專利名稱：熒光圖像產(chǎn)生方法、設(shè)備和程序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及熒光圖像產(chǎn)生方法、熒光圖像產(chǎn)生設(shè)備和熒光圖像產(chǎn)生程序，例如，適 合用于觀察組織切片領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
通常，在病理學(xué)領(lǐng)域，在生物樣品使用之前將其固定至底基(例如，載玻片)并且 以預(yù)定方式對生物樣品染色。在病理診斷中，首先用通過在組織切片上執(zhí)行蘇木素-伊紅(HE)染色或在分泌物 細(xì)胞上執(zhí)行巴氏染色而形成的樣品從形態(tài)學(xué)的角度來確定惡性腫瘤的存在。如果發(fā)現(xiàn)惡性 腫瘤或具有惡性腫瘤的可疑位置，然后用通過在組織切片或分泌物細(xì)胞上執(zhí)行熒光染色而 形成的樣品，從分子生物學(xué)角度來確定惡性腫瘤的存在、類型和階段。在這種樣品儲存較長的時間后，通常，出現(xiàn)質(zhì)量變差和生物樣品變色，并且，生物 樣品在顯微鏡下的可見度也降低。因為有時在除了產(chǎn)生樣品的機構(gòu)(例如醫(yī)院)以外的實 驗室中診斷這種樣品，所以通常用郵件發(fā)送生物樣品，這花費一定的時間?？紤]到這種情況，提出一種用于以圖像數(shù)據(jù)的形式儲存生物樣品的設(shè)備(例如， 見日本未審查的專利申請No. 2003-222801)。順便說一句，在獲得放大至預(yù)定比例的整個生物樣品的圖像的情況中，難以對成 像表面形成完整圖像，因此，通常使用這樣的技術(shù)對生物樣品切片并且將切片部分的放大 部分連接在一起。因為此技術(shù)包括相對于樣品的每個部分移動鏡臺以在樣品上聚焦的步 驟，所以花費更長的時間來連接各部分的放大部分。

發(fā)明內(nèi)容
然而，在連接樣品部分(執(zhí)行了熒光染色)的放大圖像的情況中，由于花費更長的 時間來連接各部分的放大部分，所以，不僅使標(biāo)記到靶的熒光材料的變色加速，而且使生物 樣品負(fù)擔(dān)過大。另一方面，不將執(zhí)行了熒光染色的樣品作為圖像，因為其在未激發(fā)狀態(tài)是透明和 無色的，因此，難以基于圖像的對比度在圖像上聚焦。因此，期望提供熒光圖像獲取方法、熒光圖像獲取設(shè)備和熒光圖像獲取程序，其能 夠在圖像上聚焦，而不會使標(biāo)記到靶的熒光材料的變色加速或者不會使生物樣品負(fù)擔(dān)過 大。在一個實施方式中，提供一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法。該方法包括基 于第一熒光材料的熒光在生物樣品上聚焦，其中，用第一熒光材料和第二熒光材料對生物樣品染色；并且，基于第二熒光材料的熒光捕獲圖像，其中，第一和第二熒光材料具有不同 的激發(fā)波長。在一個實施方式中，在暗場成像模式下產(chǎn)生圖像。在一個實施方式中，在暗場成像模式和明場成像模式下產(chǎn)生圖像。在一個實施方式中，將圖像捕獲為完整圖像。在一個實施方式中，將圖像捕獲為部分圖像。在一個實施方式中，將圖像捕獲為多個部分圖像，所述多個部分圖像被連接以形 成圖像。在一個實施方式中，由包括對聚焦和捕獲的控制的數(shù)據(jù)處理單元控制圖像產(chǎn)生。在一個實施方式中，在聚焦之后，由數(shù)據(jù)處理單元驅(qū)動激發(fā)光源，以啟動圖像捕
-M-犾。在一個實施方式中，在預(yù)定位置聚焦生物樣品的一部分。在一個實施方式中，在可變位置聚焦生物樣品的一部分。在另一實施方式中，提供一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備。該設(shè)備包括 基部單元，被配置為容納用具有不同激發(fā)波長的第一熒光材料和第二熒光材料染色的生物 樣品；第一光源，被配置為照射生物樣品從而允許基于第一熒光材料的熒光聚焦生物樣品； 以及第二光源，被配置為照射生物樣品從而允許基于第二熒光材料的熒光捕獲圖像。在一個實施方式中，該設(shè)備進(jìn)一步包括數(shù)據(jù)處理單元，被配置為用于控制圖像產(chǎn) 生，包括與基部單元、第一光源和第二光源通信。在一個實施方式中，數(shù)據(jù)處理單元停止驅(qū)動第一光源，并開始驅(qū)動第二光源，以啟 動圖像捕獲。在另一實施方式中，提供了計算機可讀存儲裝置，用于儲存指令使數(shù)據(jù)處理單元 工作，從而基于第一熒光材料的熒光而在生物樣品上聚焦，其中，用第一熒光材料和第二熒 光材料對生物樣品染色；并基于第二熒光材料的熒光捕獲與生物樣品相關(guān)的圖像，其中，第 一和第二熒光材料具有不同的激發(fā)波長。在又一實施方式中，提供一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法。該方法包括以 第一激發(fā)波長照射生物樣品；在生物樣品上聚焦；以第二激發(fā)波長照射生物樣品；并捕獲 與生物樣品相關(guān)的圖像。在又一實施方式中，提供一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備。該設(shè)備包括第 一光源，被配置為以第一激發(fā)波長照射生物樣品從而允許對生物樣品進(jìn)行聚焦；和第二光 源，被配置為以第二激發(fā)波長照射生物樣品從而允許捕獲圖像。根據(jù)一個實施方式，當(dāng)獲取聚焦對象的暗場圖像時，使用用于將被標(biāo)記至用于復(fù) 染色的對照(其含量超過靶)的熒光材料的激發(fā)光照射樣品部分，并且，當(dāng)獲取記錄對象的 暗場圖像時，使用用于將被標(biāo)記至靶的熒光材料的激發(fā)光照射樣品部分。因此，可以使用將被標(biāo)記至用于復(fù)染色的對照(其含量超過靶)的熒光材料的樣 品部分的圖像來調(diào)節(jié)焦距，而不會使將被標(biāo)記至靶的熒光材料發(fā)光。結(jié)果，能夠調(diào)節(jié)焦距， 而不會使將被標(biāo)記至靶的熒光材料的變色加速或者不會使生物樣品負(fù)擔(dān)過多。這里描述了其它特征和優(yōu)點，并且，從以下詳細(xì)描述和附圖，這些特征和優(yōu)點將是 顯而易見的。


