專利名稱：一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法。
背景技術(shù)：
諾如病毒(Noroviruses, NoV)又稱諾瓦克樣病毒(Norwalk-likevirus, NLV s)，屬于杯狀病毒科，是引起病毒性胃腸炎暴發(fā)的重要病原之一。為單股正鏈小RNA病 毒，無包膜，具有20面體結(jié)構(gòu)，直徑27-40nm?；蚪M長約為7. 5kb，由3個開放讀碼框架 (openreading frame,0RF)組成。諾如病毒感染性腹瀉具有發(fā)病急、傳播速度快、涉及范圍 廣等特點，對公共衛(wèi)生有著重要影響。近年來歐美、澳大利亞、中國等國家相繼發(fā)生NoV感 染性腹瀉暴發(fā)疫情。生吃貝類或加熱未熟透的水產(chǎn)品食物，是導(dǎo)致諾如病毒胃腸炎暴發(fā)流 行的最常見原因之一 (Costantini V et al. Human and animal entericcaliciviruses in oysters from different coastal regions of theUnited States. Appl Environ Microbiol, 2006, 72 (3) :1800_1809.)。其中，水產(chǎn)品中牡蠣是NoV傳播的重要載體，是引起 胃腸炎暴發(fā)的最常見的食源。如美國20世紀(jì)90年代，因消費牡蠣而引起的胃腸炎中，至少 52%的病原為NoV。柳淑芳，等.牡蠣中諾如病毒的分子流行病學(xué)研究進(jìn)展。海洋科學(xué)， 2008，32 (8) 82-86.研究表明，根據(jù)諾如病毒聚合酶和衣殼蛋白編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列特征，可 細(xì)分為5個遺傳組(I-V)，其中GG II是全球多數(shù)國家急性腸胃炎最主要的病原之一，我國 諾如病毒的感染基本上是遺傳組II型，遺傳組I型少見李靈輝，等.廣東省2005年諾瓦克 樣病毒感染暴發(fā)疫情.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，32 (5) 11-14.。我國已報道多個地區(qū)(如北 京、長沙、廣東省、蘭州、濟(jì)南、江門、東莞市、廣西、佛山市南海區(qū)等)采用流行病學(xué)現(xiàn)場調(diào) 查和統(tǒng)計分析方法進(jìn)行調(diào)查了解諾如病毒引起的感染性腹瀉暴發(fā)疫情的流行病學(xué)特點及 傳播途徑郭麗，等.諾如病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展.傳染病信息，2009，22 (3) 174-178.]諾如病毒感染具有起病急、傳播快、消失早的特性，一旦出現(xiàn)暴發(fā)疫情，需要在短 時間內(nèi)準(zhǔn)確分析大量的樣品。國內(nèi)則缺乏對此的系統(tǒng)監(jiān)測和研究，一旦發(fā)生食物等來源 的感染暴發(fā)，缺少有效的現(xiàn)場檢測技術(shù)和方法徐友富，等.諾如病毒感染國內(nèi)外研究概 況.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18 (5) =949-951.。因此，迫切需要發(fā)展有效的諾如病毒的快 速檢測方法，并制定相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，本發(fā) 明利用實時熒光PCR技術(shù)檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的方法具有靈敏度高、檢測時間短和可定 量分析的特點，可用于水產(chǎn)品中諾如病毒的定性篩查和定量分析。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，包括如下步驟1)設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品諾如病毒的2組引物及探針；
2)水產(chǎn)品中諾如病毒的富集與回收；3)水產(chǎn)品中諾如病毒RNA的提取；4)實時熒光PCR檢測；所述的2組引物為諾如病毒I型和諾如病毒II型，其中諾如病毒I型的上游引物為 5’ -CGYTGGATGCGNTYCCATGA-3‘；諾如病毒 I 型的下游引物為5’ -CATTTACTACTACCGCAGATTCC-3’ ； 諾如病毒II型的上游引物為5’ -ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC-3‘諾如病毒II型的下游引物為 5’ -ACACTTACTTCTACCGCAGCT-3’ ；且諾如病毒 I 型的探針為5’ -FAM-TGTGGACAGGAGATCGC-TAMRA 3’ ；諾如病毒 II 型的探針為5’ -FAM-AGGGCGATCGCAATCT-TAMRA 3’。所述的諾如病毒的富集步驟為取5-6份水產(chǎn)品樣品，洗凈外表，解剖取下內(nèi)臟組 織和腮5g，用剪刀仔細(xì)切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液，高速勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液 裝入50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10, 000 X g條件下冷凍離心30min。取上清，
