專利名稱：使用熒光圖像產(chǎn)生明場(chǎng)圖像的系統(tǒng)和方法
使用熒光圖像產(chǎn)生明場(chǎng)圖像的系統(tǒng)和方法背景本發(fā)明總體上涉及將通過(guò)熒光顯微鏡獲取的一組生物標(biāo)志物圖像映射到新色空間的方法，其中映射圖像強(qiáng)度值代表明場(chǎng)模式(brightfield modality).在用蘇木精和伊紅(Hematoxylin & Eosin，H&E)的傳統(tǒng)組織染色中，使用嗜堿性染料蘇木精(H)以使細(xì)胞核染成藍(lán)色，并且將嗜酸性染料伊紅(E)用作復(fù)染劑以使細(xì)胞質(zhì)、 結(jié)締組織(膠原)、肌纖維、結(jié)締組織和紅細(xì)胞染色。伊紅與組織中的不同細(xì)胞組分相互作用，基于與伊紅結(jié)合的分子的帶電性質(zhì)產(chǎn)生不同色調(diào)的粉紅色。這些細(xì)胞組分可使用具有熒光染料的分子標(biāo)志物(染料和抗體)替代地標(biāo)記。例如，細(xì)胞核可用DAPI (特異性結(jié)合 DNA的熒光染料)染色，而組織中的其他區(qū)域可免疫熒光標(biāo)記，其中通過(guò)直接綴合的抗體或一級(jí)二級(jí)放大檢測(cè)(primary secondary amplification detection)來(lái)革巴向目標(biāo)分子。對(duì)于一些結(jié)構(gòu)諸如紅細(xì)胞(RBC)，可使用通過(guò)一組濾波器捕獲的組織自發(fā)熒光來(lái)檢測(cè)。熒光成像模式的優(yōu)勢(shì)在于分別地捕獲這些組織結(jié)構(gòu)中的每一種，因此能夠精確定位和定量。然而，基于熒光圖像的組織病理學(xué)診斷并非常規(guī)實(shí)踐，因?yàn)闊晒鈭D像并不提供病理學(xué)家進(jìn)行診斷所必需的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)。明場(chǎng)H&E染色技術(shù)常常也是受偏愛(ài)的，因?yàn)榇嬖诓±韺?shí)驗(yàn)室中數(shù)十年來(lái)匯集的關(guān)于這些技術(shù)的大量知識(shí)。需要將熒光圖像變換為類似諸如H&E的明場(chǎng)圖像的色域的方法以允許病理學(xué)家對(duì)同一組熒光圖像進(jìn)行定量分析以及病理學(xué)診斷。發(fā)明簡(jiǎn)述如所提到的，先前僅使用熒光標(biāo)志物來(lái)鑒別胞核、上皮和基質(zhì)以提供關(guān)于細(xì)胞區(qū)室的信息。所述方法結(jié)合了熒光標(biāo)志物的形態(tài)學(xué)功能與熒光生物標(biāo)志物的功能，其用以部分地基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物途徑來(lái)鑒別組織中蛋白質(zhì)表達(dá)和疾病途徑。本發(fā)明描述了將通過(guò)熒光顯微鏡獲取的一組生物標(biāo)志物和自發(fā)熒光圖像映射到新色空間的方法，其中映射圖像強(qiáng)度值代表明場(chǎng)模式，諸如H&E染色。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了使用熒光圖像產(chǎn)生類似于生物樣品的明場(chǎng)染色方案的明場(chǎng)型圖像的方法。所述方法包括以下步驟獲取生物樣品上固定區(qū)域的兩種或更多種熒光圖像；將所述熒光圖像映射到明場(chǎng)色空間；和產(chǎn)生明場(chǎng)圖像。在另一實(shí)施方案中，提供了使用熒光圖像產(chǎn)生類似于生物樣品的明場(chǎng)染色方案的明場(chǎng)型圖像的圖像分析系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括適用于獲取生物樣品上固定區(qū)域的兩種或更多種熒光圖像的數(shù)字成像裝置和適用于應(yīng)用映射參數(shù)以將所述兩種或更多種熒光圖像變換為明場(chǎng)型圖像的處理裝置。附圖在參考附圖閱讀以下詳述時(shí)將更好地理解本發(fā)明的這些和其他特征、方面和優(yōu)勢(shì)，在整個(gè)附圖中相同的符號(hào)表示相同的部分，其中

