專利名稱：一種調(diào)控白念珠菌毒性的因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種調(diào)控白念珠菌毒性的因子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白念珠菌(Candida albicans)是一種臨床上分離到的一種機(jī)會(huì)性人體致病真菌， 在免疫下調(diào)的病人中，如器官移植病人、艾滋病毒感染者等，可以引起廣泛的淺部和深部系統(tǒng)感染，感染部位包括口腔、女性陰道等，引起鵝口瘡、陰道炎等疾病，也可以侵入表皮和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液到達(dá)內(nèi)臟器官，如腎臟、腦部等，導(dǎo)致敗血癥，嚴(yán)重可以導(dǎo)致死亡(Odds， F. C. 1994. J Am Acad Dermatol. 31 :S2_S5)。白念珠菌在不同的生長條件下，呈現(xiàn)不同的生長形態(tài)，包括菌體(yeast form)，假菌絲(pseudohyphae)和菌絲(hyphae)。各種形態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)化能力直接影響白念珠菌的致病能力(Odds,F. C. 1985. Grit Rev Microbiol. 12 45-93 ；Brown, A. J. P. et al. 1999. Trends Microbiol. 7 :334-338)，而形態(tài)轉(zhuǎn)換缺陷的菌株其系統(tǒng)感染能力下降或消失(Lo, H. J. et al，1997. Cell. 90 :939-949 ；Braun, B. R. et al. 2001. EMBO J. 20 :4753-61 ；Hwang, C. S. et al. 2003. Mol Microbiol. 47 :1029-43)。最近有些實(shí)驗(yàn)室利用減毒菌株作為疫苗來免疫小鼠，取得了比較好的效果， 并對其進(jìn)行了深入的生物化學(xué)分析，為疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)(Elena FA et al, Proteomics 2004,4,3007-3020 ；Elena FA et al，Proteomics2004，4，1204-1215)。許多培養(yǎng)條件可以引起白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換，包括血清、溫度、PH值、氮源利用以及氧壓等等。所有的細(xì)胞都必需具有檢測細(xì)胞外環(huán)境改變和外界因子刺激的能力，從而對各種信號做出正確應(yīng)答的能力。各種外界因子的刺激包括光、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子及氣味因子等。真核細(xì)胞通過不同的信號傳導(dǎo)途徑改變蛋白質(zhì)合成從而應(yīng)對各種外界因子刺激。一般來說， 信號途徑被認(rèn)為是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄從而改變胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。而最近的研究顯示對翻譯的調(diào)控也是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)重要方面。兩條重要的信號通路Ras和Akt主要介導(dǎo)了特定的mRNA和核糖體的結(jié)合。這種調(diào)控使核糖體對于正處于翻譯狀態(tài)的mRNAs的識別發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致蛋白合成水平的快速改變。目前對于白念珠菌真正的致病因子和致病機(jī)理沒有完全研究清楚，因此本領(lǐng)域還有必要研究白念珠菌的致病因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供白念珠菌減毒株(無毒株)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種篩選抑制白念珠菌的毒性的潛在物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種白念珠菌減毒株(無毒株)，所述的減毒株中 CaASCl基因基本上不表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的減毒株(caascl/caascl)中CaASCl基因或基因片段缺失。
