專利名稱：一種離子液體中諾氟沙星分子印跡整體柱的制備方法
一種離子液體中諾氟沙星分子印跡整體柱的制備方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種離子液體中分子印跡整體 柱的制備，具體的說，是涉及一種對喹諾酮類抗生素具有特異性識別的分子印跡整體柱的 制備。背景技術(shù)：
喹諾酮類(quinolones，QNs)抗菌藥是指人工合成的含有4_喹酮母 核的一類廣譜抗微生物藥，目前廣泛使用的是第三代產(chǎn)品，如恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙 星、氧氟沙星。其具有廣譜抗菌活性、具有很強的滲透性，用于治療水產(chǎn)動物由細(xì)菌引起的 出血性敗血癥、細(xì)菌性爛鰓病、赤鰭病、潰瘍等細(xì)菌性疾病和動物支原體病。正在以較快的 速度和較大的份額占據(jù)養(yǎng)殖業(yè)的抗感染藥物的市場，并且這類抗菌藥物在我國還用于畜禽 促生長劑。根據(jù)喹諾酮類抗菌藥藥理機制，該藥物是極易造成高濃度的組織材料殘留的藥 物，喹諾酮類藥物主要威脅來自于耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，一旦細(xì)菌的耐藥性傳遞給人類，就會 出現(xiàn)用抗生素?zé)o法控制人類細(xì)菌感染性疾病的情況。由于食用抗菌素污染的食品可引起人群的過敏變態(tài)反應(yīng)，具有潛在致畸致癌和致 突變的威脅，污染的食物鏈形成動物體和人體耐藥菌的產(chǎn)生、傳遞和蔓延已引起了國內(nèi)外 的高度重視。如美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)通過其網(wǎng)站發(fā)布消息，不允許將抗菌劑藥 物恩諾沙星用于家禽和水產(chǎn)品的細(xì)菌感染的治療；歐共體早在1973年就禁止喹諾酮類抗 菌藥物作為飼料添加劑；日本于2006年6月開始實施的日本肯定列表規(guī)定禽肉中喹諾酮的 限量為0. 02mg/kg。而我國的現(xiàn)狀是廣泛用于畜禽疾病的治療并作為促生長劑長期低劑量 添加在飼料中。相形之下，國外的高要求對我國的動物源食品出口是一種嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。在檢 出中國出口的禽肉中抗菌素超標(biāo)后，歐盟曾要求立即退貨，并暫時停止從中國進口該商品。 這種措施會造成上億美元的損失，而且隨著“暫時”的時間不斷推延，損失勢必會越來越嚴(yán) 重。目前對喹諾酮類藥物殘留的檢測的方法有微生物抑制分析法(MIA)、熒光分光光 度法、免疫化學(xué)測定法等，這些方法只能對喹諾酮藥物進行初步評估，不能準(zhǔn)確地對各種喹 諾酮類藥物進行權(quán)威的判定，也不能精確地對各種喹諾酮類藥物含量進行定量的評價。這 些方法已經(jīng)不能完全滿足日益提高的國際標(biāo)準(zhǔn)。為此國家2007年10月制訂了《動物源性 食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》(GB/T 21312-2007)。該 方法在實施過程中存在的主要問題是我國目前的分析檢測限不能達到美國、日本和歐洲一 些國家的分析水平。這使得我國在食品中喹諾酮藥物殘留檢測方面在國際上處在非常被動 的地位，為動物源性食品順利出口帶來了隱患和困難。因此建立高靈敏、高精度、準(zhǔn)確可靠、 嚴(yán)格定量的喹諾酮藥物殘留檢測方法是十分必要和急需的。因此，如何從復(fù)雜樣品中檢測出喹諾酮殘留已經(jīng)成為食品安全檢測工作中重要的 研究課題，其中樣品的前處理是動物源性食品中抗生素殘留檢測中的關(guān)鍵步驟。