圖1表示結(jié)腸組織樣品(樣品A)的5種熒光圖像和相應(yīng)產(chǎn)生的H&E型圖像的單色實(shí)施方案。圖2表示結(jié)腸組織樣品(樣品B)的5種熒光圖像和相應(yīng)產(chǎn)生的H&E型圖像的單色實(shí)施方案。圖3表示，與由熒光圖像產(chǎn)生的H&E型圖像相比，經(jīng)H&E染色的結(jié)腸組織的三通道 (紅色、綠色、藍(lán)色)彩色圖像的單色實(shí)施方案。發(fā)明詳述為了更清楚且簡(jiǎn)明地描述并指出所要求保護(hù)發(fā)明的主題，對(duì)于在以下說(shuō)明書(shū)及其所附權(quán)利要求書(shū)中使用的特定術(shù)語(yǔ)，提供以下定義。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指與另一分子特異性結(jié)合且由此定義為與該分子的特定空間和極性結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的免疫球蛋白。該抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體，且可通過(guò)以下制備諸如使宿主免疫和收集血清(多克隆抗體)的本領(lǐng)域熟知的技術(shù)；或制備連續(xù)雜交細(xì)胞系和收集分泌的蛋白質(zhì)(單克隆抗體)； 或克隆并表達(dá)至少編碼特異性結(jié)合天然抗體所需要的氨基酸序列的核苷酸序列或其誘變形式?？贵w可包括完全免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括多種分類和同種型，諸如 IgA, IgD, IgE, IgGU IgG2a, IgG2b和IgG3、IgM。功能性抗體片段可包括能夠以類似親和性保持與全長(zhǎng)抗體的結(jié)合的抗體部分(例如，F(xiàn)ab、Fv和F(ab' )2或Fab')。另外，在適當(dāng)?shù)那闆r下，可使用免疫球蛋白或其片段的聚集體、聚合體和綴合物，只要基本保持對(duì)特定分子的結(jié)合親和性即可。本文使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合劑”是指可與生物樣品中的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的分子。結(jié)合劑可與目標(biāo)物特異性結(jié)合。合適的結(jié)合劑可包括以下一種或多種天然或修飾的肽、蛋白質(zhì)(例如，抗體、親和體(affibody)或適配體(aptamer))、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA 或適配體)；多糖(例如，凝集素、糖)、脂質(zhì)、酶、酶底物或抑制劑、配體、受體、抗原或半抗原。合適的結(jié)合劑可根據(jù)待分析的樣品和可用于檢測(cè)的目標(biāo)物來(lái)選擇。例如，在樣品中的目標(biāo)物可包括配體且結(jié)合劑可包括受體，或者目標(biāo)物可包括受體且結(jié)合劑可包括配體。類似地，目標(biāo)物可包括抗原且結(jié)合劑可包括抗體或抗體片段或反之亦然。在一些實(shí)施方案中， 目標(biāo)物可包括核酸且結(jié)合劑可包括互補(bǔ)核酸。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)物和結(jié)合劑兩者可包括能夠彼此結(jié)合的蛋白質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物樣品”是指從生物受試者獲得的樣品，包括體內(nèi)或體外獲得的生物組織或流體來(lái)源的樣品。這類樣品可為但不限于體液(例如，血液、血漿、血清或尿)、器官、組織、碎片(fractions)和從包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物分離的細(xì)胞。生物樣品還可包括含組織的生物樣品的切片(例如，器官或組織的切片部分)。生物樣品還可包括得自生物樣品的提取物，例如得自生物流體(例如，血液或尿)的抗原。生物樣品可為原核來(lái)源或真核來(lái)源(例如，昆蟲(chóng)、原生動(dòng)物、鳥(niǎo)、魚(yú)、爬行動(dòng)物)。在一些實(shí)施方案中，所述生物樣品為哺乳動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠、奶牛、狗、驢、豚鼠或兔)。在某些實(shí)施方案中，所述生物樣品可為靈長(zhǎng)類動(dòng)物來(lái)源(例如，黑猩猩或人)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“熒光團(tuán)”或“熒光信號(hào)發(fā)生體(fluorescent signal generator) ”是指如下化合物，當(dāng)通過(guò)暴露于特定波長(zhǎng)的光來(lái)激發(fā)時(shí)，所述化合物發(fā)射不同波長(zhǎng)的光。熒光團(tuán)可根據(jù)其發(fā)射特性或“顏色”描述。