在另一優(yōu)選例中，所述的減毒株通過同源重組的方法從野生型白念珠菌染色體中敲除CaASCl基因或基因片段獲得。在另一優(yōu)選例中，所述的CaASCl的基因(1)具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或(2)截短的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，且該基因不編碼 CaAscl蛋白或編碼降低活性(優(yōu)選活性降低50%，更優(yōu)選降低80%，更優(yōu)選無活性)的 CaAscl蛋白或蛋白片段。在另一優(yōu)選例中，相對于野生型白念珠菌，所述的減毒株的菌絲形成能力下降。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的白念珠菌減毒株的用途，用于制備防治(特別是預(yù)防)白念珠菌過度生長相關(guān)疾病的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的白念珠菌過度生長相關(guān)疾病選自(但不限于)鵝口瘡、 陰道炎。在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，所述的組合物含有有效量的所述的白念珠菌減毒株和藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是疫苗。在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制白念珠菌(抑制毒性或菌絲生長)的方法，所述方法包括抑制白念珠菌中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選抑制白念珠菌(抑制毒性或菌絲生長)的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)在測試組中，向表達(dá)CaAscl蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測 CaAscl蛋白的表達(dá)或活性；并且，在對照組中，在不添加所述候選物的、表達(dá)CaAscl蛋白的體系中，檢測CaAscl蛋白的表達(dá)或活性；(b)將步驟(a)測試組中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性與對照組中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性進(jìn)行比較，如果測試組中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，較佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；進(jìn)一步更佳的低60%或更低)對照組，就表明該候選物是抑制白念珠菌的毒性的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細(xì)胞體系、溶液體系。在本發(fā)明的另一方面，提供一種CaASCl基因的用途，用于鑒定待測白念珠菌的毒性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種鑒定待測白念珠菌毒性的方法，包括檢測待測白念珠菌中CaASCl基因的表達(dá)或活性，若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaASCl基因表達(dá)或活性提高，則該白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaASCl基因表達(dá)或活性降低，則該白念珠菌具有低的毒性或無毒性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種白念珠菌CaASCl基因或CaAscl蛋白的抑制劑的用途，用于制備抑制白念珠菌(抑制毒性或菌絲生長)的組合物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的CaAscl蛋白的抑制劑是特異性抗CaAscl蛋白的抗體。
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在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種抗體，所述的抗體特異性地抗CaAscl蛋白(與 CaAscl蛋白特異性結(jié)合)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖IA顯示了在白念珠菌中敲除CaASCl基因的策略。圖IB顯示了在白念珠菌CaASCl基因的敲除過程中各個(gè)菌株的PCR鑒定圖譜。圖IC顯示了在白念珠菌CaASCl基因的敲除過程中各個(gè)菌株的Southern雜交圖
■；並圖2顯示了白念珠菌caascl/caascl缺失株在菌絲誘導(dǎo)條件下，在液體和固體血清和李氏(Lee’s)培養(yǎng)基中的形態(tài)(圖2A)，在SCLD和SLAD液體培養(yǎng)基中的形態(tài)(圖2B)。圖3顯示了在小鼠系統(tǒng)感染試驗(yàn)中，CaASCl基因的敲除使白念珠菌毒性降低。注射液濃度為5X IO7細(xì)胞/毫升(圖3A)或5X106細(xì)胞/毫升(圖，每只小鼠尾靜脈注射100 μ 1菌液，共注射8只小鼠。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，首次在白念珠菌中分離出一種白念珠菌毒性相關(guān)的基因，本發(fā)明人將之命名為CaASCl基因。利用同源重組原理，本發(fā)明人在白念珠菌中構(gòu)建了 caascl/caascl缺失株，并證明CaASCl基因的表達(dá)與白念珠菌的菌絲發(fā)育和毒性表現(xiàn)密切相關(guān)。