圖1示意性地示出了生物樣品圖像獲取設(shè)備的構(gòu)成；圖2示意性地示出了熒光圖像；圖3是示出了數(shù)據(jù)處理單元的構(gòu)成的框圖；圖4是示出了執(zhí)行明場成像模式的中央處理器(CPU)的功能構(gòu)成的框圖；圖5是示出了明場完整圖像的照片；圖6是用于說明生物樣品的成像區(qū)域的分配的示意圖；圖7是示出了執(zhí)行暗場成像模式的中央處理器(CPU)的功能構(gòu)成的框圖；圖8是示出了對照標(biāo)記的暗場部分圖像的照片；圖9A和圖9B是示出了用作聚焦對象的圖像的實例的示意圖；圖10是示出了對照標(biāo)記和熒光標(biāo)記的暗場部分圖像的照片；圖11是示出了暗場圖像獲取過程的流程圖；圖12示意性地示出了根據(jù)另一實施方式的對照標(biāo)記激發(fā)光源的配置；圖13示意性地示出了根據(jù)又一實施方式的對照標(biāo)記激發(fā)光源的另一配置。
具體實施例方式將在下面參照根據(jù)一個實施方式的附圖更詳細(xì)地說明本申請。1.實施方式1--1.生物樣品圖像獲取設(shè)備的構(gòu)成
1--2.顯微鏡的構(gòu)成
1--3.數(shù)據(jù)處理單元的構(gòu)成
1--4.明場成像模式的具體處理
1--5.暗場成像模式的具體處理
1--6.暗場成像模式中的圖像獲取處理
1--7.效果
2.其它實施方式1.實施方式1-1.生物樣品圖像獲取設(shè)備的構(gòu)成圖1示出了根據(jù)一個實施方式的生物樣品圖像獲取設(shè)備1。生物樣品圖像獲取設(shè) 備1包括顯微鏡10和數(shù)據(jù)處理單元20。1-2.顯微鏡的構(gòu)成顯微鏡10包括鏡臺(下面也稱為可移動鏡臺)31，其可在平行于和垂直于載片 SG(例如，載玻片)放置于其上的平面(在下面也稱為載片放置平面)的所有方向(χ軸、y 軸和ζ軸方向)上移動。在載片放置平面上設(shè)置載片支架32。當(dāng)設(shè)置載片SG時，將載片支架32移動至被指定為設(shè)置位置(在下面也稱為載片 設(shè)置位置)的位置。在載片設(shè)置位置，將包含在載片容器(未示出)中的載片SG移出，并 用載片設(shè)置機構(gòu)(未示出)將其設(shè)置在載片支架32中。通過預(yù)定的固定技術(shù)將包括諸如血液的結(jié)締組織、上皮組織或這二者的組織切片或分泌細(xì)胞作為生物樣品SPL固定至包含在載片容器(未示出)中的載片SG，如果必須的 話進(jìn)行染色。染色不僅包括以蘇木素-伊紅(HE)染色、吉姆薩染色和巴式染色為代表的典型的 染色技術(shù)，而且包括以熒光原地雜化(FISH)和酶抗體技術(shù)為代表的熒光染色技術(shù)。除了施加至探針的熒光標(biāo)志(下面也稱為熒光標(biāo)記)以外，熒光染色技術(shù)通常使 用另一種與探針上的熒光標(biāo)記進(jìn)行對比的熒光標(biāo)志(在下面也稱為對照標(biāo)記)。對照標(biāo)記的激發(fā)波長不同于與熒光標(biāo)記的激發(fā)波長。例如，該激發(fā)波長可以是大 約365nm，并且，通常使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。通過DAPI，與熒光標(biāo)記的靶 對比的靶(在下面也稱為對照靶)是細(xì)胞核。當(dāng)獲取生物樣品SPL的圖像時，將載片支架32移動至被指定為用于顯微檢查的位 置(在下面也稱為顯微位置)。在此情況中，執(zhí)行明場成像模式或暗場成像模式。在明場成像模式的情況中，從明場光源41發(fā)出照明光，到達(dá)生物樣品SPL。照明光 由反射鏡42反射，通過明場濾光片43作為可見光照射在顯微位置中的生物樣品SPL上，然 后到達(dá)物鏡44。物鏡44的放大率低至能夠形成整個生物樣品SPL的圖像(下面也稱為明場完整 圖像)，或者高至能夠僅形成部分生物樣品SPL的圖像(在下面也稱為明場部分圖像)。在用物鏡44和成像透鏡45放大圖像之后，顯微鏡10將通過成像裝置46的成像 表面上的照明光而獲得的生物樣品SPL的圖像形成為明場完整圖像或明場部分圖像。如上所述，將顯微鏡10被配置為在明場成像模式中獲得生物樣品SPL的完整的或 部分的明場圖像(明場完整圖像或明場部分圖像)。在圖1中，在物鏡44和成像透鏡45之間的光路上具有分色鏡54和發(fā)射濾光片 (emission filter) 55.然而，在明場成像模式的情況中，從光路移開分色鏡54和發(fā)射濾光 片55，使得通過明場濾光片43進(jìn)入的可見光不被分色鏡和濾光片吸收或反射。另一方面，在暗場成像模式的情況中，激發(fā)探針上的熒光標(biāo)記和對照標(biāo)記的光 (在下面也稱為激發(fā)光)從激發(fā)光源51發(fā)出。