綠色熒光團(tuán)(例如Cy3、FITC和Oregon Green)的特征可為其通常在515-540納米范圍的波長(zhǎng)下發(fā)射。紅色熒光團(tuán)(例如Texas Red、Cy5和四甲基若丹明)的特征可為通常在590-690納米范圍的波長(zhǎng)下發(fā)射。熒光團(tuán)的實(shí)例包括但不限于4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸根合芪_2，2' - 二磺酸；吖啶；吖啶衍生物和異硫氰酸吖啶；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) ；4-氨基_N_[3_乙烯基磺?；?苯基]萘二甲酰亞胺_3，5-二磺酸酯(Lucifer Yellow VS) ；N-(4_苯胺基萘基) 馬來(lái)酰亞胺；氨基苯甲酰胺；亮黃；香豆素；香豆素衍生物；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC， 香豆素120) ；7-氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)；四氯四溴熒光素(cyanosine)、 4'，6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI) ；5'，5” - 二溴鄰苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7_ 二乙基氨基-3-(4'-異硫氰酸根合苯基)4-甲基香豆素；4，4' - 二異硫氰酸根合二氫-芪_2，2' -二磺酸；4，4' -二異硫氰酸根合芪_2，2' -二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；伊紅；伊紅衍生物，諸如異硫氰酸伊紅；赤蘚紅； 赤蘚紅衍生物，諸如赤蘚紅B和異硫氰酸赤蘚紅；溴乙啶；熒光素和衍生物，諸如5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素(DTAF)、2'，7' -二甲氧基-4'， 5' -二氯-6-羧基熒光素(JOE)、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、QFITC O(RITC)；熒光胺衍生物(與胺反應(yīng)時(shí)發(fā)熒光)；IR144;IR1446;異硫氰酸孔雀綠；4-甲基_7_羥基香豆素； 鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅、B-藻紅蛋白；鄰苯二甲醛衍生物(與胺反應(yīng)時(shí)發(fā)熒光)；芘和衍生物，諸如芘、芘丁酸酯(pyrene butyrate)和1_芘丁酸琥珀酰亞胺酯 (sucinimidyl 1-pyrene butyrate)；活性紅 4(Cibacron. RTM.亮紅!3B-A)；若丹明和衍生物，諸如6-羧基-X-若丹明(ROX)、6_羧基若丹明(R6G)、麗絲胺若丹明B磺酰氯、若丹明 (Rhod)、若丹明B、若丹明123、異硫氰酸若丹明X、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red) ；N, N, N'，N'-四甲基_6_羧基若丹明(TAMRA)； 四甲基若丹明、四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)；核黃素；玫紅酸和鑭系螯合物衍生物、 量子點(diǎn)(quantum dots)、花菁、吡喃揚(yáng)t染料(pyrelium dye)和方酸菁。本文使用的術(shù)語(yǔ)“原位”通常指在原始位置，例如在完整器官或組織中或在器官或組織的代表性節(jié)段中發(fā)生的事件。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)物的原位分析可在來(lái)源于各種來(lái)源的細(xì)胞上進(jìn)行，所述來(lái)源包括生物體、器官、組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物。原位分析提供組織信息(contextual information)，該信息可在目標(biāo)物從其來(lái)源位點(diǎn)除去時(shí)丟失。因此，目標(biāo)物的原位分析描述對(duì)位于全細(xì)胞或組織樣品中的結(jié)合有目標(biāo)物的探針的分析，不管細(xì)胞膜是完全完整或部分完整的，其中結(jié)合有目標(biāo)物的探針保持在細(xì)胞內(nèi)。