除非另外說明，所述的“白念珠菌ASCl基因”，“CaASCl基因”，“CaASCl ”，“ASC1 ”可互換使用，都是指白念珠菌的ASCl基因。“白念珠菌Ascl蛋白”，“CaAscl蛋白”，“CaAscl”， “Ascl”蛋白可互換使用，都是指白念珠菌的Ascl蛋白。除非另外說明，白念珠菌的減毒株(無毒株)用“caascl/caascl”表示，或用 "caascl/caascl缺失株”表示，或用“ascl/ascl”表示，或用“-/-”表示。白念珠菌的單拷貝缺失株用“ASCl/ascl ”表示，或用“CaASCl/caascl”表示，或用 “+/_”表示。白念珠菌的回復(fù)菌株用“caascl/caascl (CaASCl) ”表示，或用"caascl/ caascl+CaASCl”表示，或用-/_(+)表示。白念珠菌的野生型菌株用WT表示，或用+/+表
7J\ ο如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由.......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。白念珠菌(Candida albicans)是一種人體機(jī)會(huì)性致病真菌，能引起廣泛的深部和淺部感染，但是其真正的致病因子和致病機(jī)理以往沒有完全研究清楚。根據(jù)白念珠菌基因組序列(http://WWW. candidagenome. org/)，利用生物信息學(xué)比較分析，本發(fā)明人在白念珠菌的基因組序列中找到一個(gè)功能未知的新基因，該基因命名為白念珠菌CaASCl基因 (orfl9. 6906)。利用同源重組原理，本發(fā)明人在白念珠菌中構(gòu)建了 CaASCl基因雙拷貝敲除株caascl/caascl。CaASCl基因的敲除阻斷白念珠菌的菌絲生長。在小鼠系統(tǒng)感染試驗(yàn)中，caascl/caascl缺失株的毒性明顯下降。這些結(jié)果表明CaAscl正向調(diào)控白念珠菌的菌絲發(fā)育同時(shí)也影響該致病菌的毒性表現(xiàn)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的CaASCl的基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；CaASCl基因編碼區(qū)中有一個(gè)259bp的內(nèi)含子(SEQ ID NO :3)，本發(fā)明人通過逆轉(zhuǎn)錄合成了其cDNA序列。利用所述的cDNA序列，本發(fā)明人構(gòu)建了一個(gè)能表達(dá)不含內(nèi)含子的CaASCl 的表達(dá)載體，用于CaASCl基因功能互補(bǔ)試驗(yàn)。所述的CaASCl基因編碼CaAscl蛋白。CaAscl蛋白具有SEQ ID NO 4所示的氨
基酸序列。所述的CaASCl的基因也包括截短形式的CaASCl的基因(或稱為CaASCl基因片段)，只要該基因片段在被敲除后可導(dǎo)致CaAscl蛋白不表達(dá)或表達(dá)異常，或其表達(dá)的 CaAscl蛋白片段活性降低或沒有活性。根據(jù)本發(fā)明的揭示，本領(lǐng)域人員非常容易獲得所述的CaASCl的基因片段。所述的CaASCl的基因可以作為一種白念珠菌毒性鑒定的標(biāo)志物。例如可通過檢測待測白念珠菌中CaASCl基因的表達(dá)情況來確定白念珠菌的毒性；若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaASCl基因正常表達(dá)或過表達(dá)(即相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌中CaASCl基因的表達(dá)高20%或更高，更佳的高50%或更高)，則該白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaASCl基因低表達(dá)(如低20% 或更低；更佳地低50%或更低)或不表達(dá)，則該白念珠菌具有低的毒性或無毒性?；蚶缈赏ㄟ^檢測待測白念珠菌中CaAscl蛋白的活性來確定白念珠菌的毒性；若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaAscl蛋白活性正常或過于激活(即相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌中CaAscl蛋白的活性高20%或更高，更佳的高50%或更高)，則該白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaAscl蛋白的活性降低 (即相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌中CaAscl蛋白的活性低20%或更低，更佳的低 50%或更低)，則該白念珠菌具有低的毒性或無毒性。本發(fā)明還提供一種白念珠菌減毒株，該減毒株中CaASCl基因基本上不表達(dá)。所述的“基本上不表達(dá)”是指白念珠菌減毒株中CaASCl基因不表達(dá)或低表達(dá)。其中，CaASCl基因低表達(dá)是指該減毒株中CaASCl基因的表達(dá)量低于于野生型白念珠菌的20% ；較佳地低于野生型白念珠菌的10%;更佳地于野生型白念珠菌的5%或更低，最佳地低于野生型白念珠菌的2%或更低。CaASCl基因基本上不表達(dá)的菌株可以通過各種基因抑制、基因沉默、基因敲除等技術(shù)來構(gòu)建。例如，可以通過基于同源重組的基因敲除技術(shù)來將CaASCl基因從染色體上敲除，從而使得CaASCl基因缺失；可以針對CaASCl基因設(shè)計(jì)干擾性RNA或反義核苷酸來使CaASCl基因表達(dá)抑制或沉默。
