獲的人心肌鈣蛋白T的分子數(shù)成線性相關(guān)。因此，通過(guò)在流 式細(xì)胞儀上檢測(cè)微球上FITC的熒光強(qiáng)度，即可間接檢測(cè)標(biāo)本中人心肌鈣蛋白T的含量。本發(fā)明的方法可將單抗偶聯(lián)微球、羊抗人心肌鈣蛋白T的多克隆抗體、異硫氰酸 熒光素標(biāo)記的驢抗羊的IgG制成商品試劑盒，隨時(shí)可對(duì)人心肌鈣蛋白T進(jìn)行檢測(cè)。本方法 簡(jiǎn)便易行，能夠快捷地檢測(cè)人心肌鈣蛋白T，為診斷疾病提供依據(jù)。適用于各類醫(yī)院，尤其適 用于治療心血管病癥的醫(yī)院。
具體實(shí)施例方式按照以下步驟檢測(cè)人心肌鈣蛋白T 第一步微球激活①取100 μ L微球原液(約1. 25 X IO6個(gè)微球)放入1. 5mL離心管里，漩渦振蕩器 震蕩微球30s，用超聲波清洗器清洗微球30s。轉(zhuǎn)速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心 4min，小心棄上清； ②加入100 μ L的微球洗滌緩沖液[ρΗ 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的5%土 溫-20]，漩渦震蕩10s，超聲波清洗10s，轉(zhuǎn)速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小 心棄上清；③重懸微球于80 μ L激活緩沖液(0. ImoVLNaH2PO4, ρΗ = 6. 2)，漩渦震蕩30s，超 聲波清洗30s ；④用激活緩沖液配置新鮮的50mg/mL的EDC(1_乙基_3-(3_ 二甲氨基丙基)碳二 亞胺鹽)和50mg/mL的Sul fo-NHS (硫化N-羥基琥珀酰亞胺)，然后在激活的微球里分別 各加入10 μ L，室溫避光搖震20min ；⑤加入150 μ L PBS，高速漩渦震蕩10s，轉(zhuǎn)速14000r/mi η (離心半徑IOcm)下離 心4min，小心棄上清；⑥重懸激活微球于100 μ L PBS中，漩渦震蕩30s，超聲波清洗15s。第二步單克隆抗體偶聯(lián)①加入10 μ g的鼠抗人心肌鈣蛋白T單克隆抗體到激活的微球里，用PBS調(diào)節(jié)最 終體積至500 μ L，室溫避光搖震2h ；②轉(zhuǎn)速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；③加入500 μ L PBS，轉(zhuǎn)速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；④重懸微球于250 μ L封閉儲(chǔ)存緩沖液(PBS配制的1 %苯磺酰胺和0. 05% NaN3)， 漩渦震蕩15s，室溫避光搖震30min ；⑤轉(zhuǎn)速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；⑥加入500 μ L封閉儲(chǔ)存緩沖液(PBS配制的苯磺酰胺和0.05% NaN3)，轉(zhuǎn)速 14000r/min (離心半徑IOcm)下離心6min，小心棄上清；⑦重懸于200 μ L封閉儲(chǔ)存緩沖液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的濃度，4°C下避光 保存?zhèn)溆谩４藛慰古悸?lián)微球可批量生產(chǎn)，在低溫(4°C左右)避光可長(zhǎng)期保存。第三步人心肌鈣蛋白T的檢測(cè)①取約10000個(gè)包被好的微球，加入50 μ L標(biāo)本，再分別加入50 μ L羊抗人心肌鈣 蛋白T的多克隆抗體和50 μ L FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的驢抗羊的IgG，避光室溫?fù)u震 反應(yīng)30min ；②轉(zhuǎn)速14000r/min (離心半徑IOcm)下離心4min，小心棄上清；③加入200 μ L緩沖液(PBS配制的％苯磺酰胺)，漩渦震蕩重懸，轉(zhuǎn)速14000r/ min (離心半徑IOcm)下離心4min,小心棄上清；④再加入200 μ L緩沖液(PBS配制的％苯磺酰胺)，漩渦重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀測(cè)微球上FITC的熒光強(qiáng)度，即可間接檢測(cè)標(biāo) 本中人心肌鈣蛋白T的含量。
權(quán)利要求
1.流式微球檢測(cè)人心肌鈣蛋白T的方法，其特征包括3個(gè)步驟，即先進(jìn)行微球激活，再 單克隆抗體偶聯(lián)，最后進(jìn)行人心肌鈣蛋白T的檢測(cè)；具體做法是先激活微球，接著制備羧 基化微球偶聯(lián)鼠抗人心肌鈣蛋白T的單克隆抗體，然后捕獲標(biāo)本中的人心肌鈣蛋白T，再加 入羊抗人肌鈣蛋白T的多抗和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的驢抗羊的免疫球蛋白G ；通過(guò)在流式 細(xì)胞儀上檢測(cè)微球上FITC的熒光強(qiáng)度，即可間接檢測(cè)標(biāo)本中人心肌鈣蛋白T的含量。
全文摘要
流式微球檢測(cè)人心肌鈣蛋白T的方法，該方法包括3個(gè)步驟，即先進(jìn)行微球激活，再單克隆抗體偶聯(lián)，最后進(jìn)行人心肌鈣蛋白T的檢測(cè)；具體做法是先激活微球，接著制備羧基化微球偶聯(lián)鼠抗人心肌鈣蛋白T的單克隆抗體，然后捕獲標(biāo)本中的人心肌鈣蛋白T，再加入羊抗人肌鈣蛋白T的多抗和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的驢抗羊的免疫球蛋白G；通過(guò)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)微球上FITC的熒光強(qiáng)度，即可間接檢測(cè)標(biāo)本中人心肌鈣蛋白T的含量。本方法可將單抗偶聯(lián)微球、羊抗人心肌鈣蛋白T的多克隆抗體、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的驢抗羊的IgG制成商品試劑盒，隨時(shí)可對(duì)人心肌鈣蛋白T進(jìn)行檢測(cè)。方法簡(jiǎn)便易行，能快捷地檢測(cè)人心肌鈣蛋白T，為診斷疾病提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102128934SQ201010041810
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日
發(fā)明者許健, 鄭金鼎, 黃山 申請(qǐng)人:貴州省臨床檢驗(yàn)中心