此外，本文公開(kāi)的方法可用于分析固定或未固定的細(xì)胞或組織樣品中的原位目標(biāo)物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“探針”是指具有結(jié)合劑和標(biāo)記例如信號(hào)發(fā)生體或酶的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑和標(biāo)記(信號(hào)發(fā)生體或酶)包含在單個(gè)實(shí)體中。所述結(jié)合劑和標(biāo)記可直接連接(例如，經(jīng)并入結(jié)合劑中的熒光分子)或間接連接(例如，經(jīng)可包括裂解部位的接頭)并且在單個(gè)步驟中施用到生物樣品。在替代的實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑和標(biāo)記包含在離散實(shí)體中(例如，能夠結(jié)合目標(biāo)物和酶的第一抗體或能夠結(jié)合第一抗體的信號(hào)發(fā)生體標(biāo)記的第二抗體)。當(dāng)結(jié)合劑和標(biāo)記(信號(hào)發(fā)生體或酶)為單獨(dú)的實(shí)體時(shí)，它們可在單個(gè)步驟或多個(gè)步驟中施用到生物樣品。本文使用的術(shù)語(yǔ)“熒光探針”是指具有偶合到熒光信號(hào)發(fā)生體的結(jié)合劑的試劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)發(fā)生體”是指能夠通過(guò)使用一種或多種檢測(cè)技術(shù)(例如，光譜法、熱量測(cè)定法、分光鏡檢查或目測(cè)檢查)提供可檢測(cè)信號(hào)的分子?？蓹z測(cè)信號(hào)的合適實(shí)例可包括光信號(hào)和電信號(hào)或放射性信號(hào)。信號(hào)發(fā)生體的實(shí)例包括發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、拉曼活性標(biāo)簽或放射性標(biāo)記中的一種或多種。如上所述，關(guān)于探針，在一些實(shí)施方案中，信號(hào)發(fā)生體和結(jié)合劑可存在于單個(gè)實(shí)體(例如，具有熒光標(biāo)記的目標(biāo)物結(jié)合蛋白質(zhì))?；蛘?，結(jié)合劑和信號(hào)發(fā)生體可為在引入到樣品之前或引入到樣品時(shí)彼此結(jié)合的離散實(shí)體(例如，受體蛋白和針對(duì)特定受體蛋白的標(biāo)記抗體)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“固體載體”是指存在于生物樣品中的目標(biāo)物可固定于其上且隨后通過(guò)本文公開(kāi)的方法檢測(cè)的制品。目標(biāo)物可通過(guò)物理吸附、共價(jià)鍵形成或其組合固定在固體載體上。固體載體可包括聚合物、玻璃或金屬材料。固體載體的實(shí)例包括膜、微量滴定板、珠、過(guò)濾器、測(cè)試條、載玻片、蓋玻片和試管。本文使用的術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指與其他分子的明顯較低識(shí)別相比兩種不同分子之一對(duì)另一分子的特異性識(shí)別。所述分子在其表面上或在空腔中可具有在兩分子之間產(chǎn)生特異性識(shí)別的區(qū)域，所述特異性識(shí)別由靜電相互作用、氫鍵或疏水性相互作用中的一種或多種引起。特異性結(jié)合的實(shí)例包括但不限于抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸相互作用等。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合劑分子在諸如約6-約8的pH和約0°C -約 37°C的溫度的環(huán)境條件下可對(duì)目標(biāo)物具有不低于約IO5M4的固有平衡結(jié)合常數(shù)(KA)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)物”是指在存在于生物樣品中時(shí)可被檢測(cè)的生物樣品的組分。所述目標(biāo)物可為任何物質(zhì)，對(duì)該物質(zhì)存在天然存在的特異性結(jié)合劑(例如，抗體)或可制備針對(duì)該物質(zhì)的特異性結(jié)合劑(例如，小分子結(jié)合劑或適配體)。一般來(lái)講，結(jié)合劑可經(jīng)目標(biāo)物的一種或多種離散化學(xué)部分或目標(biāo)物的三維結(jié)構(gòu)組分(例如，由肽折疊產(chǎn)生的三維結(jié)構(gòu))與目標(biāo)物結(jié)合。