當(dāng)發(fā)出激發(fā)光時的物鏡44的放大率高至能 夠形成生物樣品SPL的熒光圖像的一部分(下面也稱為暗場部分圖像)。 準(zhǔn)直透鏡52使得從激發(fā)光源51發(fā)出的激發(fā)光成為平行光束，并且，激發(fā)濾光片53 消除除了激發(fā)光以外的光。透過激發(fā)濾光片53的激發(fā)光被分色鏡54反射，然后由物鏡44 在顯微位置上聚焦。當(dāng)探針結(jié)合至顯微位置的生物樣品SPL的靶和對照靶時，施加至探針的熒光標(biāo)記 和對照標(biāo)記由激發(fā)光產(chǎn)生熒光。熒光經(jīng)由物鏡44透過分色鏡54，并在除了熒光材料的熒光 以外的光被發(fā)射濾光片55吸收之后到達(dá)成像透鏡45。顯微鏡10用物鏡44和成像透鏡45放大通過熒光標(biāo)記和對照標(biāo)記的熒光而獲得 的圖像，并在成像裝置46的成像表面上形成放大的圖像作為暗場部分圖像。如上所述，將顯微鏡10被配置用于在暗場成像模式下獲得樣品部分的熒光圖像 (暗場部分圖像)。雖然圖1示出了激發(fā)濾光片53和分色鏡54之間的光路上的分色鏡63，但是分色 鏡63透射透過激發(fā)濾光片53的激發(fā)光。圖2示出了 生物樣品SPL的熒光圖像的一個實例(暗場部分圖像)。使用由Abbottlaboratories生產(chǎn)的被稱為PathVysionHER_2DNA探針試劑盒的試劑，通過FISH技術(shù)染色 乳腺組織來獲得圖2所示的圖像。圖2中的箭頭所指示的點代表熒光標(biāo)記，具體是施加至用于編碼HER2蛋白質(zhì)的 HER2/neu基因的探針的熒光標(biāo)記。圖2中的具有陰影的集中區(qū)域代表形成與HE染色的組 織的外形基本上一致的外形的對照標(biāo)記。雖然試劑包括用于第17染色體的著絲點區(qū)域中的α隨體DNA序列的探針和用于 HER2/neU基因的探針的熒光標(biāo)記，但是，為了方便起見，在圖2中省略了所述熒光標(biāo)記。除了上述構(gòu)成外，顯微鏡10還包括被配置為發(fā)出激發(fā)對照標(biāo)記而不激發(fā)熒光標(biāo) 記的激發(fā)光(在下面也稱為對照標(biāo)記專用激發(fā)光)的光源(下面也稱為對照標(biāo)記激發(fā)光 源)61。當(dāng)獲取生物樣品SPL的暗場部分圖像時，在聚焦過程中從對照標(biāo)記激發(fā)光源61發(fā) 出對照標(biāo)記專用激發(fā)光。從對照標(biāo)記激發(fā)光源61發(fā)出的對照標(biāo)記專用激發(fā)光由準(zhǔn)直透鏡62變?yōu)槠叫泄?束，由分色鏡63和分色鏡54反射，然后由物鏡44在顯微位置上聚焦。當(dāng)探針結(jié)合至在顯微位置的生物樣品SPL的對照靶時，施加至探針的對照標(biāo)記通 過對照標(biāo)記專用激發(fā)光產(chǎn)生熒光。熒光經(jīng)由物鏡44透過分色鏡54，并在除了熒光材料的熒 光以外的光被發(fā)射濾光片55吸收之后到達(dá)成像透鏡45。顯微鏡10用物鏡44和成像透鏡45放大通過對照標(biāo)記的熒光而獲得的圖像，并在 成像裝置46的成像表面上形成放大的圖像作為暗場部分圖像。數(shù)據(jù)處理單元20基于暗場部分圖像控制可移動鏡臺31，使得聚焦相應(yīng)的樣品部 分。此外，當(dāng)聚焦樣品部分后，數(shù)據(jù)處理單元20使激發(fā)光源51代替對照標(biāo)記激發(fā)光源61 發(fā)出激發(fā)光，并儲存用激發(fā)光獲得的暗場部分圖像。如上所述，生物樣品圖像獲取設(shè)備1被配置為用對照標(biāo)記專用激發(fā)光獲得暗場部 分圖像，作為聚焦對象的暗場部分圖像，并用激發(fā)光獲得暗場部分圖像，作為記錄對象的暗 場部分圖像。1-3.數(shù)據(jù)處理單元的構(gòu)成下面說明數(shù)據(jù)處理單元20的構(gòu)成。如圖3所示，數(shù)據(jù)處理單元20包括中央處理 器(CPU)71，其執(zhí)行各種控制和各種類型的連接至CPU 71的硬件。具體地，只讀存儲器(R0M)72、用作CPU 71的工作存儲器的隨機存取存儲器 (RAM) 73、輸入與用戶操作相應(yīng)的命令的操作輸入單元74、接口 75、顯示單元76和存儲單元 77經(jīng)由總線78與CPU 71連接。ROM 72存儲用于執(zhí)行各種處理的計算機程序。接口 75與顯微鏡10 (可移動鏡臺 31的驅(qū)動系統(tǒng)，光源41、51、61，成像裝置46，物鏡44和發(fā)射濾光片55)連接。可使用液晶顯示器、電致發(fā)光(EL)顯示器或等離子體顯示器作為顯示單元76?？?使用諸如硬盤(HD)的磁盤、半導(dǎo)體存儲器或光盤作為存儲單元77?；蛘撸墒褂帽銛y存儲 器，例如，通用串行總線(USB)存儲器和閃存(CF)存儲器。CPU 71從存儲在ROM 72中的 多個計算機程序中加載與由操作輸入單元74提供的 命令相應(yīng)的計算機程序至RAM 73，并根據(jù)加載的程序控制顯示單元76和存儲單元77。CPU 71還被配置為根據(jù)加載的程序經(jīng)由接口 75控制顯微鏡10的每個單元。
