專利名稱：高遷移率族蛋白b1作為電離輻射生物劑量計的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電離輻射生物劑量計，具體涉及高遷移率族蛋白Bl(High mobility group box LHMGB1)作為電離輻射生物劑量計的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核能的和平應(yīng)用以及放射性核素在醫(yī)學(xué)、工業(yè)和農(nóng)業(yè)等各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用給人類 帶來了巨大的利益。核技術(shù)在造福人類的同時，也對公共安全與公眾健康構(gòu)成了潛在的威 脅。因此，正確估算輻射事故受照者及腫瘤放療病人的受照劑量，有利于改進輻射防護措 施、指導(dǎo)臨床治療、預(yù)測病情發(fā)展。多年來輻射生物劑量估算領(lǐng)域已開展了大量工作，雖然 已建立了多種輻射生物劑量計，然而在實際應(yīng)用中均不同程度存在耗時、費力、費用昂貴等 問題，仍不十分理想。因此，近來國內(nèi)外相關(guān)實驗室進行了一些新生物劑量計的研究，如 GADD45 (growth arrest and DNA damage gene 45)基因表達測定、線粒體DNA基因突變分 析等，迄今這些研究也還處于探索、嘗試階段，因而有必要尋找新型、快速、可靠的電離輻射 生物劑量指標。高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1, HMGB1)是上世紀70年代發(fā)現(xiàn)的 存在于真核細胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中 遷移速度快而得名。HMGBl普遍存在于哺乳動物組織細胞中，而在胸腺、淋巴組織等組織中 呈高表達。以前人們較關(guān)注HMGBl的核蛋白功能，1999年Wang等首次報道HMGBl作為新 的、潛在的晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過程，是內(nèi)毒素致死效應(yīng)的晚期重要炎癥介 質(zhì)。近年還發(fā)現(xiàn)細胞外的HMGBl可通過多種機制促進腫瘤的存活、生長和轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的 發(fā)生和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供高遷移率族蛋白Bl (High mobility group box 1，HMGB1)作為 電離輻射生物劑量計的應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是高遷移率族蛋白Bl(High mobility group box 1,HMGB1)作為電離輻射生物劑量計的應(yīng)用。一種檢測離體細胞所受的輻照劑量的方法，包括以下步驟(1)按照常規(guī)方法培養(yǎng)離體細胞，將離體細胞置于已知輻射強度的環(huán)境中接受輻 照，然后在兩個以上時間點采集輻射照射后的離體細胞，測定其中的高遷移率族蛋白Bl的 表達水平，獲得該離體細胞的接受的輻照劑量和高遷移率族蛋白Bl表達水平的關(guān)系的標 準曲線；(2)收集接受了待測劑量的輻射照射的離體細胞，測定其中的高遷移率族蛋白Bl 的表達水平，根據(jù)步驟(1)獲得的標準曲線計算得到該離體細胞所受的輻照劑量。上述技術(shù)方案中，所述離體細胞選自小鼠成纖維細胞、人外周抗凝全血細胞、人 宮頸癌細胞-HeLa、乳腺癌細胞_MCF_7、人肺癌細胞-A549或正常人成纖維母細胞株GM細胞以及其它組織器官細胞樣品。上述技術(shù)方案中，測定離體細胞中的高遷移率族蛋白Bl的表達水平的方法為采 用Western blot方法和HMGBl檢測試劑盒測定離體細胞中的HMGBl的蛋白表達水平。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點由于離體細胞輻照后，尤其是血液在輻照后，其中HMGBl含量的增加與受到的電 離輻射劑量成正比，存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且于照射后24h即可采用ELISA法等簡便 易行的方法進行快速檢測，因此，HMGBl可作為輻射生物劑量計；并且可以采用HMGBl測量 人體和動物受到電離輻射輻照后的生物輻射劑量。