所述目標(biāo)物可包括以下一種或多種天然或修飾的肽、蛋白質(zhì)(例如，抗體、親和體或適配體)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或適配體)；多糖(例如，凝集素或糖)、脂質(zhì)、酶、酶底物、配體、受體、抗原或半抗原。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)物可包括蛋白質(zhì)或核酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“虛擬染色圖像”(VSI)是指模擬由明場(chǎng)染色方案獲得的圖像的生物樣品的圖像。所述圖像具有與明場(chǎng)圖像類似的對(duì)比度、強(qiáng)度和著色。這允許通過(guò)生物樣品內(nèi)的特征來(lái)表征，包括但不限于胞核、上皮、基質(zhì)或任何類型胞外基質(zhì)材料特征，這就如同明場(chǎng)染色方案直接用于生物樣品上所表征的。本發(fā)明包括通常涉及可用于分析、診斷或預(yù)后應(yīng)用例如分析檢測(cè)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)或免疫熒光的方法的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可特別適用于組織化學(xué)、免疫染色、免疫組織化學(xué)、免疫測(cè)定或免疫熒光。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可特別適用于免疫印跡技術(shù)，例如蛋白質(zhì)印跡或免疫測(cè)定，諸如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)。用于連續(xù)染色并檢測(cè)生物樣品中的多種目標(biāo)物的方法更全面地描述在2007 年9月沘日提交的題為“生物樣品的連續(xù)分析(Sequential Analysis of Biological Samples)”的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/864085中，該專利申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。用于共定位樣品中的目標(biāo)物的方法描述在以下文獻(xiàn)中2007年3月15日提交的題為“用于分析組織樣品的圖像的系統(tǒng)和方法(System and Methods for Analyzing Images of Tissue Samples)”的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/686，649 ;2006年8月7日提交的題為“共配準(zhǔn)組織微陣列的多通道圖像的系統(tǒng)和方法(System and Method for Co-Registering Multi-Channel Images of a Tissue Micro Array) ” 的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào) 11/5000 ; 2006年11月30日提交的題為“計(jì)分組織微陣列的圖像的系統(tǒng)和方法(System and Methods for Scoring Images of a Tissue Micro Array) ” 的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào) 11/606582 ；和
72007年2月28日提交的題為“圖像結(jié)構(gòu)的自動(dòng)分割(Automated Segmentation of Image Structures)”的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/680063，各文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。已知將熒光圖像轉(zhuǎn)換為假明場(chǎng)圖像的方法。然而，這些方法通常將特定色空間 (波長(zhǎng))再指定到各熒光染料，使得熒光圖像再著色到明場(chǎng)空間中。這些方法未將熒光圖像轉(zhuǎn)置為代表若將生物樣品進(jìn)行指定的明場(chǎng)染色方案例如H&E所獲得圖像的圖像。相比之下，本文所述的發(fā)明由熒光圖像產(chǎn)生明場(chǎng)圖像，其中鑒別生物樣品的結(jié)構(gòu)特征和細(xì)節(jié)，正如圖像自指定明場(chǎng)染色方案直接獲得一樣。類似明場(chǎng)染色方案的圖像可稱為虛擬染色圖像 (VSI)。