專利名稱：供體角膜多種病毒的熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)檢測供體角膜病毒感染領(lǐng)域，具體涉及供體角膜重大 致病病毒丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒I型(HIV1)和狂犬病毒(RV)的快速檢測 試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
我國眼庫的生物安全性極差，沒有控制供體角膜的醫(yī)源性感染問題。主要是大部 分眼庫供體的全身情況的資料不全，意外死亡的捐贈者甚至沒有全身情況的醫(yī)學(xué)資料，存 有傳染各型肝炎、狂犬病和艾滋病的很大風(fēng)險，所以在供體角膜十分奇缺的情況下，要在保 障安全的前提下，盡可能發(fā)揮供體角膜的臨床使用范圍。目前我國眼庫的主要問題是如何 建立一套利用結(jié)膜組織快速、準(zhǔn)確篩查供體角膜感染病毒的方法。供體角膜的實(shí)驗(yàn)室檢測方法目前主要包括血清免疫學(xué)方法和基因檢測法。血清免 疫學(xué)方法可由檢驗(yàn)科完成，該方法價格便宜，操作簡單，但是靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性，可 作為一種初篩手段。并且該方法在無法獲得供體血樣的情況下無法實(shí)行。基因檢測可分為 定性檢測和定量檢測，目前的研究發(fā)展趨勢是迅速發(fā)展能夠快速、定量檢測并且成本較低、 易于推廣的新技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)雖已被廣泛用于核酸分析，但普通PCR的假 陽性污染和定量準(zhǔn)確度一直困擾著人們。它依賴于各種不同類型PCR的后處理過程，而這 些處理過程很易使數(shù)量巨大的PCR產(chǎn)物飛散到空氣中，使PCR的假陽性污染成為大規(guī)模臨 床應(yīng)用的最大問題。另一方面，所有這些方法的定量都是針對PCR終產(chǎn)物來進(jìn)行的，而PCR 的平臺效應(yīng)大為干擾了 PCR的原始模板數(shù)量和終產(chǎn)物之間的相關(guān)性，使定量準(zhǔn)確度難以提 尚o

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供供體角膜重大致病病毒HCV、HIV1、RV的快速檢測試劑盒及 檢測方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。^ % 1%, FQ-PCR(Real Time Fluorescent Quantity Polymerase Chain Reaction)方法采用完全閉管檢測，不需PCR后處理，避免了交叉污染；同時采用實(shí)時檢測 技術(shù)，所得Ct值和原始模板數(shù)量完全呈線性相關(guān)，定量準(zhǔn)確率極高。本發(fā)明所采用的技術(shù)路線是本發(fā)明針對供體角膜重大致病病毒HCV、HIV1、RV的 核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的正向和反向引物、熒光探針和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品。將梯度稀釋的 陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品分別作為模板進(jìn)行FQ-PCR反應(yīng)，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板 濃度的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。HCV、HIV1和RV的遺傳物質(zhì)是RNA，提 取供體眼球結(jié)膜組織總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增檢測技術(shù)，通過熒 光信號的變化檢測病毒RNA的拷貝數(shù)，從而確定供體角膜組織內(nèi)是否感染致病病原體HCV、 HIV1或RV及其數(shù)量。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下
本發(fā)明所涉及的供體角膜重大致病病毒HCV、HIV1、RV的快速檢測試劑盒由RNA提 取試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品組成。其中RNA 提取試劑為 NucleoSpin RNA II 試劑盒(Macherey Nagel) ；RNA 反轉(zhuǎn)錄 和擴(kuò)增試劑包括2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑，Taq DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶(天根)，正向及反向 HCV引物，HCV熒光探針，正向及反向HIV1弓丨物，HIV1熒光探針，正向及反向RV引物，RV熒 光探針，無核酸酶的蒸餾水，HCV陰性對照，HCV陽性對照，HIV1陰性對照，HIV1陽性對照， RV陰性對照，RV陽性對照；陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品分別為含有HCV正向和反向引物擴(kuò)增的目的序 列的pUC57-HCV質(zhì)粒，含有HIV1正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列的PUC57-HIV1質(zhì)粒，含有 RV正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列的PUC57-RV質(zhì)粒。一 . HCV、HIV1或RV引物、熒光探針和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品序列如下HCV 正向HCV 引物CTCCCGGGAGAGCCATAGT反向HCV 引物CAAGCACCCTATCAGGCAGTAHCV 熒光探針序列FAM+CGGAACCGGTGAGTACACCGGA+TAMRAHCV擴(kuò)增片段長度為182bp。HCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的序列為ttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccgg tgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcaagact gctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgcttgcgagtgccccgggaggtctcgtaHCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的基因的片段長度為240bp。