固相萃取 (solid-phaseextraction, SPE)是近年來迅速發(fā)展起來的專門用于樣品純化和濃縮的一 項技術(shù)，是在許多領(lǐng)域進行樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)模式，也是目前抗生素殘留檢測中樣品前處 理中的主流技術(shù)。其中以分子印跡聚合物作為填料的分子印跡固相萃取技術(shù)(molecular imprinting solid-phase extraction,MISPE)以其高度的特異性、選擇性和快速簡潔的優(yōu)勢，已成為當(dāng)前國際上最先進最受關(guān)注的痕量樣品富集和提取方法之一。分子印跡技術(shù)是一種高選擇性的仿生識別方法，從分子水平通過空間立體作用和 結(jié)構(gòu)匹配性，識別和富集目標(biāo)分子。分子印跡聚合物以其制備簡單、選擇性好、性能穩(wěn)定、價 格便宜等諸多優(yōu)點廣泛用于固相萃取及色譜柱填料中。整體柱(monolithic column)是通 過有機或無機聚合方法在色譜柱內(nèi)進行原位聚合的制備的固定相，它是當(dāng)前國際上色譜柱 制備技術(shù)的研究熱點，具有制備方法簡單靈活，功能可調(diào)性強，色譜柱滲透性好，分離快速 的特點。(molecular imprinting monolithic column)
和色譜制備技術(shù)的有機結(jié)合，近年來在合成方法、色譜柱功能性控制和分子識別機理方面 有了迅速發(fā)展，是國際上分離技術(shù)研究的熱門課題。與傳統(tǒng)的液相提取和固相萃取等樣品 處理方法相比，分子印跡整體柱萃取技術(shù)能夠高效、快速地對目標(biāo)藥物分子進行有效的提 取，在低豐度藥物殘留的富集提取方面具有很大潛力。將分子印跡整體柱提取技術(shù)與液相 色譜_質(zhì)譜/質(zhì)譜分析方法的聯(lián)合使用，是高度選擇性提取技術(shù)和高度準(zhǔn)確檢測技術(shù)的有 機結(jié)合，在提高分析平臺檢測靈敏度和準(zhǔn)確性方面具有很大的潛力。這兩項技術(shù)的聯(lián)合使 用可以建立對食品中喹諾酮藥物殘留的高靈敏、高精度、準(zhǔn)確可靠、嚴(yán)格定量的檢測方法， 提高我國在這方面的檢測水平，達到國際領(lǐng)先水平。目前該技術(shù)主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、制藥和環(huán)境檢測，國際上這種技術(shù)應(yīng)用于食品檢測 的研究不是很多，尚未有將該技術(shù)應(yīng)用于喹諾酮類藥物殘留的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決大多數(shù)喹諾酮類藥物殘留的常規(guī)檢測方法往往 無法從復(fù)雜樣品中準(zhǔn)確檢測到痕量抗生素殘留的問題，提供一種具有選擇性富集痕量喹諾 酮類藥物殘留的、離子液體中諾氟沙星分子印跡整體柱的制備方法。本發(fā)明提供的離子液體中諾氟沙星分子印跡整體柱的制備方法，包括以下步驟第一、將模板分子諾氟沙星、功能單體甲基丙烯酸超聲溶解于由二甲基亞砜和N， N-二甲基甲酰胺組成的混合溶劑中，然后加入致孔劑離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼 酸鹽(l-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate, [BMIm]BF4)混合、超聲，靜置作 用4-6小時形成復(fù)合物；第二、向上步形成的復(fù)合物中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發(fā)劑偶氮二 異丁腈，超聲脫氣5-lOmin，通氮氣除氧，將混合液注入不銹鋼柱封好后熱引發(fā)聚合反應(yīng)，引 發(fā)條件為60°C水浴中反應(yīng)不低于12小時；第三、將第二步合成的分子印跡整體柱接到高壓輸液泵上，清洗除去致孔劑和模 板分子，得到諾氟沙星分子印跡整體柱。