本發(fā)明描述了將通過(guò)熒光顯微鏡獲取的一組生物標(biāo)志物圖像映射到新色空間的方法，其中映射圖像強(qiáng)度值代表明場(chǎng)模式，且可用于產(chǎn)生VSI。所述方法涉及使用從生物樣品的兩種或更多種熒光圖像和明場(chǎng)圖像中的相應(yīng)點(diǎn)獲取的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)用于評(píng)估未知強(qiáng)度變換，該強(qiáng)度變換使用估計(jì)的映射參數(shù)2將熒光圖像映射到明場(chǎng)色空間。在其中使用H&E形態(tài)學(xué)染色來(lái)獲得明場(chǎng)色空間的實(shí)施方案中，J可定義為A = arg min (HE -A-FLf
A其中A為未知的映射參數(shù)，且HE和FL分別代表儲(chǔ)存相應(yīng)H&E和熒光像素的已知組的矩陣。更具體地講，HE代表H&E圖像的色通道中的強(qiáng)度值且FL為在熒光圖像色空間中的相應(yīng)點(diǎn)處熒光標(biāo)志物或自發(fā)熒光中至少一種的強(qiáng)度值。估計(jì)的映射參數(shù)可使用多種回歸分析模型計(jì)算，所述回歸分析模型包括但不限于普通線性最小二乘法(0LQ、廣義最小二乘法(GLS)、迭代再加權(quán)最小二乘法(IRLQ或正交估計(jì)法。在其中使用線性最小二乘法估計(jì)的實(shí)施方案中，^可通過(guò)以下來(lái)進(jìn)一步計(jì)算A = (HE-FIl \FL. FIl )'1其中FLt為FL矩陣的轉(zhuǎn)置，且(_1)代表矩陣求逆。用于計(jì)算映射參數(shù)的在熒光圖像與明場(chǎng)圖像中的點(diǎn)的對(duì)應(yīng)可通過(guò)兩種方法基于強(qiáng)度的方法和基于特征的方法來(lái)建立。在基于特征的方法中，對(duì)于熒光圖像和明場(chǎng)圖像二者獲取胞核、上皮、基質(zhì)或任何類型的胞外基質(zhì)材料的圖像。基于特征的結(jié)構(gòu)可使用手工處理或自動(dòng)選擇。在來(lái)自兩種模式的圖像中選擇相應(yīng)結(jié)構(gòu)。對(duì)于熒光圖像，圖像可使用具有調(diào)到給定生物標(biāo)志物的適當(dāng)激發(fā)能量來(lái)源和具有適合收集發(fā)射光的濾波器的熒光顯微鏡來(lái)捕獲。類似地，多種生物標(biāo)志物可在不移動(dòng)顯微鏡下樣品的情況下同時(shí)或連續(xù)成像。如所提到的，可對(duì)于不同標(biāo)志物改變激發(fā)波長(zhǎng)和濾波器。在某些實(shí)施方案中，可設(shè)計(jì)顯微鏡以使得其能獲取明場(chǎng)圖像和熒光圖像兩者。一種這樣的顯微鏡可涉及校準(zhǔn)的多光程和多個(gè)照相機(jī)。隨后可獲得樣品的明場(chǎng)圖像，其隨后可分割成紅色(R)通道、綠色(G)通道和藍(lán)色(B)通道并且測(cè)量基于特征的結(jié)構(gòu)的顏色和強(qiáng)度。在基于強(qiáng)度的方法中，顯微鏡下樣品區(qū)域的定位可用電子、磁性、光學(xué)或機(jī)械傳感器控制，使得樣品區(qū)域可接近相同位置重復(fù)定位以便接下來(lái)的圖像獲取?；趶?qiáng)度的配準(zhǔn)通常適用于廣泛種類的生物標(biāo)志物。一般來(lái)說(shuō)，固定或以其他方式提供在諸如但不限于TMA、載玻片、孔或載網(wǎng)的基底上的生物樣品用分子生物標(biāo)志物標(biāo)記且通過(guò)熒光顯微鏡成像。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用多種分子生物標(biāo)志物，諸如與抗體或蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光染料。隨后，在熒光顯微鏡下使用調(diào)到給定生物標(biāo)志物的激發(fā)能量來(lái)源且使用適于最佳收集發(fā)射光的多種濾波器來(lái)使樣品成像。多種生物標(biāo)志物可在不移動(dòng)顯微鏡下試樣的情況下同時(shí)或連續(xù)成像。對(duì)于不同的生物標(biāo)志物，可改變激發(fā)波長(zhǎng)和濾波器。生物標(biāo)志物可包括但不限于以下所列出的標(biāo)志物，其包括各標(biāo)志物的一種或多種但并非一定所有功能的簡(jiǎn)述Herf/neu:在乳腺癌和胃癌中過(guò)量表達(dá)的上皮生長(zhǎng)因子，單克隆抗體的治療減緩腫瘤生長(zhǎng)EGF-R/erbB 上皮生長(zhǎng)因子受體ER 一些乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)所需要的雌激素受體，位于胞核中且用ISH檢測(cè)以決定限制陽(yáng)性患者中雌激素的治療PR:孕酮受體為與DNA結(jié)合的激素AR 雄激素受體參與雄激素依賴性腫瘤生長(zhǎng)P53 腫瘤抑制基因感應(yīng)DNA破壞；在50%人類癌癥中失活β-聯(lián)蛋白癌癥中的癌基因，從細(xì)胞膜易位到胞核，其在細(xì)胞粘著和作為潛在基因調(diào)節(jié)蛋白二者中起作用。