HIV1 正向HIV1 引物CCGGCCATAAGGCAAGAGT反向HIV1 引物TCTCTGCATCATTATGGTAGCTGAAHIV1 熒光探針序列FAM+TGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAAC+TAMRAHIV1擴(kuò)增片段長度為74bp。HIV1陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的序列為attgtaagactattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcagg gagtaggaggacccggccataaggcaagagttttggctgaagcaatgagccaagtaacaaattcagctaccataatgatgcagagaggca attttaggaaccaaagaaagattgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcacacagccagaaattgcagggcccctaHIV1陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的基因的片段長度為240bp。RV:正向RV 引物CAGATCCCTAAATGCAACGGTTA反向RV 引物CCCAGATAGCCCCCTAGAACARV 熒光探針序列FAM+TGCTGCATGTGCTCCTCATGA+TAMRARV擴(kuò)增片段長度為72bp。
RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的序列為atctccttattcatcaaatgctgttggtcacgtgttcaatctcattcactttgtaggatgctatatggg tcaagtcagatccctaaatgcaacggttattgctgcatgtgctcctcatgaaatgtctgttctagggggctatctgggagaggaattcttcgggaaag ggacatttgaaagaagattcttcagagatgagaaagaacttcaagaatacgaggcggctgaactgacaaagacRV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的基因的片段長度為240bp。
二 .眼庫供體HCV、HIV1或RV RNA病毒的檢測1.供體眼球結(jié)膜組織總RNA的提取和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建取5mg供體眼球結(jié) 膜組織，將組織塊放入離心管中，應(yīng)用德國Macherey Nagel公司出品的RNA提取試劑提取 組織總RNA，分別作為模板用于下面的擴(kuò)增；2. HCV、HIV1或RV RNA的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增分別在三組反應(yīng)管中加入下列組分體系2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑10 ii LTaq DNA 聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 8 u L反轉(zhuǎn)錄酶0. 28 ii L正向HCV、HIV1 或 RV 引物(5pmol/ii L)1 u L反向HCV、HIV1 或 RV 引物(5pmol/ii L)1 u LHCV、HIV1 或 RV 熒光探針(5pmol/ u L)0. 8 u LRNA 模板5pg-50ng無核酸酶的蒸餾水至20 ii L 其中HCV組RNA模板為lCf-lO1拷貝/ P L倍比稀釋的HCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品和從供 體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA ；HIV1組RNA模板為lCf-lO1拷貝/ y L倍比稀釋的HIV1陽性 工作標(biāo)準(zhǔn)品和從供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA ；RV組RNA模板為lCf-lO1拷貝/ y L倍比 稀釋的RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品和從供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA。每個模板設(shè)立三個復(fù)孔， 混勻離心后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，具體程序如下
循環(huán)次數(shù)步驟纖(°C)時間115030併中12923餅439210秒45030秒568im40-4569210秒75520秒86840秒 反應(yīng)完成后得到HCV、HIV1或RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，通過Ct值與起始模板 濃度的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系分別制作出HCV、HIV1或RV的標(biāo)準(zhǔn)曲線，評價標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有兩個指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)(r2)和斜率(slope)，相關(guān)系數(shù)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，理想 值應(yīng)大于0.98，越接近于1說明直線性越好，定量越準(zhǔn)確。斜率反應(yīng)PCR擴(kuò)增效率(E)，PCR 理想的擴(kuò)增效率應(yīng)在0. 8 < E < 1. 2范圍。PCR擴(kuò)增效率可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算得 出，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示起始模板濃度，Y軸表示Ct值時E = 10[-1/slope]-l0當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線X 軸表示Ct值，Y軸表示時起始模板濃度E = 10_sl°pe-l。當(dāng)供體眼球的結(jié)膜組織的RNA與陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行反應(yīng)后，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲 線，再將供體眼球的結(jié)膜組織的RNA擴(kuò)增曲線得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以得到供體 眼球的結(jié)膜組織的HCV、HIV1或RV的拷貝數(shù)，從而確定供體角膜組織內(nèi)是否感染致病病原 體HCV、HIV1或RV及其數(shù)量。