棄沉淀。所述的甘氨酸緩沖液為0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl，pH9. 5。所述的諾如病毒的回收步驟為移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000 溶液，顛倒5次混勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，OOOXg離心5min，棄去上清，保留沉淀， 加入2mL的生理鹽水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，000 X g離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。所述的水產(chǎn)品中諾如病毒RNA的提取試劑采用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取試劑盒。所述的實時熒光PCR檢測中擴(kuò)增反應(yīng)條件為45°C逆轉(zhuǎn)錄20-40min，94°C預(yù)變性 5-15min ；93-95°C X 15_35sec，50_60°C X30_60sec，循環(huán) 35-45 次；檢測設(shè)立陽性對照、陰 性對照和空白對照；熒光通道檢測選擇FAM通道；反應(yīng)結(jié)束后，利用熒光PCR儀器的分析軟 件，依據(jù)擴(kuò)增動力學(xué)曲線和Ct值進(jìn)行分析測定。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明利用實時熒光PCR技術(shù)檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的方 法具有靈敏度高、檢測時間短和可定量分析的特點，可用于水產(chǎn)品中諾如病毒的定性篩查 和定量分析，及用于開發(fā)諾如病毒的實時熒光PCR檢測試劑盒。


圖1為本發(fā)明實施例中利用TaqMan探針法實時熒光PCR擴(kuò)增牡蠣RNA的動力學(xué) 曲線；圖2為本發(fā)明實施例中利用TaqMan探針法實時熒光PCR擴(kuò)增10倍梯度稀釋牡蠣 RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為本發(fā)明實施例中花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的動力學(xué)曲線；圖4為本發(fā)明實施例中花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的熔解曲線；圖5為本發(fā)明實施例中對蝦樣品TaqMan探針法實時熒光PCR檢測的動力學(xué)曲線。
具體實施例方式實施例1本實施例水產(chǎn)品為牡蠣樣品，步驟為
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1、設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品諾如病毒的2組引物及探針?biāo)龅囊餅橹Z如病毒I型和II型，其中諾如病毒I型的上游引物為 5’ -CGYTGGATGCGNTYCCATGA-3‘；諾如病毒 I 型的下游引物為5’ -CATTTACTACTACCGCAGATTCC-3’ ； 諾如病毒II型的上游引物為5’ -ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC-3‘諾如病毒II型的下游引物為 5’ -ACACTTACTTCTACCGCAGCT-3’ ；且諾如病毒 I 型的探針為5’ -FAM-TGTGGACAGGAGATCGC-TAMRA 3’ ；諾如病毒 II 型的探針為5’ -FAM-AGGGCGATCGCAATCT-T AMRA 3’。2、牡蠣樣品中的諾如病毒的富集與回收病毒的富集取5-6份水產(chǎn)品樣品，洗凈外表，解剖取下內(nèi)臟組織(和腮)約5g，用 剪刀仔細(xì)切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液(0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl, pH 9. 5)，高速 勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10，000 X g 條件下冷凍離心30min。取上清。病毒的回收移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000溶液，顛倒5次混 勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL的生理鹽 水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，OOOXg離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。 3、牡蠣樣品中諾如病毒RNA的提取提取病毒RNA流程(使用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QlAamp ViralRNA Mini Kit)1)移取560 μ L緩沖液AVL-Carrier RNA (該試劑為德國QIAGEN公司生產(chǎn)的 QIAamp Viral RNA Mini Kit 中的產(chǎn)品)至 1. 