磷酸-β-聯(lián)蛋白在胞質(zhì)溶膠中降解且不轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核的β-聯(lián)蛋白的磷酸化形式GSK3 β 在Wnt途徑中的糖原合酶激酶_3 β蛋白，使β -聯(lián)蛋白磷酸化，標(biāo)記磷酸-β-聯(lián)蛋白以便在基因主體(protosome)中快速降解PKCβ 介體G-蛋白偶聯(lián)受體NFK β 當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核時(shí)炎癥的核因子κ B標(biāo)志物Bcl-2 =B細(xì)胞淋巴瘤癌基因2，充當(dāng)?shù)蛲鲆种苿┘?xì)胞周期蛋白D 細(xì)胞周期調(diào)控VEGF 與血管生成有關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子E-鈣粘著蛋白在上皮細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞間相互作用分子，其功能在上皮癌中喪失c-me 酪氨酸激酶受體。帶有區(qū)室信息的至少一種額外熒光形態(tài)學(xué)標(biāo)志物也可包括在該步驟中。選擇該標(biāo)志物使得其帶有與下一步的共同信息，且如果涉及連續(xù)染色，則用以配準(zhǔn)圖像。生物樣品的區(qū)域隨后用在明場(chǎng)色空間中可見(jiàn)的一種或多種形態(tài)學(xué)標(biāo)志物諸如蘇木精和伊紅(H&E)染料重新標(biāo)記，并再次成像。在一些實(shí)施方案中，形態(tài)學(xué)標(biāo)志物可包括但不限于以下角蛋白上皮細(xì)胞的標(biāo)志物泛-鈣粘著蛋白細(xì)胞膜的標(biāo)志物平滑肌肌動(dòng)蛋白肌肉的標(biāo)志物DAPI 胞核的標(biāo)志物蘇木精DNA的標(biāo)志物(藍(lán)色染色)伊紅胞質(zhì)的標(biāo)志物；取決于pH(紅色染色)。一些這樣的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物可使用明場(chǎng)顯微鏡成像，而一些形態(tài)學(xué)標(biāo)志物可使用熒光顯微鏡成像。在任何情況下，選擇形態(tài)學(xué)標(biāo)志物以使得其具有與較早步驟的共同信息。例如，如果在較早步驟中使用DAPI使胞核成像，則在第二步驟中可在明場(chǎng)顯微鏡下使用蘇木精使胞核成像。因?yàn)樗鼈儍烧呔瓜嗤瑓^(qū)室染色，所以圖像可通過(guò)圖像配準(zhǔn)技術(shù)對(duì)準(zhǔn)?？蓪API核染劑用作額外熒光形態(tài)學(xué)標(biāo)志物以配準(zhǔn)在明場(chǎng)圖像與熒光圖像中用蘇木精染色的胞核。樣品區(qū)域的圖像使用硬件配準(zhǔn)技術(shù)和軟件配準(zhǔn)技術(shù)兩者重疊，并且儲(chǔ)存信息，由此技術(shù)效果將是配準(zhǔn)或以另外方式產(chǎn)生樣品區(qū)域的多通道圖像。因此，基于強(qiáng)度的方法允許使用連續(xù)成像和共配準(zhǔn)技術(shù)使來(lái)自相同生物樣品的分子和形態(tài)學(xué)標(biāo)志物二者成像。隨后，對(duì)于熒光圖像和明場(chǎng)圖像二者，可對(duì)生物樣品區(qū)域上給定點(diǎn)的像素強(qiáng)度進(jìn)行配準(zhǔn)和比較。與基于特征的方法類似，明場(chǎng)圖像分割成紅色(R)通道、 綠色(G)通道和藍(lán)色(B)通道。在基于強(qiáng)度的方法或基于特征的方法中，從熒光圖像到明場(chǎng)色空間的變換使用線性變換方程中估計(jì)的映射參數(shù)i。當(dāng)使用H&E染料時(shí)，該線性變換方程可表示為
= 或以矩陣符號(hào)表示為
權(quán)利要求