本發(fā)明的檢測試劑盒可應(yīng)用于臨床眼庫供體少量結(jié)膜組織標(biāo)本中的HCV、HIV1和 RV的檢測。本發(fā)明通過定位HCV、HIV1和RV病原體基因的保守序列，設(shè)計(jì)FQ-PCR的引物和熒 光探針，利用FQ-PCR技術(shù)快速靈敏檢測HCV、HIV1和RV ；本發(fā)明采用完全閉管檢測，避免了 交叉污染，同時定量準(zhǔn)確率極高(相對誤差約為50%，足以適應(yīng)臨床核酸定量的要求)，且 本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對供體角膜的HCV、HIV1和RV的檢測，填補(bǔ)了臨床上供體角膜HCV、HIV1和 RV檢測的空白，改變了以往只能從供體血液檢測HCV、HIV1和RV的現(xiàn)狀；可應(yīng)用于臨床眼 庫供體少量結(jié)膜組織標(biāo)本HCV、HIV1和RV的檢測。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1供體角膜HCV病毒檢測1.供體眼球結(jié)膜組織總RNA的提取和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建(1)取5mg供體眼球結(jié)膜組織，將組織塊放入離心管中，加入350 ii L Trizol，用電 動勻漿器充分勻漿1-2分鐘。室溫放置5min，使其充分裂解；(2)將組織裂解液放入過濾柱內(nèi)，12000rpm離心lmin。棄去過濾柱，向?yàn)V過液中加 入350 ii L 70%乙醇，反復(fù)吹打5次混勻；(3)將樣品加入吸附柱，12000rpm離心30s。更換新的濾液收集管，加入350 y L濾 膜脫鹽液，12000rpm離心lmin ；(4)加入95 ii L DNase反應(yīng)液，室溫放置5min。加入200 u L洗脫液2，12000rpm 離心30s ；(5)加入 600 u L 洗脫液 3，12000rpm 離心 30s。加入 250 u L 洗脫液 3，12000rpm 離心2min ；(6)加入40-60 u L無核酸酶的蒸餾水，12000rpm離心lmin，洗脫得到的溶液即為
RNA溶液，可立即使用也可存放于-20°C或-70°C冰箱中待用。構(gòu)建含有HCV基因的質(zhì)粒(pUC57-HCV)作為陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品。陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品含 有HCV正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列，另外還在目的序列的兩側(cè)各多加了一段序列，使 其更加接近實(shí)際檢測樣品的結(jié)構(gòu)，以保證與實(shí)際檢測樣品間的擴(kuò)增效率的一致性。應(yīng)用 Promega PureYield plasmid miniprep system 試劑盒，提取 HCV 陽性工作 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm比色，得到HCV質(zhì)粒陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的 純度和濃度。按照拷貝數(shù)=(質(zhì)量/分子量)X6.02X 1023拷貝/yL的公式，計(jì)算陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。將HCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取HCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品 lO^lO1拷貝/y L的八個濃度作為陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于擴(kuò)增。2. HCV病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增配制反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)體系 2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑10 ii LTaq DNA 聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 8 u L反轉(zhuǎn)錄酶0. 28 ii L正向HCV 引物(5pmol/ii L) :luL反向HCV 引物(5pmol/ii L) :1 u LHCV 熒光探針(5pmol/ u L) 0. 8 u L供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA模板1 y L無核酸酶的蒸餾水5. 12 ii L分別加入lCf-lO1拷貝/P L倍比稀釋的HCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品和供體眼球的結(jié)膜組 織提取的RNA作為模板，每個模板設(shè)立三個復(fù)孔。擴(kuò)增條件50°C 30min ；92°C 3min ；92°C 10s，50°C 30s，68°C lmin，4 個循環(huán)；92°C 10s，55°C 20s，68°C 40s，45 個循環(huán)。當(dāng)供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA與陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行反應(yīng)后，設(shè)定閾值 和基線，可以得到各自的ct值，通過ct值與起始模板濃度的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系， 制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，HCV標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率為0. 97，線性相關(guān)系數(shù)為0. 996，是一條完全符合 要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供體眼球的結(jié)膜組織提取RNA的擴(kuò)增曲線得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線， 就可以得到供體眼球的結(jié)膜組織HCV的拷貝數(shù)，從而確定供體角膜組織內(nèi)是否感染致病病 原體HCV及其數(shù)量。實(shí)施例2供體角膜HIV1病毒檢測1.