專利名稱：梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種梅毒特異性總抗體檢測試劑，尤其是涉及一種采用膠體金免疫層 析技術(shù)(immimochromatography)進(jìn)行的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及 其制備方法。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播 性疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創(chuàng)口或 者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液，播散全身，使機(jī)體幾乎 所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和 潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂觀地預(yù)言“由于有高敏度檢測方法和高效的治療方案， 梅毒是一種能夠通過公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，至今梅毒 依然是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大約有1200萬的患 #，胃中 60 力■^女gii#。 ( :He￡ilth Protection Agency Centre for Infections. International Encyclopediaof Public Health-Syphi1 is[M]. London, UK :Health Protection Agency Centre，2008，289-297)事實(shí)上，梅毒的感染現(xiàn)狀可能要比想象中的更 讓人悲觀。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試 驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測兩大類型。梅毒特異性抗體IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗體分別于2周和4周后產(chǎn)生，即使患者經(jīng)過足夠治療，其仍能長期存在，甚至終身不消失 (參見:Luis J F, Felipe U S, Santa G C, et al. Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59 :123_126)；而另一種抗體物質(zhì)反應(yīng)素產(chǎn)生較晚，一般 在受感染后5 7周產(chǎn)生(參見林月圓.TPPA和TRUST在梅毒診斷中的價(jià)值與臨床相關(guān) 問題[J].放射免疫學(xué)雜志，2009，22 (3) :295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治療后期以及潛 伏梅毒可能陰性。因此梅毒特異性抗體的陽性率、敏感性顯著高于反應(yīng)素。TP-IgM是梅 毒感染后，機(jī)體最先出現(xiàn)的特異性抗體。只要有活的梅毒螺旋體存在，其TP-IgM將會(huì)維持
胃白勺TfC。 Martina H ^ ( #JAL :Martina H, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis [J]. DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61_66.)認(rèn)為 TP-IgM 是 梅毒早期感染并活動(dòng)的一項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志，李步榮等(參見李步榮，賀軍濤，張毅，等.梅 毒螺旋體IgM抗體檢測的臨床意義[J],第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,28(16) 1495-1497) 認(rèn)為TP-IgM與TP-DNA —樣，代表著梅毒傳染性指標(biāo)。在排除近期抗梅毒治療的前提下，TP-IgM若不轉(zhuǎn)陰，提示體內(nèi)可能殘存梅毒螺旋體或治療不徹底。TP-IgM陰轉(zhuǎn)者隨訪時(shí)再轉(zhuǎn) 陽性，表明再次感染梅毒(參見Rawstron SA, Mehta S, Bromberg K, et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis [J], Sex Transm Dis，2004，31 (2) : 123-126)。盡管 TP-IgM 陰性不能完全排除傳 染性，但TP-IgM陽性必定提示該患者具有傳染性。早期的血清學(xué)方法使用完整梅毒螺旋體作為抗原，研究和診斷用的TP是以TP感 染兔睪丸獲得，這種方法花費(fèi)大、獲得的TP量少、不純(混有宿主蛋白)，與其他病原體存 在交叉反應(yīng)，因此假陽性也時(shí)有發(fā)生。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及及梅毒螺旋體抗原的相 繼克隆，將重組抗原應(yīng)用于梅毒實(shí)驗(yàn)已經(jīng)越來越多。目前研究比較多的TP抗原有TPW7、 TPN47、TPNl5, TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重組 DNA 技術(shù)制備的重 組抗原可以克服完整TP抗原的缺點(diǎn)，能快速、經(jīng)濟(jì)地制備無限量特異重組TP抗原。梅毒特異性抗體檢測是梅毒確證試驗(yàn)，包括TPHA，TPPA, ELISA，F(xiàn)TA-ABS及 Western-blot等，其特異性均較高。然而，面對嚴(yán)峻的防制形式，不但需要特異準(zhǔn)確的檢測 手段，還需要一種更簡便快捷的試劑來篩查，以便為臨床和疾病防控提供對策。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制 備方法。本發(fā)明所述梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條設(shè)有載體板、加樣墊、 膠體金墊、硝酸纖維膜(NC膜)、梅毒特異性總抗體檢測線、對照線和吸收墊。加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端 設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在 硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅 毒特異性總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體或梅毒特異性抗原TPN17和/或梅毒特 異性抗原TPN47，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體。所述載體板可采用PVC板。所述梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，包括以下步驟1)制備梅毒重組抗原TPN17和TPN47采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其 表達(dá)，得梅毒重組抗原TPN17和TPN472)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在梅毒特異性總抗體檢測線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅 毒抗原TPNl7和TPN47 IgG抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去離 子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱 攪拌下加入檸檬酸 三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> 4)膠體金與TPW7、TPN47的標(biāo)記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標(biāo)記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 100 u g TPN17,混勻，放置 5min,加入 5 % BSA lml 混勻，4°C、10000r/min 離心 lh, 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀 釋至1ml，得膠體金標(biāo)記的TPN17抗原；膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標(biāo)記同上操作，得膠體金標(biāo)記的TPN47抗原；