所述的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比為1 6 30;混合溶劑中二甲 基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為5 1 ；致孔劑總用量為功能單體和交聯(lián)劑總體積 的2至5倍。所述的混合溶劑用量為可溶解模板分子的最小用量，引發(fā)劑用量為模板分子、功 能單體、混合溶劑、致孔劑、交聯(lián)劑混合液總質(zhì)量的；第二步中所述的不銹鋼柱，柱長為10cm;第三步所述的清洗除去致孔劑和模板分子使用的清洗液為甲醇或體積比為 94 6的甲醇/乙酸溶液。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明制備的諾氟沙星分子印跡整體柱與傳統(tǒng)本體聚合得到的聚合物相比，具有 如下的優(yōu)點1、制備過程簡單易行，可避免傳統(tǒng)填充柱制作過程中繁瑣的研磨過程，在不銹鋼 柱中原位合成即可作為色譜固定相；2、離子液體輔助制備，反應(yīng)更快速均一，且離子液體不易揮發(fā)，制得的聚合物形態(tài) 更好；3、得到的整體固定相有大孔結(jié)構(gòu)可以保證快的傳質(zhì)速率和較低的背壓；4、分子識別性能好，色譜分離峰形好，柱效高；5、交叉反應(yīng)性好，印跡諾氟沙星分子，對其他結(jié)構(gòu)類似的多種喹諾酮類抗生素也 有很好的識別性能。本發(fā)明方法步驟簡單，得到的印跡聚合物整體柱分子識別性能好，可直接作為新 型液相色譜填料用于離線或在線固相萃取前處理，從而達到去除復(fù)雜樣品中的雜質(zhì)、選擇 性富集痕量喹諾酮類藥物殘留的目的。重要的是可將分子印跡整體柱提取技術(shù)與液相色 譜_質(zhì)譜/質(zhì)譜分析方法聯(lián)合使用，用高度選擇性的提取技術(shù)達到提高分析平臺檢測靈敏 度和準(zhǔn)確性的目的，從而建立對食品中喹諾酮類藥物殘留的高靈敏、高精度、準(zhǔn)確可靠、嚴(yán) 格定量的檢測方法。

圖1-3為不同離子液體用量的分子印跡整體柱MIP2-MIP4的SEM圖；圖4為非印跡柱NIP3的SEM圖；圖5為普通致孔劑制得的印跡柱MIP6的SEM圖。
具體實施方式實施例1.首先將模板分子諾氟沙星0. lmmol、功能單體MAAO. 6mmol加入二甲基亞砜和N， N-二甲基甲酰胺(5 1，v/v)的混合溶劑(用量為可溶解模板分子的最小用量1.44ml) 中，超聲溶解。加入致孔劑(離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1.3ml)，使之相 互作用6h以形成復(fù)合物，再加入交聯(lián)劑EDMA3mmol、引發(fā)劑AIBN 20mg，溶液經(jīng)過超聲脫氣 5-lOmin，通氮氣除氧10-20min，然后將此混合液注入到10cm不銹鋼柱中，熱引發(fā)60°C水浴 反應(yīng)12h。將制得的分子印跡整體柱接到高壓輸液泵上分別用甲醇、甲醇/乙酸(94 6， v/v)溶液清洗除去致孔劑和模板分子得到聚合物1(MIP1)。實施例2.加入致孔劑(離子液體1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1. 95ml)，其他同實施例 1，可得MIP2(見附圖1)。實施例3.加入致孔劑(離子液體1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，2. 6ml)，其他同實施例 1，可得MIP3(見附圖2)。實施例4.
加入致孔劑(離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，3. 25ml)，其他同實例1， 可得MIP4(見附圖3)。 圖5)。
為比較離子液體與普通致孔劑的不同作用，做了如下實驗 實施例5.
加入致孔劑2. 6ml (癸醇十二醇，1 實施例6.