供體眼球結(jié)膜組織總RNA的提取和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建具體步驟同實(shí)施例 1中供體眼球結(jié)膜組織總RNA的提取。構(gòu)建含有HIV1基因的質(zhì)粒(pUC57-HIVl)作為陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品。陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品 含有HIV1正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列，另外還在目的序列的兩側(cè)各多加了一段序列， 使其更加接近實(shí)際檢測樣品的結(jié)構(gòu)，以保證與實(shí)際檢測樣品間的擴(kuò)增效率的一致性。應(yīng)用 Promega PureYield plasmid miniprep system 試劑盒，提取 HIV1 陽性工作 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm比色，得到HIV1質(zhì)粒陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品 的純度和濃度。按照拷貝數(shù)=(質(zhì)量/分子量)X6.02X 1023拷貝/yL的公式，計(jì)算陽性 工作標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。將HIV1陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取HIV1陽性工作標(biāo) 準(zhǔn)品lCf-lO1拷貝/ y L的八個濃度作為陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于擴(kuò)增。2. HIV1病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增配制反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)體系2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑10 ii LTaqDNA 聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 8 u L反轉(zhuǎn)錄酶0. 28 ii L正向HIV1 引物(5pmol/ii L) luL反向HIV1 引物(5pmol/ii L) luL
HIV1 熒光探針(5pmol/ u L) 0. 8 u L供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA模板 1 y L無核酸酶的蒸餾水5. 12 ii L分別加入lCf-lO1拷貝/ P L倍比稀釋的HIV1陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品和供體眼球的結(jié)膜 組織提取的RNA作為模板，每個模板設(shè)立三個復(fù)孔。擴(kuò)增條件50°C 30min ；92°C 3min ； 92°C 10s,50°C 30s，68°C lmin，4 個循環(huán)；92°C 10s，55°C 20s，68°C 40s，45 個循環(huán)。當(dāng)供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA與陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行反應(yīng)后，設(shè)定閾值 和基線，可以得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板濃度的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系， 制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，HIV1標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率為0. 97，線性相關(guān)系數(shù)為0. 997，是一條完全符合 要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供體眼球的結(jié)膜組織提取RNA的擴(kuò)增曲線得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線， 就可以得到供體眼球的結(jié)膜組織HIV1的拷貝數(shù)，從而確定供體角膜組織內(nèi)是否感染致病 病原體HIV1及其數(shù)量。實(shí)施例3供體角膜RV病毒檢測1.供體眼球結(jié)膜組織總RNA的提取和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建具體步驟同實(shí)施例 1中供體眼球結(jié)膜組織總RNA的提取。構(gòu)建含有RV基因的質(zhì)粒(pUC57-RV)作為陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品。每個陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品 含有RV正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列，另外還在目的序列的兩側(cè)各多加了一段序列，使 其更加接近實(shí)際檢測樣品的結(jié)構(gòu)，以保證與實(shí)際檢測樣品間的擴(kuò)增效率的一致性。應(yīng)用 Promega PureYield plasmid miniprep system 試劑盒，提取 RV 陽性工作標(biāo) 準(zhǔn)品質(zhì)粒，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm比色，得到RV質(zhì)粒陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的純 度和濃度。按照拷貝數(shù)=(質(zhì)量/分子量)X6.02X 1023拷貝/yL的公式，計(jì)算陽性工作標(biāo) 準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。將RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品lCf-lO1 拷貝/ P L的八個濃度作為陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于擴(kuò)增。2. RV病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增
配制反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)體系