1-4.明場成像模式的具體處理當(dāng)CPU 71從操作輸入單元24接收明場成像模式的執(zhí)行命令時，CPU 71將與成像 模式相應(yīng)的計算機程序加載至RAM 23。在此情況中，根據(jù)與明場成像模式相應(yīng)的計算機程序，CPU 71用作載片設(shè)置控制 單元81、明場圖像獲取單元82和數(shù)據(jù)記錄單元83，如圖4所示。當(dāng)載片設(shè)置控制單元81接收成像模式的執(zhí)行命令或應(yīng)該更換明場圖像獲取單元 82或載片的通知時，載片設(shè)置控制單元81驅(qū)動可移動鏡臺31并將載片支架32定位在載片 設(shè)置位置。
在將載片支架32定位在載片設(shè)置位置的情況下，載片設(shè)置控制單元81在預(yù)定的 等待期間之后再次驅(qū)動可移動鏡臺31，以將載片支架32從載片設(shè)置位置移動至顯微位置。 在等待期間，如參照圖1所描述的，由載片設(shè)置機構(gòu)將包含在載片容器中的載片SG設(shè)置在 載片支架32中。例如，在將載片支架32定位在顯微位置的時間點，明場圖像獲取單元82將低倍率 的物鏡44設(shè)置在分色鏡54和成像透鏡45之間的光軸上，并驅(qū)動明場光源41。然后，明場圖像獲取單元82基于由成像裝置46形成的明場完整圖像的對比度在 生物樣品SPL上聚焦，從而獲得，例如，如圖5所示的明場完整圖像。當(dāng)獲得明場完整圖像后，明場圖像獲取單元82將高倍率的預(yù)定的物鏡44設(shè)置在 光路上的預(yù)定位置，而不是將低倍率物鏡44設(shè)置在光路上的預(yù)定位置。然后，明場圖像獲取單元82從明場完整圖像檢測生物樣品SPL的輪廓。施加至輪 廓的檢測的是，例如，執(zhí)行二值化處理以將生物樣品SPL與其它區(qū)域區(qū)分開以及然后執(zhí)行 提取生物樣品SPL的外形的提取處理的技術(shù)。在從明場完整圖像檢測生物樣品SPL的輪廓時，明場圖像獲取單元82確定應(yīng)在其 中獲取部分圖像的區(qū)域(下面也稱為成像區(qū)域)的大小，并且對生物樣品SPL分配成像區(qū) 域AR，如圖6所示。至少基于物鏡44的放大率和成像裝置46的成像表面的大小來確定成像區(qū)域AR， 并且，在包括生物樣品SPL的一部分輪廓或包括在輪廓內(nèi)的條件下對其進(jìn)行分配。雖然在 圖6中成像區(qū)域AR彼此不重疊，但是相鄰的區(qū)域可以部分彼此重疊。在將成像區(qū)域AR分配給明場完整圖像中的生物樣品SPL之后，明場圖像獲取單元 82順序地移動可移動鏡臺31，使得生物樣品SPL的各個部分變成成像區(qū)域AR，并獲得與成 像區(qū)域AR相應(yīng)的每個部分的明場部分圖像。然后，明場圖像獲取單元82連接明場部分圖像，從而形成連接圖像(下面也稱為 明場部分連接圖像)。明場圖像獲取單元82被配置為在此時對載片設(shè)置控制單元81發(fā)出 應(yīng)該更換載片的通知。當(dāng)明場部分連接圖像由明場圖像獲取單元82形成時，數(shù)據(jù)記錄單元83產(chǎn)生關(guān)于 在產(chǎn)生明場部分連接圖像的過程中獲得的明場部分圖像和明場完整圖像、以及該明場部分 連接圖像的數(shù)據(jù)(在下面也稱為明場圖像數(shù)據(jù))，并在存儲單元77中存儲該數(shù)據(jù)。此時，數(shù)據(jù)記錄單元83產(chǎn)生關(guān)于由明場圖像獲取單元82分配至明場完整圖像中 的生物樣品SPL的成像區(qū)域AR的數(shù)據(jù)(在下面也稱為成像區(qū)域分配數(shù)據(jù))，并將該數(shù)據(jù)與 明場圖像數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。
數(shù)據(jù)記錄單元83還被配置為將關(guān)于生物樣品SPL的數(shù)據(jù)(在下面也稱為樣品數(shù)據(jù))與明場圖像數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。樣品數(shù)據(jù)包括，例如，諸如檢查對象的姓名、性別和年齡的信息、收集生物樣品SPL 的日期等。其它附加信息可通過從操作輸入單元74的輸入獲得，或通過掃描載玻片SG上 的條形碼的讀取單元獲得。1-5.暗場成像模式的具體處理當(dāng)CPU 71從操作輸入單元24接收暗場成像模式的執(zhí)行命令時，CPU 71將與成像 模式相應(yīng)的計算機程序加載至RAM 23。在此情況中，根據(jù)與暗場成像模式相應(yīng)的計算機程序，CPU 71用作載片設(shè)置控制 單元81、暗場圖像獲取單元92和數(shù)據(jù)記錄單元93，如圖7所示，其中，對圖4所示的相同組 成部分應(yīng)用相同的參考數(shù)字。例如，在將載片支架32定位在顯微位置的時間點，暗場圖像獲取單元92將高倍率 物鏡44設(shè)置在分色鏡54和成像透鏡45之間的光軸上。此時，暗場圖像獲取單元92還獲得關(guān)于提供至載片支架32的生物樣品SPL的樣 品數(shù)據(jù)，并在存儲單元77中對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，樣品數(shù)據(jù)包括，例如，與所獲得的樣品數(shù) 據(jù)中的相匹配的對象的姓名和收集日期。在未在存儲單元77中發(fā)現(xiàn)樣品數(shù)據(jù)的情況中，暗場圖像獲取單元92通過，例如， 顯示單元76發(fā)出該情況的通知。另一方面，當(dāng)在存儲單元77中發(fā)現(xiàn)樣品數(shù)據(jù)時，暗場圖像獲取單元92從存儲單元 77讀取與樣品數(shù)據(jù)相關(guān)的成像區(qū)域分配數(shù)據(jù)。