圖1為實施例一中指數(shù)生長的L929細胞經(jīng)不同劑量的X-線照射后24小時后完 成Western Blot法測定HMGBl蛋白含量；圖2為實施例二中人抗凝外周血經(jīng)不同量X射線照射4小時候HMGBl蛋白表達 量的變化圖；圖3為實施例二中人抗凝外周血經(jīng)不同量X射線照射24小時候HMGBl蛋白表達 量的變化圖；圖4為實施例三中不同劑量6tlCo γ線引起GM細胞中HMGBl釋放的劑量-效應(yīng)曲 線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一不同劑量電離輻射體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞培養(yǎng)液中HMGBl蛋白釋放的劑 量-效應(yīng)關(guān)系(1)材料小鼠成纖維細胞株L929購于美國細胞收藏中心(ATCC)，并由本實驗室 保存和培養(yǎng)；RPMI 1640培養(yǎng)基干粉，小牛血清，胰酶購自Gibco公司；amicon超濾離心管 購自美國Millipore公司。標準蛋白質(zhì)分子量、SDS-PAGE上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、 TE電泳緩沖液、IOX轉(zhuǎn)膜液、30% Acry-BiS、TriS-Hcl、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺 (TEMED)購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；二甲基亞砜(DMSO)、瓊脂糖和Tween-20來自上 海高科技生物工程有限公司；抗HMGBl等抗體購自美國Santa Cruzs生物技術(shù)公司。人類 HMGBl蛋白ELISA檢測試劑盒購自上海西悅生物科技有限公司。(2)細胞培養(yǎng)L929細胞培養(yǎng)于含10 %小牛血清，谷氨酸胺及100萬U/L青霉素 和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。細胞置于5% CO2, 37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天傳代1次， 取對數(shù)生長期細胞用于實驗。(3)照射將步驟(2)所得細胞置于直線加速器下，射線性質(zhì)為高能6兆伏χ-線， 照射野為IOcmX IOcm，源皮距為100cm，劑量率為200CGy/min。照射時培養(yǎng)皿面上覆蓋 1. 5cm厚等效蠟板以調(diào)整照射劑量。(4)Western Blot法測定小鼠成纖維細胞培養(yǎng)液中HMGBl蛋白的量收集等量細 胞培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)至15ml的amicon超濾離心管中離心(4000Rcf/m) 20分鐘進行樣品濃集，采
4用分光光度計檢測樣品蛋白含量。各取等量樣品加入蛋白上樣緩沖液(5X)混勻，于100°C 加熱5分鐘，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜上。膜采用封閉液(5%脫脂奶粉， 1 X T-BST緩沖液)封閉1小時。T-BST緩沖液洗滌3次，并加入一抗HMGBl (1 500稀釋)， 室溫孵育1小時。T-BST緩沖液洗膜3次，加入二抗(1 1000稀釋)孵育1小時。T-BST 緩沖液洗膜3次，最后加ECL發(fā)光劑，顯影、定影，膠片洗滌和干燥后，對所得結(jié)果進行掃描 分析。結(jié)果如圖1所示，指數(shù)生長的L929細胞經(jīng)0，3，6Gy的χ -線照射后24小時采用 超濾離心法收集細胞培養(yǎng)液上清，采用Western Blot法檢測其中HMGBl蛋白的含量，結(jié)果 顯示與未受電離輻射對照組相比，經(jīng)3Gy χ -線照射后培養(yǎng)液中HMGBl含量增加了 11 %， 6Gy χ -線照射后HMGBl含量增加了 37 %。實驗結(jié)果說明電離輻射后體外培養(yǎng)細胞釋放至胞 外的HMGBl蛋白量隨照射劑量的增加相應(yīng)增加，與照射劑量正相關(guān)，呈現(xiàn)出一定的劑量_效 應(yīng)關(guān)系。實施例二不同劑量電離輻射人外周抗凝全血中HMGBl蛋白釋放的劑量-效應(yīng)關(guān)系(1)人外周血采集，實驗用人抗凝外周靜脈血來自3例健康獻血員，1男2女，年齡 為30歲左右，要求不吸煙，不飲酒，身體健康，無慢性病史，半年內(nèi)無受照和炎癥疾病。每 人各采血20ml，分裝于6個小瓶，在室溫分別接受χ -射線照射0，3，6Gy，照后于37°C靜置 4h、24h收集血漿樣本。