2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑10 u L
Taq DNA 聚合酶(2. 5U/ u L)0. 8u L
反轉(zhuǎn)錄酶0. 28u L
正向 RV 引物(5pmol/uL)1 u L
反向 RV 引物(5pmol/uL)1 u L
RV 熒光探針(5pmol/uL)0. 8u L供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA模板1 y L無核酸酶的蒸餾水5. 12 ii L分別加入lCf-lO1拷貝/y L倍比稀釋的RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品和供體眼球的結(jié)膜組 織提取的RNA作為模板，每個模板設(shè)立三個復(fù)孔。擴(kuò)增條件50°C 30min ；92°C 3min ；92°C 10s，50°C 30s，68°C lmin，4 個循環(huán)；92°C 10s，55°C 20s，68°C 40s，45 個循環(huán)。當(dāng)供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA與陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行反應(yīng)后，設(shè)定閾值 和基線，可以得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板濃度的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系， 制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，RV標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率為0. 97，線性相關(guān)系數(shù)為0. 999，是一條完全符合要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供體眼球的結(jié)膜組織提取RNA的擴(kuò)增曲線得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就 可以得到供體眼球的結(jié)膜組織RV的拷貝數(shù)，從而確定供體角膜組織內(nèi)是否感染致病病原 體RV及其數(shù)量。引物和探針序列<110>山東省眼科研究所<120>供體角膜多種病毒的熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法<160>9<210>1<211>19<212>DNA<213> 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)<400>1ctcccgggag agccatagt 19<210>2<211>21<212>DNA<213> 丙型月干炎病毒(hepatitis C virus)<400>2caagcaccct atcaggcagt a 21<210>3<211>22<212>DNA<213> 丙型月干炎病毒(hepatitis C virus)<400>3cggaaccggt gagtacaccg ga 22<210>4<211>19<212>DNA<213> AM^M^^'MM I M (human immunodificency virus 1)<400>4ccggccataa ggcaagagt 19<210>5<211>25<212>DNA<213> AM^M^^'MM I M (human immunodif icency virus 1)<400>5tctctgcatc attatggtag ctgaa 25<210>6<211>25
<212>DNA<213>貞I M (human immunodificency virus 1)<400>6tggctgaagc aatgagccaa gtaac 25<210>7<211>23<212>DNA<213>(rabies virus)<400>7cagatcccta aatgcaacgg tta 23<210>8<211>21<212>DNA<213>(rabies virus)<400>8cccagatagc cccctagaac a 21<210>9<211>21<212>DNA<213>(rabies virus)<400>9tgctgcatgt gctcctcatg a 2權(quán)利要求
一種供體角膜多種病毒的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒由RNA提取試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品組成；其中RNA提取試劑為NucleoSpin RNA II試劑盒；RNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑包括2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑，Taq DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，正向及反向HCV引物，HCV熒光探針，正向及反向HIV1引物，HIV1熒光探針，正向及反向RV引物，RV熒光探針，無核酸酶的蒸餾水，HCV陰性對照，HCV陽性對照，HIV1陰性對照，HIV1陽性對照，RV陰性對照，RV陽性對照；陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品分別為含有HCV正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列的pUC57-HCV質(zhì)粒，含有HIV1正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列的pUC57-HIV1質(zhì)粒，含有RV正向和反向引物擴(kuò)增的目的序列的pUC57-RV質(zhì)粒；上述的HCV、HIV1或RV的引物、熒光探針與陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品序列如下HCV正向HCV引物CTCCCGGGAGAGCCATAGT反向HCV引物CAAGCACCCTATCAGGCAGTAHCV熒光探針序列FAM+CGGAACCGGTGAGTACACCGGA+TAMRAHCV擴(kuò)增片段長度為182bp；HCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的序列為ttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcaagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgcttgcgagtgccccgggaggtctcgtaHCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