加入致孔劑2. 6ml (癸醇十二醇，1
2，v/v)，其他同實施例1，可得MIP5。 l，v/v)，其他同實施例1，可得MIP6(見附
2 1，v/v)，其他同實施例1，可得MIP7。
實施例7.
加入致孔劑2. 6ml (癸醇十二 為比較印跡與非印跡柱的不同，做了如下實驗 實施例8.
不加模板分子諾氟沙星，其他同實施例3，可得NIP3(見附圖4)。 通過不同離子液體用量得到的分子印跡整體柱SEM圖1-3可以看出，隨著離子液 體用量的增加(叢圖1到圖3)，制得的整體柱孔徑越大，同時柱壓也越小。印跡柱相較于非 印跡柱(圖4)和用普通致孔劑(圖5)制得的印跡柱，其孔徑更大、均一性也更好。為了驗證對比所得到的一系列整體柱的選擇性能，做了如下實驗用1. OmL/min甲醇/乙酸(99. 95 0. 05，v/v)溶液作為流動相測試MIP1-MIP7 對氯霉素(CAP)和諾氟沙星(NOR)的分離效果，結(jié)果見表1。表1聚合過程各物質(zhì)用量及各整體柱對氯霉素(CAP)和諾氟沙星(NOR)的分離效 果 容量因子(k')由公式k' =(、_、)/、計算，其中、和、分別代表諾氟沙星的 保留時間及體系的死時間；分離因子(a)由公式a =k' N0E/k' eAP計算，其中k' _和 k' eAP分別是諾氟沙星(NOR)和氯霉素(CAP)的容量因子。
權(quán)利要求
一種離子液體中諾氟沙星分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟第一、將模板分子諾氟沙星、功能單體甲基丙烯酸超聲溶解于由二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺組成的混合溶劑中，然后加入致孔劑混合、超聲，靜置作用4-6小時形成復(fù)合物；第二、向上步形成的復(fù)合物中加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲脫氣5-10min，通氮氣除氧，將混合液注入不銹鋼柱封好后熱引發(fā)聚合反應(yīng)，引發(fā)條件為60℃水浴中反應(yīng)不低于12小時；第三、將第二步合成的分子印跡整體柱接到高壓輸液泵上，清洗除去致孔劑和模板分子，得到諾氟沙星分子印跡整體柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比 為1 6 30;混合溶劑中二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為5 1;致孔劑為 離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽；致孔劑總用量為功能單體和交聯(lián)劑總體積的2 至5倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于混合溶劑用量為可溶解模板分子的最 小用量，引發(fā)劑用量為模板分子、功能單體、混合溶劑、致孔劑、交聯(lián)劑混合液總質(zhì)量的1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于第三步所述的清洗除去致孔劑和模板 分子使用的清洗液為甲醇或體積比為94 6的甲醇/乙酸溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于第二步中所述的不銹鋼柱，柱長為 10cmo
全文摘要
一種離子液體中諾氟沙星分子印跡整體柱的制備方法。其步驟如下將模板分子諾氟沙星、功能單體甲基丙烯酸加入到二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中，超聲溶解后加入致孔劑離子液體振蕩作用4-6小時后，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲脫氣后通氮氣除氧，將此溶液注入10cm不銹鋼柱，放入60℃水浴中熱引發(fā)反應(yīng)12小時得到分子印跡整體柱。將柱子接到高壓輸液泵上清洗除去致孔劑和模板分子，最后得到具有良好分離效果的印跡整體柱。本發(fā)明具有制備簡單、避免繁瑣的研磨過程、分子識別性能好等特點。所提供的分子印跡整體柱作為一種液相色譜填料，可實現(xiàn)對喹諾酮類抗生素的高效分離、富集和純化。
文檔編號G01N30/56GK101852791SQ201010178419
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者何佳, 劉烜, 孫祥麗, 林安清, 肖亞兵, 鄭文杰 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心