5mL 離心管中；2)移入140 μ L樣液，漩渦混勻，15s ；室溫孵育IOmin ；3)稍離心，移入560 μ L無水乙醇，渦旋混勻，15s，稍離心；4)移取上一步驟處理后溶液630 μ L至套有2mL收集管的分離柱上，6000g，離心 Imin ；更換新收集管，遺棄舊收集管；重復(fù)一次；5)移入500 μ L緩沖液AWl (該試劑為德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的產(chǎn)品)，6000g，離心lmin，更換新收集管；6)移入500 μ L緩沖液AW2，(該試劑為德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp Viral RNA Mini Kit中的產(chǎn)品)，20000g離心3min，更換新收集管；7) 20000g離心lmin，更換新收集管；8)移入40 μ L無RNA酶超純水，室溫孵育lmin，6000g離心Imin ；-20°C或-80°C保存。4、牡蠣樣品實時熒光PCR檢測按照病毒RNA提取試劑盒說明操作配制熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，體系包括PCR緩 沖液、MgCl2、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、諾如病毒I型的上、下游引物、諾如病毒 II型的上、下游引物、OligodT、RNA模板、無RNA酶超純水、諾如病毒I、II型的探針。使用 ABI7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。擴(kuò)增反應(yīng)條件為45°C逆轉(zhuǎn)錄20-40min，94°C預(yù)變性 5-15min ;93-95°C X 15_35sec，50_60°C X30_60sec，循環(huán) 35-45 次。檢測設(shè)立陽性對照、陰 性對照和空白對照；熒光通道檢測選擇檢測選擇FAM通道。反應(yīng)結(jié)束后，利用熒光PCR儀 器的分析軟件，依據(jù)擴(kuò)增動力學(xué)曲線和Ct值進(jìn)行分析。如圖1和圖2所示，圖1中，TaqMan 探針法熒光定量PCR擴(kuò)增牡蠣樣品諾如病毒RNA的動力學(xué)曲線，2、4、5為牡蠣樣品，1為諾 如病毒II型陽性對照、3為諾如病毒I型陽性對照，6為陰性對照。圖2為利用TaqMan探針法實時熒光PCR擴(kuò)增10倍梯度稀釋牡蠣RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實施例2本實施例水產(chǎn)品為花蛤樣品，步驟為1、設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品諾如病毒的1組II型引物及探針TO的弓丨物為諾如病毒II型，其中諾如病毒II型的上游弓丨物為:5，^iGrmKMmnoc-3， 諾如病毒π型的下游引物為:5’ -^χ κμ κ ιμ -3'；諾如病毒π型的探針為 5，H^fflmiOIMicr-Tm 3，。2、花蛤樣品中的諾如病毒的富集與回收病毒的富集取5-6份水產(chǎn)品樣品，洗凈外表，解剖取下內(nèi)臟組織(和腮)約5g，用 剪刀仔細(xì)切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液(0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl, pH 9. 5)，高速 勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10，OOOXg 條件下冷凍離心30min。取上清。病毒的回收移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000溶液，顛倒5次混 勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL的生理鹽 水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，OOOXg離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。3、花蛤樣品中諾如病毒RNA的提取提取病毒RNA流程(使用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp ViralRNA Mini Kit)1)移取 560 μ L 緩沖液 AVL-Carrier RNA 至 1. 5mL 離心管中；2)移入140 μ L樣液，漩渦混勻，15s ；室溫孵育IOmin ；3)稍離心，移入560 μ L無水乙醇，渦旋混勻，15s，稍離心；4)移取上一步驟處理后溶液630 μ L至套有2mL收集管的分離柱上，6000g，離心
Imin ；更換新收集管，遺棄舊收集管；重復(fù)一次；保存。
5)移入50(^1^緩沖液11，600(^，離心lmin，更換新收集管；
6)移入500μ L緩沖液Aff2, 20000g離心3min,更換新收集管；
7)20000g離心lmin，更換新收集管；