的基因的片段長度為240bp；HIV1正向HIV1引物CCGGCCATAAGGCAAGAGT反向HIV1引物TCTCTGCATCATTATGGTAGCTGAAHIV1熒光探針序列FAM+TGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAAC+TAMRAHIV1擴(kuò)增片段長度為74bp；HIV1陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的序列為attgtaagactattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttggctgaagcaatgagccaagtaacaaattcagctaccataatgatgcagagaggcaattttaggaaccaaagaaagattgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcacacagccagaaattgcagggcccctaHIV1陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的基因的片段長度為240bp；RV正向RV引物CAGATCCCTAAATGCAACGGTTA反向RV引物CCCAGATAGCCCCCTAGAACARV熒光探針序列FAM+TGCTGCATGTGCTCCTCATGA+TAMRARV擴(kuò)增片段長度為72bp；RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的序列為atctccttattcatcaaatgctgttggtcacgtgttcaatctcattcactttgtaggatgctatatgggtcaagtcagatccctaaatgcaacggttattgctgcatgtgctcctcatgaaatgtctgttctagggggctatctgggagaggaattcttcgggaaagggacatttgaaagaagattcttcagagatgagaaagaacttcaagaatacgaggcggctgaactgacaaagacRV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的目的基因的片段長度為240bp。
2.權(quán)利要求1的試劑盒應(yīng)用于臨床眼庫供體少量結(jié)膜組織標(biāo)本HCV、HIVl和RV的檢測。
3.檢測試劑盒對眼庫供體HCV、HIVl或RVRNA進(jìn)行檢測的方法(1)供體眼球結(jié)膜組織總RNA的提取和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建取5mg供體眼球結(jié)膜 組織，將組織塊放入離心管中，應(yīng)用RNA提取試劑提取組織總RNA，分別作為模板用于下面 的擴(kuò)增；(2)HCV、HIV1或RVRNA的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增 分別在三組反應(yīng)管中加入下列組分體系2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑IOyLTaq DNA 聚合酶(2. 5U/μ L) 0. 8 μ L反轉(zhuǎn)錄酶0.28 μ L正向！1(^、!11￥1或1^引物(5 11101/^1^):IyL反向 HCV、HIV1 或 RV 引物(5pmol/yL) IyLHCV, HIVl 或 RV 熒光探針(5pmol/ μ L) 0. 8 μ LRNA 模板5pg-50ng無核酸酶的蒸餾水至20 μ L其中HCV組RNA模板為IO8-IO1拷貝/ μ L倍比稀釋的HCV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品和從供體眼 球的結(jié)膜組織提取的RNA ；HIVl組RNA模板為IO8-IO1拷貝/ μ L倍比稀釋的HIVl陽性工作 標(biāo)準(zhǔn)品和從供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA ；RV組RNA模板為IO8-IO1拷貝/ μ L倍比稀釋 的RV陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品和從供體眼球的結(jié)膜組織提取的RNA ；每個模板設(shè)立三個復(fù)孔，混勻 離心后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，具體程序如下 當(dāng)供體眼球的結(jié)膜組織的RNA與陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行反應(yīng)后，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線， 再將供體眼球的結(jié)膜組織的RNA擴(kuò)增曲線得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以得到供體眼 球的結(jié)膜組織的HCV、HIVl或RV的拷貝數(shù)，從而確定供體角膜組織內(nèi)是否感染致病病原體 HCV、HIVl或RV及其數(shù)量。
全文摘要
一種供體角膜多種病毒的熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。試劑盒由RNA提取試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品組成。其中RNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑包括2X反轉(zhuǎn)錄PCR預(yù)混試劑，聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，正、反向HCV引物、HIV1引物和RV引物，以及HCV、HIV1與RV熒光探針，HCV、HIV1與RV陰性和陽性對照；陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品分別為含有HCV正、反向引物擴(kuò)增的目的序列的pUC57-HCV質(zhì)粒，以及HIV1正、反向引物擴(kuò)增的目的序列的pUC57-HIV1質(zhì)粒和RV正、反向引物擴(kuò)增的目的序列的pUC57-RV質(zhì)粒。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對臨床供體結(jié)膜組織標(biāo)本的完全閉管檢測，不需PCR后處理，避免了交叉污染；同時采用實(shí)時檢測，所得Ct值和原始模板數(shù)量完全呈線性相關(guān)，定量準(zhǔn)確率極高，相對誤差約為50％，足以適應(yīng)臨床核酸定量的要求。
文檔編號G01N21/64GK101851686SQ20101014792
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者謝立信, 陳鵬 申請人:山東省眼科研究所