1.使用熒光圖像產(chǎn)生類似于生物樣品的明場(chǎng)染色方案的明場(chǎng)型圖像的方法，所述方法包括以下步驟獲取生物樣品上固定區(qū)域的兩種或更多種熒光圖像； 將所述熒光圖像映射到明場(chǎng)色空間；和產(chǎn)生明場(chǎng)型圖像。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述明場(chǎng)型圖像對(duì)應(yīng)于具有紅色、綠色和藍(lán)色三通道色空間的H&E型圖像。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述兩種或更多種熒光圖像中的至少一種圖像為自發(fā)熒光型。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述映射步驟包括 獲取所述生物樣品的固定區(qū)域的明場(chǎng)圖像；至少部分地利用基于特征的信息或像素強(qiáng)度數(shù)據(jù)信息分析所述明場(chǎng)圖像和所述兩種或更多種熒光圖像的圖像數(shù)據(jù)以產(chǎn)生映射參數(shù)以將所述兩種或更多種熒光圖像變換為明場(chǎng)色空間；和將所述映射參數(shù)應(yīng)用到所述兩種或更多種熒光圖像。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述獲取明場(chǎng)圖像的步驟包括用蘇木精和伊紅將所述生物樣品連續(xù)染色以產(chǎn)生H&E型圖像的步驟。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述基于特征的信息包括選自胞核、上皮和基質(zhì)的一種或多種特征。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述產(chǎn)生映射參數(shù)的步驟包括使用線性估計(jì)模型。
8.權(quán)利要求7的方法，其中將所述線性估計(jì)模型定義為 k = ^grm\{HE-AFL)2A其中i為估計(jì)的映射參數(shù)，HE代表在H&E圖像的色通道中的強(qiáng)度值，且FL為熒光圖像的至少兩個(gè)色通道的強(qiáng)度值。
9.權(quán)利要求4的方法，其還包括將所述映射參數(shù)應(yīng)用到第二固定區(qū)域的兩種或更多種熒光圖像的步驟，其中所述第二固定區(qū)域來(lái)自相同或不同的生物樣品。
10.權(quán)利要求1的方法，其還包括使用所述明場(chǎng)型圖像進(jìn)行病理診斷的步驟。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述病理診斷用于癌癥。
12.權(quán)利要求1的方法，其還包括使用所述明場(chǎng)型圖像進(jìn)行定量分析的步驟。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述定量分析的步驟包括確定分子途徑與選自胞核、上皮和基質(zhì)的一種或多種形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。
14.使用熒光圖像產(chǎn)生類似于生物樣品的明場(chǎng)染色方案的明場(chǎng)型圖像的圖像分析系統(tǒng)，其包括適于獲取生物樣品上固定區(qū)域的兩種或更多種熒光圖像的數(shù)字成像裝置；和適于應(yīng)用映射參數(shù)以將所述兩種或更多種熒光圖像變換為明場(chǎng)型圖像的處理裝置。
15.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中所述處理裝置進(jìn)一步配置以通過(guò)以下步驟計(jì)算所述映射參數(shù)獲取所述固定區(qū)域的明場(chǎng)圖像；和至少部分地分析所述明場(chǎng)圖像和所述兩種或更多種熒光圖像的基于特征的信息或像素強(qiáng)度數(shù)據(jù)信息以將所述兩種或更多種熒光圖像變換為明場(chǎng)色空間。
16.權(quán)利要求15的系統(tǒng)，其中所述分析步驟包括線性估計(jì)模型。
17.權(quán)利要求15的系統(tǒng)，其中所述處理裝置進(jìn)一步配置以儲(chǔ)存來(lái)自一個(gè)或多個(gè)先前分析的生物樣品的映射參數(shù)。
全文摘要
提供了使用熒光圖像產(chǎn)生類似于生物樣品的明場(chǎng)染色方案的明場(chǎng)型圖像的方法。其步驟包括獲取生物樣品上固定區(qū)域的兩種或更多種熒光圖像，將所述熒光圖像映射到明場(chǎng)色空間并產(chǎn)生明場(chǎng)圖像。還提供了使用熒光圖像產(chǎn)生生物樣品的明場(chǎng)型圖像的圖像分析系統(tǒng)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102575990SQ201080044716
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者A·肯, M·J·杰德斯, M·O·貝洛, Q·李 申請(qǐng)人:通用電氣公司