然后，在此時間點，與在明場成像模式中對生 物樣品SPL分配成像區(qū)域的狀態(tài)相同，暗場圖像獲取單元92對提供至載片支架32的生物 樣品SPL分配成像區(qū)域AR(圖6)。因此，即使未激發(fā)生物樣品SPL中的熒光材料時，也僅將與固定至載片支架32的 載玻片SG上的生物樣品SPL相應(yīng)的部分作為分配對象正確地分配。在對生物樣品SPL分配成像區(qū)域AR之后，暗場圖像獲取單元92以預(yù)定順序?qū)⒎?配有成像區(qū)域AR的每個樣品部分選擇為成像對象，并獲得被選擇為成像對象的樣品部分 的圖像(暗場部分圖像)。下面具體地說明獲得被選擇為成像對象的單個樣品部分的圖像(暗場部分圖像) 的方式。也就是說，在X軸方向上或在y軸方向上移動可移動鏡臺31使得要成像的生物樣 品SPL的樣品部分包括在成像區(qū)域中之后，暗場圖像獲取單元92驅(qū)動對照標(biāo)記激發(fā)光源 61，以用對照標(biāo)記專用激發(fā)光照射生物樣品SPL。結(jié)果，成像裝置46從由對照標(biāo)記專用激發(fā)光激發(fā)的對照標(biāo)記中在要成像的樣品 部分形成對照標(biāo)記的暗場圖像(暗場部分圖像)。圖8示出了對照標(biāo)記的暗場部分圖像的 一個實例。暗場圖像獲取單元92從成像裝置46獲得暗場部分圖像的一部分，并基于該部分 的對比度在成像對象的樣品部分上聚焦。因此，與基于整個暗場部分圖像的對比度聚焦的 情況相比，聚焦時間減少。用作聚焦對象的暗場部分圖像的部分可以是，例如，由如圖9A所示的具有預(yù)定間 隔的線限定的，或者由如圖9B所示的中心像素和圍繞中心像素的一組像素限定的。
一旦完成成像對象的樣品部分的聚焦，暗場圖像獲取單元92就停止驅(qū)動對照標(biāo) 記激發(fā)光源61，并開始驅(qū)動激發(fā)光源51。結(jié)果，成像裝置46在由對照標(biāo)記激發(fā)光激發(fā)的整 個對照標(biāo)記和整個熒光標(biāo)記中，例如，如圖10所示的在成像對象的樣品部分中，形成對照 標(biāo)記和熒光標(biāo)記的暗場圖像(暗場部分圖像)。暗場圖像獲取單元92從成像裝置46獲得整個暗場部分圖像作為記錄對象的暗場 部分圖像。如上所述，暗場圖像獲取單元92用上述獲取技術(shù)以預(yù)定順序獲得記錄對象的每 個樣品部分的暗場部分圖像。當(dāng)獲得記錄對象的所有樣品部分的暗場部分圖像時，暗場圖像獲取單元92通過 將暗場部分圖像彼此連接來產(chǎn)生連接圖像(在下面也稱為暗場部分連接圖像)。此時，暗場 圖像獲取單元92通知載片設(shè)置控制單元81應(yīng)該更換載片。當(dāng)暗場圖像獲取單元92獲得記錄對象的所有樣品部分的暗場部分圖像時，數(shù)據(jù) 記錄單元93產(chǎn)生關(guān)于暗場部分圖像和在產(chǎn)生圖像的過程中獲得的暗場部分連接圖像的數(shù) 據(jù)(在下面也稱為暗場圖像數(shù)據(jù))。然后，數(shù)據(jù)記錄單元93將暗場圖像數(shù)據(jù)與明場圖像數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)地存儲在存儲單 元77中，所述明場圖像數(shù)據(jù)與在產(chǎn)生暗場圖像數(shù)據(jù)的過程中由暗場圖像獲取單元92讀取 的成像區(qū)域分配數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。1-6.暗場成像模式中的圖像獲取過程下面參照圖11所示的流程圖說明暗場圖像獲取過程。在接收到成像模式的執(zhí)行命令時，CPU 71啟動暗場圖像獲取過程，進(jìn)入步驟SP1， 將載片支架32定位在載片設(shè)置位置，然后進(jìn)入步驟SP2。在步驟SP2，在預(yù)定等待期間之后，CPU 71將載片支架32從載片設(shè)置位置定位在 顯微位置，并進(jìn)入步驟SP3。在步驟SP3，CPU71將高倍率物鏡44設(shè)置在分色鏡54和成像 透鏡45之間的光軸上，然后進(jìn)入步驟SP4。在步驟SP4，與在明場成像模式中對生物樣品SPL分配成像區(qū)域的狀態(tài)相同，CPU 71對提供至載片支架32的生物樣品SPL分配成像區(qū)域AR(圖6)，并進(jìn)入步驟SP5。在步驟SP5，CPU 71將一個分配有成像區(qū)域AR的樣品部分選擇為成像對象，并進(jìn) 入步驟SP6。在步驟SP6，CPU 71驅(qū)動對照標(biāo)記激發(fā)光源61，基于成像對象的樣品部分的對 照標(biāo)記的暗場圖像(暗場部分圖像)的一部分的對比度在成像對象的樣品部分上聚焦，并 進(jìn)入步驟SP7。在步驟SP7，CPU 71停止驅(qū)動對照標(biāo)記激發(fā)光源61，并同時開始驅(qū)動激發(fā)光源51， 然后進(jìn)入步驟SP8。在步驟SP8，CPU 71將成像對象的樣品部分的對照標(biāo)記和熒光標(biāo)記的 暗場圖像獲得為記錄對象的暗場部分圖像，并進(jìn)入步驟SP9。在步驟SP9，CPU 71停止驅(qū)動激發(fā)光源51，并進(jìn)入步驟SP10。在步驟SP10，CPU 71 判斷是否獲得了分配有成像區(qū)域AR的所有樣品部分的暗場部分圖像，并且，當(dāng)仍有其暗場 部分圖像尚未獲得的任何樣品部分時，返回至步驟SP5。另一方面，當(dāng)獲得所有樣 品部分的暗場部分圖像時，CPU 71進(jìn)入步驟SP11，通過 連接暗場部分圖像來產(chǎn)生暗場部分連接圖像，并進(jìn)入步驟SP12。在步驟SP12，CPU 71產(chǎn)生關(guān)于在步驟SPll獲得的暗場部分連接圖像和在連接之前的暗場部分圖像的暗場圖像數(shù)據(jù)，并與相應(yīng)的明場圖像數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)地在存儲單元77中 存儲暗場圖像數(shù)據(jù)，并進(jìn)入步驟SP13。在步驟SP13，CPU 71判斷載片容器中是否剩有任何載玻片SG，并且，如果剩有任 何載玻片，那么CPU 71返回至步驟SPl以重復(fù)上述過程。另一方面，如果載片容器中未剩 有載玻片SG，那么CPU 71終止暗場圖像獲取過程。1-7.效果