一種使得CaASCl基因缺失的方法是基因敲除技術(shù)，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中， 體外構(gòu)建CaASCl基因敲除質(zhì)粒，通過同源重組的方法，把白念珠菌染色體中CaASCl基因敲除掉。所述的白念珠菌減毒株可以用于研究CaASCl基因基本上不表達(dá)后對于白念珠菌中其它基因表達(dá)情況的影響，以及研究CaASCl基因基本上不表達(dá)后白念珠菌的菌絲生長情況以及毒性情況。所述的白念珠菌減毒株可以用于制備疫苗，來免疫動(dòng)物，從而在不對動(dòng)物造成危害的情況下使得動(dòng)物對白念珠菌感染產(chǎn)生免疫力。本發(fā)明還提供了一種篩選抑制白念珠菌的毒性的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括向表達(dá)CaAscl蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測CaAscl蛋白的表達(dá)情況；如果CaAscl蛋白的表達(dá)情況在統(tǒng)計(jì)學(xué)上減弱，就表明該候選物是抑制白念珠菌的毒性的潛在物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的白念珠菌毒性抑制或菌絲生長抑制試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對于抑制白念珠菌毒性有用的物質(zhì)。本發(fā)明還提供一種白念珠菌CaASCl基因或蛋白的抑制劑或拮抗劑的用途，用于抑制白念珠菌的毒性。所述的白念珠菌CaASCl的抑制劑或拮抗劑例如是針對于CaASCl基因的干擾性RNA或反義核苷酸，其能夠特異性感染CaASCl的表達(dá)；或是特異性抗CaAscl蛋白的抗體；或是特異性結(jié)合CaAscl蛋白的配體等。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化 CaAscl蛋白或其活性片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。單克隆抗體可利用雜交瘤技術(shù)制備獲得(見Kohler等，Nature 256 ；495，1975 ； Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :511，1976 ；Kohler 等，Eur. J. Immunol. 6 -.292,1976 ； Hammerling 等，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., 1981)。在獲得了雜交瘤細(xì)胞以后，可采用本技術(shù)領(lǐng)域人員熟知的單克隆抗體制備技術(shù)來大量生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的單克隆抗體可以由下列制備方法所制備，所述方法包括步驟(1)提供佐劑預(yù)處理的小鼠；( 在小鼠腹腔內(nèi)接種所述的雜交瘤細(xì)胞并分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。作為本發(fā)明的一種方式，提供一種組合物，其含有有效量(如0. OOOl-IOwt% ；較佳的0. 001-5wt% )的所述的白念珠菌減毒株以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的，所述的組合物是疫苗，其可用于免疫動(dòng)物，使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，從而抵御白念珠菌的感染。所述的組合物對于動(dòng)物沒有可見的毒性和副作用。所述“有效量”是指可對人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。對于疫苗，所述的藥學(xué)上可接受的載體例如包括一種佐劑。所述組合物在用于給藥時(shí)，通常1 X IO3-I X IO9個(gè)細(xì)胞/kg體重，較佳的1 X IO4-I X IO8個(gè)細(xì)胞/kg體重是適合的；優(yōu)選的可進(jìn)行多次給藥，以產(chǎn)生良好的免疫效果，例如可間隔1-3周進(jìn)行重復(fù)給藥。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料和方法白念珠菌基因組DNA抽提白念珠菌培養(yǎng)過夜，用ddH20洗1次，懸浮在500 μ 1溶液A (1M山梨醇，IOOmM EDTA, ρΗ8· 0)中，加入5μ 1 20mg/ml的Zymolyase，37°C放置1小時(shí)后，高速離心去上清，細(xì)胞用 500 μ 1 的 TE 緩沖液(20mM Tris 'HCl pH7. 5，ImM EDTA)洗一次，懸浮在 350 μ 1 的 TE 緩沖液中，并加入 90μ 1 的溶液 BQ50mM EDTApH8. 