8)移入40μL無RNA酶超純水，室溫孵育lmin，6000g離心Imin ；-20°C或_80°C 4、采用兩步法，即逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光PCR檢測。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系MgCl2, 25mM4μ L
反轉(zhuǎn)錄IOX緩沖液2μ L
dNTP混合物，IOmM2μ L
反轉(zhuǎn)錄酶0. 65 μ L
隨機引物1 μ L
RNA2. 5μ L
無核酸酶水7. 85 μ L
總體系20 μ 1以上物質(zhì)為美國Promega公司生產(chǎn)的Reverse TranscriptionSystem逆轉(zhuǎn)錄試 劑。將反應(yīng)體系于室溫孵育10-15分鐘，然后于42_45°C溫育10_15分鐘；將樣品于90-95°C加熱5分鐘，然后于4°C放置5分鐘，-20°C或-80°C保存。實時熒光定量PCR體系Taq Master Mix (德國 QIAGEN 公司)12. 5 μ L上游引物(5ymol/mL)2μ L下游引物(5ymol/mL)2μ LSYBR Green Ι(5-10Χ)(美國 Inv itrogen 公司)2yL模板(cDNA)2 μ L無核酸酶水4. 5 μ L總體系25 μ L按照病毒RNA提取試劑盒說明操作配制熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，體系包括PCR緩 沖液、MgCl2、DNA聚合酶、諾如病毒II型的上游引物、諾如病毒II型的下游引物、模板、SYBR Green I、無RNA酶超純水。使用ABI 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。擴(kuò)增反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 5-15min ；93-95°C X 15_35sec，50_60°C X 30_60sec，循環(huán) 35-45 次。融解曲線 950C 15-30sec,50-60°C X 30_60sec，95°C 15_30sec，升溫速度為 0. 1°C /sec。檢測設(shè)立陽 性對照、陰性對照和空白對照；收集SYBR熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后，利用熒光PCR儀器的分 析軟件，依據(jù)擴(kuò)增動力學(xué)曲線和Ct值進(jìn)行分析。如圖3和圖4所示，圖3為花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的動力學(xué)曲線，圖4為花蛤樣品SYBR Green實時熒光PCR檢測的 熔解曲線。結(jié)果顯示擴(kuò)增動力學(xué)曲線呈典型的S型，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線圖譜顯示其Tm值 為84°C，且只有一個特異峰，表明無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。實施例3 本實施例水產(chǎn)品為蝦樣品，步驟為1、設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品諾如病毒的1組I型引物及探針臓的弓丨物為諾如病毒I型，其中諾如病毒I型的上游弓丨物為:5，"0GYTGGATGaMY0CATGA-3，； 諾如病毒I型的下游引物為:5’ "CMTTACTACTA00GQ\GATT0C-3’ ；且諾如病毒I型的探針為: 5，H^IGTGGAQVGGAGATOGC-TAMRA 3，。2、蝦樣品中的諾如病毒的富集與回收病毒的富集取5-6份蝦樣品，洗凈外表，解剖取下內(nèi)臟組織約5g，用剪刀仔細(xì)切 碎，加入35mL甘氨酸緩沖液，高速勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入50mL離心管，37°C下 水浴振蕩30min，4°C，10，OOOXg條件下冷凍離心30min。取上清。病毒的回收上清加入等體積的PEG 8000溶液，顛倒5次混勻；冰上放置至少Ih 后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL的生理鹽水，劇烈震蕩，重懸病 毒，5，000 Xg離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。3、蝦樣品中諾如病毒RNA的提取提取病毒RNA流程(使用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp ViralRNA Mini Kit)1)移取 560 μ L 緩沖液 AVL-Carrier RNA 至 1. 5mL 離心管中；2)移入140 μ L樣液，漩渦混勻，15s ；室溫孵育IOmin ；3)稍離心，移入560 μ L無水乙醇，渦旋混勻，15s，稍離心；4)移取上一步驟處理后溶液630 μ L至套有2mL收集管的分離柱上，6000g，離心 Imin ；更換新收集管，遺棄舊收集管；重復(fù)一次；