將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一 端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè) 在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在 梅毒特異性總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPW7 和TPN47的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑
^^ o在步驟2)中，所述抗人Ig單克隆抗體的濃度為1 4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17 和TPN47的IgG抗體由抗TPm7-IgG抗體與抗TPN47_IgG抗體按體積比1 1混合，其終 濃度為1 4mg/mL ；三者點(diǎn)樣量為1 P L/cm。在步驟3)中，所述檸檬酸三鈉的濃度可為2%。在步驟4)中，所述將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合， 最好膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原以體積比1 (0. 2 5)混合； 所述烘干的溫度可為37°C。本發(fā)明提供了一種采用膠體金免疫層析技術(shù)建立梅毒特異性總抗體膠體金免疫 層析檢測試劑條，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中梅毒特異性總抗體的檢測。在 檢測時(shí)，所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測簡便快速，特異性 強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。


圖1為本發(fā)明所述梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條實(shí)施例的結(jié)構(gòu) 組成示意圖。圖2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果模式示意圖。在圖2中，(1)為使用前的示意圖，⑵為無效試驗(yàn) (產(chǎn)品質(zhì)量問題)，(3)毒特異性總抗體陰性，(4)毒特異性總抗體陽性。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。參見圖1，本發(fā)明所述梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條實(shí)施例設(shè)有 載體板1、加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜(NC膜)4、梅毒特異性總抗體檢測線5、對照線 7和吸收墊8。加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜4和吸收墊8依次粘貼在載體板1上表面，加樣墊2的一端設(shè)在膠體金墊3的一端上，膠體金墊3的另一端設(shè)在硝酸纖維膜4的一端上，吸 收墊8的一端設(shè)在硝酸纖維膜4的另一端上，梅毒特異性總抗體檢測線5和對照線8依次設(shè) 在硝酸纖維膜4上；在梅毒特異性總抗體檢測線5處包被抗人Ig單克隆抗體或梅毒特異性 抗原TPN17和/或梅毒特異性抗原TPN47，在對照線7處包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47 的IgG抗體。所述載體板1采用PVC板。所述梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，包括以下步驟1)制備梅毒重組抗原TPN17和TPN47采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其 表達(dá)，得梅毒重組抗原TPN17和TPN47。2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在梅毒特異性總抗體檢測線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅 毒抗原TPN17和TPN47 IgG抗體，晾干，所述抗人Ig單克隆抗體的濃度為1 4mg/mL，羊 抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體由抗TPm7_IgG抗體與抗TPN47_IgG抗體按體積比 1 1混合，其終濃度為1 4mg/mL ；三者點(diǎn)樣量為1 P L/cm。3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1 %氯金酸lmL加入到100mL去離 子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0. 01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱 攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆?，所述檸檬酸三鈉的濃度可為2%。4)膠體金與TPW7、TPN47的標(biāo)記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標(biāo)記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 100 u g TPN17,混勻，放置 5min,加入 5 % BSA lml 混勻，4°C、10000r/min 離心 lh, 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀 釋至1ml，得膠體金標(biāo)記的TPN17抗原。膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標(biāo)記同上操作，得膠體金標(biāo)記的TPN47抗原。將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊。所述將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合，最好膠體金標(biāo) 記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原以體積比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的溫 度可為37°C。5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一 端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè) 在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在 梅毒特異性總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPW7 和TPN47的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條。以下給出免疫層析法檢測患者的臨床標(biāo)本
參見圖2，取待檢標(biāo)本(全血、血清、血漿、腦脊液)5 80iiL，靜置20min觀察結(jié) 果。只在檢測條對照區(qū)C有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū)T及對照區(qū)C均有一 紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)T和對照區(qū)C均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無