0,400mM Tris · HCl pH8. 0,2% (v/v) SDS), 65°C放置30分鐘，加入80 μ 1的5Μ KAc，冰上放置1小時(shí)，高速離心5分鐘，吸取上清并加入Iml的無水乙醇，-20°C放置20分鐘，高速離心5分鐘，沉淀用70% (ν/ν)乙醇洗一次， 離心后烘干。Southern 雜交分析白念珠菌基因組DNA抽提后，基因組DNA用Bglll/EcoRV完全酶切，電泳完成后的瓊脂糖膠分別用變性液和中和液浸泡45min，尼龍膜用雙蒸水或10 X SSC浸透，搭好轉(zhuǎn)膜平臺(tái)，膠與膜間用Parafilm封閉，加一個(gè)500g砝碼。以10 X SSC為轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)移過夜，第二天漂洗晾干交聯(lián)。交聯(lián)后的膜裝入雜交管，加入IOml預(yù)雜交液(6XSSC，5Xdenhardt’ s Reagent, 0. 5% (v/v) SDS, 100 μ g/ml 魚精 DNA 于 42°C預(yù)雜交 12h，探針在 100°C變性 5min， 加入150μ 1探針(約1/3所標(biāo)記的探針)42°C雜交10-16h。0. 1XSSC,0. 1% (v/v) SDS洗兩到三次，每次40min，取出膜，晾干，室溫或-70°C壓片。探針標(biāo)記用hvitrogene的隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，照其說明操作。將含25ng DNA的溶液于100°C加熱變性5-lOmin，置于冰浴中，再依次力口入 Random Primers Buffer Mixture, 2 μ 1 dCTP,2y 1 dGTP,2y 1 dTTP, 3 μ 1 [ α -32P] -dATP (10 μ Ci/μ 1)，混勻后加入 1 μ IKlenow 酶，于 25°C保溫 lh,以 Sephadex G-25柱以3000rpm離心％iin，收集離心液，即為純化后的探針溶液。探針于100°C變性5min 冰上冷卻后加入雜交體系中。白念珠菌的轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備PEG/LiAc 溶液(pH 7. 5) IOml ；在 1. 5ml Eppendof 管中依次加入質(zhì)粒 5 μ g, 10 μ 110mg/ml魚精DNA，混勻；加入0. Iml感受態(tài)細(xì)胞和0. 6ml PEG/LiAc,震蕩混勻； 300C 200rpm培養(yǎng)30min ；加入70 μ 1 DMSO,輕輕混勻；42°C熱沖擊15min，期間不時(shí)輕輕搖勻；冰浴aiiin 高速離心15s，吸掉上清，用0. 2mlTE重懸細(xì)胞；涂布于適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)篩選SD平板上。pBAl-ASCl表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以及回復(fù)菌株的制備
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構(gòu)建pBAl-ASCl表達(dá)質(zhì)粒用于制備回復(fù)菌株，抽提野生型菌株SC5314 (WT)(參 JAL Fonzi, W. A. and Μ. Y. Irwin, Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics, 1993. 134(3) :p. 717-28.)的 mRNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后利用引物 CaASClF (5，GCTATCGATATGGCTGATCAAGAAGTTTTAG)和 CaASClR (5，GTCGGTACCTTAAGCAG ATGGAGTCATAACT)PCR擴(kuò)增不含內(nèi)含子的CaASCl全長編碼區(qū)DNA片段，插入到pBAl (參見 Cao,F. ,et al. ,The Flo8Transcription Factor Is Essential for Hyphal Development and Virulence in Candida albicans. Mol Biol Cell, 2006. 17(1) :p. 295—307.)的多克隆位點(diǎn)，得到pBAl-ASCl表達(dá)質(zhì)粒。pBAl-ASCl用限制性內(nèi)切酶線性化，轉(zhuǎn)化caascl/caascl雙拷貝缺失株，得到回復(fù)菌株。Northern 雜交分析各菌株在YPD，30°C中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，轉(zhuǎn)接至YPD起始OD = 0. 05，并在相應(yīng)溫度下培養(yǎng)指定時(shí)間，用熱酚法抽提白念珠菌總RNA。20 μ 1上樣量包括RNA樣品 12μ 1(25μ g),4y 1 甲醛，2μ 1 10XM0PS,2y 1 上樣緩沖液、65°C加熱 10min，0°C冷卻 2min，離心k，上樣。電泳在含甲醛的變性膠上進(jìn)行(lg瓊脂糖，IOml 10XMOPS, 87ml DEPC 處理水，加熱融化稍冷后加入2.7ml 37% (ν/ν)甲醛)。