5)移入50(^1^緩沖液々11，600(^，離心lmin，更換新收集管；6)移入500 μ L緩沖液AW2，20000g離心3min，更換新收集管；7) 20000g離心lmin，更換新收集管；8)移入40 μ L無RNA酶超純水，室溫孵育lmin，6000g離心Imin ；-20°C或-80°C保存。4、蝦樣品實時熒光PCR檢測按照病毒RNA提取試劑盒說明操作配制熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，體系包括PCR緩 沖液、MgCl2、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、諾如病毒I型的上游引物、諾如病毒I型 的下游引物、Oligo dT、RNA模板、無RNA酶超純水、諾如病毒I型的探針。使用ABI7500型 熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。擴(kuò)增反應(yīng)條件為45°C逆轉(zhuǎn)錄20-40min，94°C預(yù)變性5-15min ； 93-950C X15-35sec，50-60°C X 30_60sec，循環(huán)35-45次。檢測設(shè)立陽性對照、陰性對照和 空白對照；熒光通道檢測選擇檢測選擇FAM通道。反應(yīng)結(jié)束后，利用熒光PCR儀器的分析 軟件，依據(jù)擴(kuò)增動力學(xué)曲線和Ct值進(jìn)行分析。如圖5所示，陽性樣品呈典型的S型，陰性對 照 Ct = Undet。
權(quán)利要求
一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于包括如下步驟1)設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品諾如病毒的2組引物及探針；2)水產(chǎn)品中諾如病毒的富集與回收；3)水產(chǎn)品中諾如病毒RNA的提??；4)實時熒光PCR檢測；所述的2組引物為諾如病毒I型和諾如病毒II型，其中諾如病毒I型的上游引物為5’ CGYTGGATGCGNTYCCATGA 3’；諾如病毒I型的下游引物為5’ CATTTACTACTACCGCAGATTCC 3’；諾如病毒II型的上游引物為5’ ATGTTYAGRTGGATGAGRTTCTC 3’諾如病毒II型的下游引物為5’ ACACTTACTTCTACCGCAGCT 3’；且諾如病毒I型的探針為5’ FAM TGTGGACAGGAGATCGC TAMRA 3’；諾如病毒II型的探針為5’ FAM AGGGCGATCGCAATCT TAMRA 3’。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在 于所述的諾如病毒的富集步驟為取5-6份水產(chǎn)品樣品，洗凈外表，解剖取下內(nèi)臟組織和腮 5g，用剪刀仔細(xì)切碎，加入35mL甘氨酸緩沖液，高速勻漿機高速勻漿3min，將勻漿液裝入 50mL離心管，37°C下水浴振蕩30min，4°C，10，000 Xg條件下冷凍離心30min。取上清，棄沉 淀。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的甘氨酸緩沖液為0. lmol/L甘氨酸，0. 3mol/L NaCl, pH 9. 5。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的諾如病毒的回收步驟為移取上清至一 50mL新管，加入等體積的PEG 8000溶液，顛 倒5次混勻；冰上放置至少Ih后，4°C，10，000 X g離心5min，棄去上清，保留沉淀，加入2mL 的生理鹽水，劇烈震蕩，重懸病毒，5，000 X g離心lmin，取上清液140 μ L用于RNA提取。
5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的水產(chǎn)品中諾如病毒RNA的提取試劑采用QIAamp Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取 試齊U盒。
6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，其特征在于 所述的實時熒光PCR檢測中擴(kuò)增反應(yīng)條件為45°C逆轉(zhuǎn)錄20-40min，94°C預(yù)變性5-15min ； 93-950C X15-35sec，50-60°C X30_60sec，循環(huán)35-45次；檢測設(shè)立陽性對照、陰性對照和 空白對照；熒光通道檢測選擇FAM通道；反應(yīng)結(jié)束后，利用熒光PCR儀器的分析軟件，依據(jù) 擴(kuò)增動力學(xué)曲線和Ct值進(jìn)行分析測定。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的實時熒光PCR方法，包括如下步驟1)設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品諾如病毒的2組引物及探針；2)水產(chǎn)品中諾如病毒的富集與回收；3)水產(chǎn)品中諾如病毒RNA的提?。?)實時熒光PCR檢測。本發(fā)明利用實時熒光PCR技術(shù)檢測水產(chǎn)品中諾如病毒的方法具有靈敏度高、檢測時間短和可定量分析的特點，可用于水產(chǎn)品中諾如病毒的定性篩查和定量分析，及用于開發(fā)諾如病毒的實時熒光PCR檢測試劑盒。
文檔編號G01N21/64GK101948936SQ20101050106
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者周常義, 李莉, 蘇國成, 蘇文金, 鄭惠能, 黃建煒, 黃自成 申請人:集美大學(xué)