通過上述構(gòu)成，在獲得暗場部分圖像的情況中，生物樣品圖像獲取設(shè)備1驅(qū)動對 照標(biāo)記激發(fā)光源61，以用對照標(biāo)記專用激發(fā)光照射成像對象的樣品部分。然后，生物樣品圖 像獲取設(shè)備1基于由對照標(biāo)記專用激發(fā)光激發(fā)的樣品部分的對照標(biāo)記的暗場圖像的對比 度在生物樣品的部分上聚焦。一旦完成成像對象的樣品部分的聚焦，生物樣品圖像獲取設(shè)備1驅(qū)動激發(fā)光源 51，而不是驅(qū)動對照標(biāo)記激發(fā)光源61，以用激發(fā)光照射成像對象的樣品部分。然后，生物樣 品圖像獲取設(shè)備1獲得由激發(fā)光激發(fā)的樣品部分中的熒光標(biāo)記和對照標(biāo)記的暗場圖像，作 為待記錄的暗場部分圖像。因為對照標(biāo)記靶向細(xì)胞核，所以其包括在生物樣品SPL中的量比靶向特定基因的 熒光標(biāo)記的量大得多，并且，對照標(biāo)記產(chǎn)生模糊地總體代表生物樣品的光。因此，生物樣品圖像獲取設(shè)備1能以高精度在生物樣品SPL的每個樣品部分上聚 焦，而不用使熒光標(biāo)記發(fā)光，結(jié)果，獲得待記錄的每個樣品部分的暗場部分圖像。順便說一句，通常用汞燈、氙燈或金屬鹵化物燈作為激發(fā)光源51。部分是因為這些 燈的波長范圍是穩(wěn)定的，調(diào)節(jié)激發(fā)濾光片53和發(fā)射濾光片55的透射率，使得熒光標(biāo)記表現(xiàn) 得比對照標(biāo)記更亮。因此，為了用激發(fā)光源51觀察對照標(biāo)記，與觀察熒光標(biāo)記的情況相比，使激發(fā)光 源51的照射強度更高。結(jié)果，在此情況中，熒光標(biāo)記和對照標(biāo)記的變色加速，而且生物樣品 SPL負(fù)擔(dān)過大。另一方面，為了用濾光片從由激發(fā)光源51發(fā)出的激發(fā)光中僅提取激發(fā)對照標(biāo)記 的光，當(dāng)聚焦暗場部分圖像時和當(dāng)獲得暗場部分圖像時，更換濾光片。結(jié)果，在此情況中，設(shè) 備的尺寸由于濾光片數(shù)量的增加而增加。此外，在此情況中花費更長的時間來獲得暗場部 分圖像，因此，此方法是不現(xiàn)實的。相反，生物樣品圖像獲取設(shè)備1從對照標(biāo)記激發(fā)光源61發(fā)出對照標(biāo)記專用激發(fā) 光。因此，與用激發(fā)光源51觀察對照標(biāo)記的情況相比，生物樣品圖像獲取設(shè)備1能夠更快 地獲得暗場部分圖像，而不會使熒光標(biāo)記和對照標(biāo)記的變色加速。通過上述構(gòu)成，生物樣品圖像獲取設(shè)備1通過使用由對照標(biāo)記專用激發(fā)光激發(fā)的 對照標(biāo)記的暗場圖像，能夠調(diào)節(jié)焦距，而不會使標(biāo)記至靶的熒光材料的變色加速或使生物 樣品負(fù)擔(dān)過大。2.其它實施方式在上述實施方式中，用對照標(biāo)記專用激發(fā)光照射生物樣品SPL的面向物鏡44的樣 品表面。然而，可用對照標(biāo)記專用激發(fā)光照射面向物鏡44的樣品表面的相反側(cè)上的樣品表 面。圖12示出了與圖1的組成部分相應(yīng)的組成部分具有相同的參考數(shù)字和符號的實例。在圖12所示 的實例中，在暗場成像模式的情況中，將對照標(biāo)記激發(fā)光源61代替明場光 源41設(shè)置在預(yù)定的光源位置(在此處，通常設(shè)置明場光源41)。此外，將準(zhǔn)直透 鏡62設(shè)置 在光源和反射鏡42之間的光路上，并且從光路移除明場濾光片43。準(zhǔn)直透鏡62將從對照 標(biāo)記激發(fā)光源61發(fā)出的對照標(biāo)記專用激發(fā)光變?yōu)槠叫泄馐⒔?jīng)由反射鏡42引導(dǎo)至面向 物鏡44的樣品表面的相反側(cè)上的樣品表面。在圖12所示的實例中，省略了圖1所示的分 色鏡63。圖13示出了另一與圖1的組成部分相應(yīng)的組成部分具有相同的參考數(shù)字和符號 的實例。在圖13所示的實例中，設(shè)置對照標(biāo)記激發(fā)光源61和準(zhǔn)直透鏡62，使得對照標(biāo)記專 用激發(fā)光直接傾斜地落在面向物鏡44的樣品表面的相反側(cè)的樣品表面上。與圖12所示的 實例類似，在圖13所示的實例中也省略了圖1所示的分色鏡63。此外，圖13所示的實例具 有優(yōu)點，因為可用對照標(biāo)記專用激發(fā)光直接照射生物樣品SPL，不用像圖12所示的實例一 樣移動任何濾光片或透鏡。在上述實施方式中，對照標(biāo)記的暗場部分圖像的一部分(圖8)用作與樣品部分相 應(yīng)的聚焦對象。