(2) ELISA法測定步驟(1)所得人外周抗凝全血樣本中HMGBl蛋白的量操作步驟 參見試劑盒使用說明，主要過程為各取100 μ 1樣品加入酶標板加樣孔，混勻后于37°C條 件下作用2小時，棄去樣品液，充分洗滌4-6次。各孔加入一抗溶液100μ 1，37°C作用1小 時，洗滌加樣孔4-6次。加入酶標抗體100μ1，37 作用30分鐘，充分洗滌4-6次。各孔加 入100 μ 1底物反應(yīng)液，37°C作用15分鐘，加入終止液各100 μ 1，于酶標儀上讀取450nm波 長吸光值，并對所得結(jié)果進行分析。(3)人抗凝外周血經(jīng)0，3，6Gyx-線照射后于37°C靜置4小時，離心獲取血漿， 采用ELISA法測定HMGBl蛋白表達，其結(jié)果如圖2所示，與未受照射的對照組血液樣品相 比，經(jīng)3Gy χ -線照射后4h人抗凝外周靜脈血中HMGBl含量已出現(xiàn)不同程度的增加(增幅 分別為17. 6%，5. 4%,10.9% ),6Gyx-線照射后HMGBl含量增加則更明顯(增幅分別為 25. 2%,63. 4%,52. 7% )。人抗凝外周血經(jīng)0，3，6Gy χ -線照射后于37°C靜置24小時，離心獲取血漿，采用 ELISA法測定HMGBl蛋白表達，其結(jié)果如圖3所示，χ -線照射后24h人抗凝外周靜脈血中 HMGBl含量仍檢測到不同程度的增加3Gy照射組增幅分別為23%，7%，1 %，6Gy照射組增 幅分別為50%,28%,25%0這些實驗結(jié)果說明受到的電離輻射后早期即可檢測到人抗凝外周靜脈血中HMGBl 蛋白的釋放量的增加，且與照射劑量成正比；隨著照射后時間的延長，HMGBl依賴于照射劑 量的釋放量的增加仍穩(wěn)定存在；并且上述HMGBl在血液中的含量變化可采用簡便易行的 ELISA方法進行檢測。實施例三(1) GM細胞培養(yǎng)在含10 %小牛血清，谷氨酸胺及100萬U/L青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。(2)采用不同劑量水平的6tlCo γ線照射步驟⑴所得GM細胞培養(yǎng)液，按照實施例 二的方法，采用ELISA法檢測輻照后細胞培養(yǎng)液中HMGBl蛋白含量的變化照后24h直接收 集細胞培養(yǎng)液上清，按照實施例二的方法，采用ELISA法對其中HMGBl含量進行檢測，結(jié)果 如表1、圖4所示。如表1所示，培養(yǎng)液中HMGBl含量隨照射劑量的增加而逐漸增加與未受照射對照 組相比，各照射劑量組HMGBl含量均顯著增加(0. 5Gy, IGy, 2Gy和4Gy照射組P < 0. 05,8Gy 照射組P <0.01)。表1不同劑量60Co γ線照射后GM細胞培養(yǎng)液中HMGBl蛋白釋放量
權(quán)利要求
高遷移率族蛋白B1作為電離輻射生物劑量計的應(yīng)用。
2.一種檢測離體細胞所受的輻照劑量的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)按照常規(guī)方法培養(yǎng)離體細胞，將離體細胞置于已知輻射強度的環(huán)境中接受輻照，然 后在兩個以上時間點采集輻射照射后的離體細胞，測定其中的高遷移率族蛋白Bl的表達 水平，獲得該離體細胞的接受的輻照劑量和高遷移率族蛋白Bl表達水平的關(guān)系的標準曲 線.一入 ，(2)收集接受了待測劑量的輻射照射的離體細胞，測定其中的高遷移率族蛋白Bl的表 達水平，根據(jù)步驟(1)獲得的標準曲線計算得到該離體細胞所受的輻照劑量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測離體細胞所受的輻照劑量的方法，其特征在于，所述離體 細胞選自小鼠成纖維細胞、人外周抗凝全血細胞、人宮頸癌細胞、乳腺癌細胞、人肺癌細胞 或正常人成纖維母細胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于電離輻射生物劑量計，具體涉及高遷移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)作為電離輻射生物劑量計的應(yīng)用，由于離體細胞輻照后，尤其是血液在輻照后，其中HMGB1含量的增加與受到的電離輻射劑量成正比，存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且于照射后24h即可采用ELISA法等簡便易行的方法進行快速檢測，因此，HMGB1可作為輻射生物劑量計；并且可以采用HMGB1測量人體和動物受到電離輻射輻照后的生物輻射劑量。
文檔編號G01T1/02GK101975964SQ20101025929
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者樊賽軍, 焦旸 申請人:蘇州大學(xué)