效結(jié)果。以下給出梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的性能檢定1)外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點(diǎn)、無裂縫，膠帶無開膠，無切 斜現(xiàn)象。2)陽性標(biāo)本符合率用TP-總抗體陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用 梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢定，計(jì)算陽性符合率。陽性參比血清的確 定采用TPPA(日本富士株式會(huì)社)法確定的臨床標(biāo)本。3)陰性標(biāo)本符合率用50份陰性參比血清檢定，計(jì)算陽性符合率。陰性參比血清 的確定采用TPPA(日本富士株式會(huì)社)法確定的臨床標(biāo)本。4)靈敏度檢測用衛(wèi)生部室內(nèi)質(zhì)控血清檢測，最低檢出限度應(yīng)小于或等于4NCU/ mL，與TPPA(日本富士株式會(huì)社)相當(dāng)。5)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性 血清檢測，要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)批間差異不同批次梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性 血清檢測，要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。7)干擾試驗(yàn)檢測結(jié)果不受標(biāo)本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。血清(或血漿)來自本申請人臨床標(biāo)本。8)交叉反應(yīng)采用梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，進(jìn)行系統(tǒng)性紅 斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測， 未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。自身免疫系統(tǒng)疾病的血清來自本申請人臨床確診患者。9)穩(wěn)定性檢測應(yīng)用Arrhenius法則，將試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項(xiàng) 指標(biāo)無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個(gè)月。以下給出具體實(shí)施例。實(shí)施例1在硝酸纖維素膜(NC膜)總檢測線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊 抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)IgG抗體，室溫晾干，密封室溫保存?zhèn)溆?。其中，抗人Ig單克 隆抗體的濃度為lmg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)IgG抗體由抗TPm7-IgG抗體與抗 TPN47-IgG抗體按體積比1 1混合，其終濃度為lmg/mL; 二者點(diǎn)樣量為lyL/cm。將已純化的金標(biāo)記的梅毒重組抗原TPN17和TPN47以體積比1 1混合后，均勻 地涂于玻璃纖維紙上，在37°C烘干，制備成金膠體墊，密封備用。將固相化的纖維膜與膠體 金結(jié)合的玻璃纖維、吸水紙等按一定順序，通過PVC不干膠底板組合在一起，用切條機(jī)切成 一定寬度檢測條。把梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條與干燥劑一起裝入鋁箔 袋中，機(jī)器封口，密封保存。取待檢標(biāo)本血清50 U L，加樣于梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條加 樣區(qū)，靜置20min觀察結(jié)果。只在梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條對照區(qū)有 一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū)及對照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)和對照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無效結(jié)果。實(shí)施例2與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由TPW7組成，不含有TPN47。結(jié)果判斷與 實(shí)施例1相同。實(shí)施例3與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由TPN47組成，不含有TPW7。結(jié)果判斷與 實(shí)施例1相同。實(shí)施例4與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于待檢標(biāo)本為腦脊液標(biāo)本，結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5性能驗(yàn)證試驗(yàn)按實(shí)施例1的方案制備梅毒特異性總抗體快速檢測試劑，然后進(jìn) 行性能驗(yàn)證。1)外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點(diǎn)、無裂縫，膠帶無開膠，試劑 條寬度在3 士 0. 1mm，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標(biāo)本符合率50份梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)(日本富士 株式會(huì)社)檢測確定的TP-總抗體陽性參比血清，采用梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析 檢測試劑條檢出TP-總抗體陽性50份，陽性標(biāo)本符合率100%。3)陰性標(biāo)本符合率50份梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)(日本富士 株式會(huì)社)陰性參比血清，采用梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢測未檢出 陽性標(biāo)本，陰性標(biāo)本符合率100%。4)靈敏度檢測用衛(wèi)生部室內(nèi)質(zhì)控血清檢測，最低檢出限度應(yīng)小于或等于4NCU/ mL，與TPPA(日本富士株式會(huì)社)相當(dāng)。5)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性 陽性血清(TPPA(日本富士株式會(huì)社)檢測確定的臨床標(biāo)本陽性TP-總參比高、中、低血清) 檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)批間差異不同批次梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征性 陽性血清(TPPA(日本富士株式會(huì)社)檢測確定的臨床標(biāo)本陽性TP-總參比高、中、低血清) 檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。7)干擾試驗(yàn)檢測結(jié)果不受標(biāo)本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。8)交叉反應(yīng)采用梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，進(jìn)行系統(tǒng)性紅 斑狼瘡(n = 30)、類風(fēng)濕病(n = 38)、免疫性肝炎(n = 40)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測， 未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。9)穩(wěn)定性檢測將梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條放置37°C 20天 后檢測，以上各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化。