雖然該部分固定至分配有成像區(qū)域AR的每個樣品部分，但是也可以是可變 的。通常，在生物樣品SPL中(尤其是在組織切片中)，細(xì)胞不是均勻存在的，而是具有 細(xì)胞集中的區(qū)域和細(xì)胞稀疏的區(qū)域。在集中區(qū)域，與稀疏區(qū)域相比，真正作為靶的熒光標(biāo)記 更有可能存在，并且，與集中區(qū)域相應(yīng)的對照標(biāo)記的暗場部分圖像的光強度也更高。也就是 說，對照標(biāo)記的暗場部分圖像的集中區(qū)域是明顯的區(qū)域(用于聚焦的區(qū)域)。當(dāng)?shù)谝淮螐某上裱b置46讀取與要獲得的樣品部分相應(yīng)的對照標(biāo)記的暗場部分圖 像時，讀出所有暗場部分圖像，并且，確定讀出的暗場部分圖像的一部分以用于聚焦。此確定技術(shù)確定用于以密度的降序在比暗場部分圖像小的搜索區(qū)域(例如， 16X16像素或8X8像素)中聚焦的部分的預(yù)定數(shù)量。該密度可由，例如，具有不低于搜索 區(qū)域的閾值的強度的像素的數(shù)量或者搜索區(qū)域的強度柱狀圖的峰度(線性度)來衡量。雖然強度柱狀圖表示基于像素的搜索區(qū)域的強度值的分布，但是，使假設(shè)表現(xiàn)分 布區(qū)域的變化相同的分布標(biāo)準(zhǔn)化是優(yōu)選的。這是因為可在相同的單元衡量分配有成像區(qū)域 AR的樣品部分的暗場部分圖像。以此方式，在分配有成像區(qū)域AR的每個樣品部分中，可聚焦熒光標(biāo)記在其中非常 可能存在的部分。在上述實施方式中，將其中采用細(xì)胞核用于對照的DAPI用作對照標(biāo)記。然而，對 照標(biāo)記并不限于DAPI。例如，可使用靶向細(xì)胞組織(或?qū)τ诩?xì)胞組織來說是獨特的分子) 的對照標(biāo)記，或者，可使用靶向細(xì)胞質(zhì)(或?qū)τ诩?xì)胞質(zhì)來說是獨特的分子)的對照標(biāo)記。自 然地，可使用靶向其它物質(zhì)另一對照標(biāo)記。雖然在上述實施方式中使用一種類型的對照標(biāo)記，但是可使用兩種以上類型的對 照標(biāo)記。在這種情況中，提供關(guān)于各個對照標(biāo)記的專用激發(fā)光源，或者，提供激發(fā)各個對照 標(biāo)記但是不激發(fā)靶中的熒光材料的單個激發(fā)光源，從而，可獲得與上述實施方式相同的效果。在上述實施方式中，在生物樣品SPL中用基因作為靶。然而，生物樣品SPL中的靶 不限于基因。例如，可用各種分子(包括諸如細(xì)胞膜通道的蛋白質(zhì)分子、糖蛋白分子和糖鏈分子)作為靶。在上述 實施方式中為了調(diào)節(jié)焦距，在固定的物鏡44的光軸的方向上在ζ軸方向 (光軸方向)上移動可移動鏡臺31。替代地，可移動鏡臺31可以是固定的，并且，可在ζ軸 方向(光軸方向)上與可移動鏡臺31相反地移動物鏡44。應(yīng)該理解，對這里描述的目前優(yōu)選的實施方式的各種變化和修改，對于本領(lǐng)域的 技術(shù)人員來說將是顯而易見的。可在不偏離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍且不減少其預(yù)期的優(yōu)點的 前提下，進(jìn)行這種變化和修改。因此，這種變化和修改已由所附權(quán)利要求覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，所述方法包括基于第一熒光材料的熒光在所述生物樣品上聚焦，其中，用所述第一熒光材料和第二 熒光材料對所述生物樣品染色；并且，基于所述第二熒光材料的熒光捕獲圖像，其中，所述第一和第二熒光材料具有不同的 激發(fā)波長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，在暗場成像模式 下產(chǎn)生所述圖像。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，在暗場成像模式 以及明場成像模式下產(chǎn)生所述圖像。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，將所述圖像捕獲 為完整圖像。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，將所述圖像捕獲 為部分圖像。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，將所述圖像捕獲 為多個部分圖像，所述多個部分圖像被連接以形成所述圖像。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，由包括聚焦和捕 獲的控制的數(shù)據(jù)處理單元控制圖像產(chǎn)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，在聚焦之后，由所 述數(shù)據(jù)處理單元驅(qū)動激發(fā)光源以啟動圖像捕獲。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，在預(yù)定位置聚焦 所述生物樣品的一部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，其中，在可變位置聚焦 所述生物樣品的一部分。