電泳條件為100mA，50-70V，5_7h 電泳完成后同樣用毛細(xì)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜液用5XSSC。轉(zhuǎn)膜過夜后，取出膜，不能使膜干透，用 Bio-Ra GS Gene Linker C3protocol 紫外交聯(lián)，加入 IOml 預(yù)雜交液，65°C，2h后更換為 IOml 雜交液，加入探針65°C雜交過夜，用2XSSC，0. 1% &八)303，651洗膜兩次，每次301^11。雜交好的膜不要晾干，用保鮮膜包好后-70°C壓片。重雜交洗膜用0.5% (v/v) SDS, 90-100°C 加熱5-10min，或按照Clontech推薦用0.5% (v/v) SDS, 90-100°C加熱IOmin后讓其自然冷卻IOmin后取出備用，若不立即位用，用保鮮膜包好后置于-20°C保存。引物核苷酸序列本發(fā)明的方法所用的引物的核苷酸序列如表1。表 權(quán)利要求
1.一種白念珠菌減毒株，其特征在于，所述的減毒株中CaASCl基因基本上不表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的減毒株，其特征在于，所述的減毒株中CaASCl基因或基因片段缺失。
3.如權(quán)利要求1所述的減毒株，其特征在于，其通過同源重組的方法從野生型白念珠菌染色體中敲除CaASCl基因或基因片段獲得。
4.如權(quán)利要求1所述的減毒株，其特征在于，所述的CaASCl的基因(1)具有SEQID NO :1或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或(2)截短的SEQID NO 1或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，且該基因不編碼CaAscl 蛋白或編碼降低活性的CaAscl蛋白或蛋白片段。
5.如權(quán)利要求1所述的減毒株，其特征在于，相對于野生型白念珠菌，所述的減毒株的菌絲形成能力下降。
6.權(quán)利要求1所述的白念珠菌減毒株的用途，用于制備防治白念珠菌過度生長相關(guān)疾病的組合物。
7.一種組合物，其特征在于，所述的組合物含有有效量的權(quán)利要求1-5任一所述的白念珠菌減毒株和藥學(xué)上可接受的載體。
8.一種抑制白念珠菌的方法，所述方法包括抑制白念珠菌中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性。
9.一種篩選抑制白念珠菌的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在測試組中，向表達(dá)CaAscl蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測CaAscl蛋白的表達(dá)或活性；并且，在對照組中，在不添加所述候選物的、表達(dá)CaAscl蛋白的體系中， 檢測CaAscl蛋白的表達(dá)或活性；(b)將步驟(a)測試組中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性與對照組中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性進(jìn)行比較，如果測試組中CaAscl蛋白的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對照組，就表明該候選物是抑制白念珠菌的毒性的潛在物質(zhì)。
10.一種CaASCl基因的用途，用于鑒定待測白念珠菌的毒性。
11.一種鑒定待測白念珠菌毒性的方法，包括檢測待測白念珠菌中CaASCl基因的表達(dá)或活性，若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaASCl基因表達(dá)或活性提高，則該白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；若相對于野生型白念珠菌，待測白念珠菌CaASCl基因表達(dá)或活性降低，則該白念珠菌具有低的毒性或無毒性。
12.一種白念珠菌CaASCl基因或CaAscl蛋白的抑制劑的用途，用于制備抑制白念珠菌的組合物。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述的CaAscl蛋白的抑制劑是特異性抗 CaAscl蛋白的抗體。
14.一種抗體，其特征在于，所述的抗體特異性地抗CaAscl蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種調(diào)控白念珠菌毒性的因子及其應(yīng)用。本發(fā)明首次揭示CaASC1基因在白念珠菌中是一個(gè)重要的毒性因子。本發(fā)明還公開了一種白念珠菌減毒株，所述的減毒株中CaASC1基因基本上不表達(dá)。
文檔編號G01N33/68GK102337218SQ201010233160
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者丁宇烽, 劉曉艷, 聶鑫怡, 陳江野 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院