本發(fā)明的檢測在一條梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條上進(jìn)行，通過 兩種方式實(shí)現(xiàn)梅毒特異性總抗體的檢測。方式一利用膠體金免疫層析技術(shù)，在硝酸纖維素膜上總抗體檢測線和對照線處 分別包被抗人Ig單克隆抗體[或梅毒特異性抗原(TPN17和/或TPN47)]和羊抗梅毒抗原(TPN17和/或TPN47) IgG抗體。將已純化的金標(biāo)記的梅毒重組抗原TPN17和TPN47以一定 的比例混合后預(yù)包被在玻璃纖維紙上，干燥處理，制備成金膠體墊，再輔以恰當(dāng)?shù)臉悠诽幚?墊，組合試劑條(組裝方式見圖1)。檢測陽性樣本時(shí)，樣本中梅毒特異性總抗體與膠體金標(biāo) 記的重組抗原TPW7和/或TPN47結(jié)合形成免疫復(fù)合物。由于層析作用，復(fù)合物沿紙條吸 水紙方向向前移動(dòng)。經(jīng)過檢測線時(shí)，①TP總抗體免疫復(fù)合物與預(yù)包被的抗人Ig單克隆抗 體[或梅毒特異性抗原(TPN17和/或TPN47)]結(jié)合形成“Au_TPN17 (和/或TPN47)-特異 性抗梅毒總抗體_抗人Ig單克隆抗體_固相材料”或“AU-TPN17 (和/或TPN47)-特異性 抗梅毒總抗體_抗人Ig單克隆抗體_固相材料”夾心物而凝聚顯色；②游離金標(biāo)抗原則在 對照線處與羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47)的抗體結(jié)合而富集顯色。陰性標(biāo)本則僅在對照 線處顯色。方式二，將方式一的包被抗原、抗體對調(diào)在硝酸纖維素膜上總抗體檢測線和對照 線處分別包被梅毒重組抗原(TPm7/TPN47組合)和人IgG抗體，將金標(biāo)記的抗人Ig單克 隆抗體預(yù)包被在玻璃纖維紙上。兩種方式所制備的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，均可用于全 血、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中梅毒特異性總抗體的檢測，標(biāo)本用量微小，不需要特殊儀 器，肉眼直接判讀結(jié)果。且檢測簡便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣 泛。
權(quán)利要求
梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、梅毒特異性總抗體檢測線、對照線和吸收墊；加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體或梅毒特異性抗原TPN17和/或梅毒特異性抗原TPN47，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于所 述載體板為PVC板。
3.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其 特征在于包括以下步驟1)制備梅毒重組抗原TPN17和TPN47采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表 達(dá)，得梅毒重組抗原TPN17和TPN47 ；2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在梅毒特異性總抗體檢測線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗 原TPN17和TPN47 IgG抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸lmL加入到100mL去離子雙 蒸水中，得到的氯金酸濃度為0. 01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌 下加入1 %檸檬酸三鈉水溶液2. OmL,繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色 瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)膠體金與TPm7、TPN47的標(biāo)記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標(biāo)記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 100 u g TPN17，混勻，放置 5min，加入 5%BSA lml 混勻，4°C、10000r/min 離心 lh, 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀 釋至1ml，得膠體金標(biāo)記的TPN17抗原；膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標(biāo)記同上操作，得膠體金標(biāo)記的TPN47抗原；將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維 膜上，烘干，制備成膠體金墊；5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè) 在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝 酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒 特異性總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗梅毒抗原TPN17和 TPN47的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條。
4.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其 特征在于在步驟2)中，所述抗人Ig單克隆抗體的濃度為1 4mg/mL。
5.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體由抗TPm7_IgG抗體與抗 TPN47-IgG抗體按體積比1 1混合，其終濃度為1 4mg/mL ；三者點(diǎn)樣量為1 P L/cm。
6.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其 特征在于在步驟3)中，所述檸檬酸三鈉的濃度為2%。
7.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其 特征在于在步驟4)中，所述將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合， 是膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原以體積比1 0. 2 5混合。
8.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其 特征在于在步驟4)中，所述烘干的溫度為37°C。
全文摘要
梅毒特異性總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法，涉及一種梅毒特異性總抗體檢測試劑。設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、梅毒特異性總抗體檢測線、對照線和吸收墊。制備梅毒重組抗原TPN17和TPN47硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣；制備膠體金；膠體金與TPN17、TPN47的標(biāo)記；制備免疫層析檢測條。可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中梅毒特異性總抗體的檢測。在檢測時(shí)，所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測簡便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。
文檔編號G01N33/532GK101858914SQ20101017909
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者張忠英, 張長弓, 楊天賜, 林麗蓉 申請人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院