11.一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，所述設(shè)備包括基部單元，被配置為容納用具有不同激發(fā)波長的第一熒光材料和第二熒光材料染色的 生物樣品；第一光源，被配置為照射所述生物樣品從而允許基于所述第一熒光材料的熒光聚焦所 述生物樣品；以及第二光源，被配置為照射所述生物樣品從而允許基于所述第二熒光材料的熒光捕獲所 述圖像。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，在暗場成像模 式下產(chǎn)生所述圖像。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，在暗場成像模 式以及明場成像模式下產(chǎn)生所述圖像。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，將所述圖像捕 獲為完整圖像。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，將所述圖像捕 獲為部分圖像。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，將所述圖像捕獲為多個部分圖像，所述多個部分圖像被連接以形成所述圖像。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，所述設(shè)備還包 括數(shù)據(jù)處理單元，該數(shù)據(jù)處理單元被配置用于控制圖像產(chǎn)生，包括與所述基部單元、所述第 一光源和所述第二光源通信。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，所述數(shù)據(jù)處理 單元停止驅(qū)動所述第一光源，并開始驅(qū)動所述第二光源，以啟動圖像捕獲。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，在預(yù)定位置聚 焦所述生物樣品的一部分。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，其中，在可變位置聚 焦所述生物樣品的一部分。
21.一種存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置，其中，所述數(shù)據(jù)處理 單元使得基于第一熒光材料的熒光在生物樣品上聚焦，其中，用所述第一熒光材料和第二熒光 材料對所述生物樣品染色；并且基于所述第二熒光材料的熒光捕獲與所述生物樣品相關(guān)的圖像，其中，所述第一和第 二熒光材料具有不同的激發(fā)波長。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，在暗場成像模式下產(chǎn)生所述圖像。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，在暗場成像模式以及明場成像模式下產(chǎn)生所述圖像。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，將所述圖像捕獲為完整圖像。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，將所述圖像捕獲為部分圖像。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，將所述圖像捕獲為多個部分圖像，所述多個部分圖像被連接以形成所述圖像。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，在聚焦之后，由所述數(shù)據(jù)處理單元驅(qū)動激發(fā)光源以啟動圖像捕獲。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，在預(yù)定位置聚焦所述生物樣品的一部分。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令的計算機可讀存儲裝置， 其中，在可變位置聚焦所述生物樣品的一部分。
30.一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法，所述方法包括以第一激發(fā)波長照射所述生物樣品；在所述生物樣品上聚焦；以第二激發(fā)波長照射所述生物樣品；以及捕獲與所述生物樣品相關(guān)的圖像。
31.一種產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的設(shè)備，所述設(shè)備包括第一光源，被配置為以第一激發(fā)波長照射所述生物樣品從而允許所述生物樣品的聚焦；以及第二光源，被配置為以第二激發(fā)波長照射所述生物樣品從而允許所述圖像的捕獲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熒光圖像產(chǎn)生方法、熒光圖像產(chǎn)生設(shè)備及熒光圖像產(chǎn)生程序。提供了產(chǎn)生與生物樣品相關(guān)的圖像的方法和設(shè)備?；诘谝粺晒獠牧系臒晒庠谏飿悠飞暇劢股飿悠罚⑶?，基于第二熒光材料的熒光捕獲圖像。還提供一種計算機可讀存儲裝置，存儲使數(shù)據(jù)處理單元工作的指令。
文檔編號G01N21/64GK102004091SQ20101026271
公開日2011年4月6日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者山本隆司, 木島公一朗 申請人:索尼公司