專利名稱：一種利用納米材料電極增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光信號的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電化學(xué)發(fā)光信號檢測技術(shù)領(lǐng)域，是一種利用納米材料制備的電極來增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光檢測信號的方法。技術(shù)背景
目前對于痕量分析物包括環(huán)境污染物、藥物、激素、蛋白質(zhì)、核酸等的高靈敏度定量篩選和檢測已經(jīng)成為廣大研究工作者和臨床工作者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。為了實(shí)現(xiàn)痕量分析物的高特異性檢測，各種基于生物特異性親合反應(yīng)如抗原-抗體、核酸雜交、受體-配體反應(yīng)的生物檢測方法和體系日益發(fā)展起來。由于生物親合反應(yīng)自身產(chǎn)生的物理變化非常微弱，難于直接檢測，通常將親合反應(yīng)的反應(yīng)物之一標(biāo)記上能產(chǎn)生特異信號的物質(zhì)或分子，稱為標(biāo)記物。根據(jù)產(chǎn)生信號的不同，標(biāo)記物可分為放射性同位素、熒光染料、電化學(xué)分子、酶、 化學(xué)發(fā)光物、電化學(xué)發(fā)光物等。比如，免疫檢測最初使用125I作為標(biāo)記物，通過放射性信號測量進(jìn)行檢測定量。這個方法精密度高，測定可靠，但由于放射性元素的使用，需要建立特殊的實(shí)驗(yàn)室，否則對人體會造成很大的傷害。另外，125I有一定的半衰期。為了克服這些缺點(diǎn)，后來發(fā)展了使用酶作為標(biāo)記物，利用酶催化底物的顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測的酶聯(lián)免疫反應(yīng) (ELISA)，但其靈敏度受到了限制。
電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)是在免疫檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，繼放射免疫、酶聯(lián)免疫和普通化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)以后的新一代檢測技術(shù)。與其它技術(shù)比較，該技術(shù)除了具備普通化學(xué)發(fā)光所有的靈敏度高、線性范圍寬、檢測項(xiàng)目廣泛、試劑安全等特點(diǎn)外，還具有標(biāo)記物體積小、試劑穩(wěn)定、發(fā)光劑為單組分、發(fā)光信號可控性強(qiáng)等特殊優(yōu)勢，是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。電化學(xué)發(fā)光(ECL)是指由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過程。在電極上施加一定的電壓或電流時，電極上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，在電極反應(yīng)產(chǎn)物之間、或電極反應(yīng)產(chǎn)物與溶液中某種組分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測分析的文獻(xiàn)報(bào)道直至80年代初才出現(xiàn)，90年代開始用于試劑的臨床檢測中。從整體上講，電化學(xué)發(fā)光包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程，故是化學(xué)發(fā)光的一種發(fā)展，但同時與化學(xué)發(fā)光又有一定的區(qū)別和其獨(dú)特的優(yōu)勢一般的化學(xué)發(fā)光生物分析的標(biāo)記物是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)催化酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酶等)或化學(xué)發(fā)光分子(如魯米諾、吖啶酯等)，其發(fā)光強(qiáng)度受周圍環(huán)境的影響較大，而且穩(wěn)定性不高，特別是生物酶。而電化學(xué)發(fā)光免疫分析一般采用三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+為標(biāo)記物，Ru(bpy)32+在三丙胺陽離子自由基(TPA+)的催化及三角形脈沖電壓激發(fā)下，只需毫秒內(nèi)就可發(fā)出穩(wěn)定的光。Ru(bpy)32+在發(fā)光過程中的再循環(huán)利用大大提高了分析的靈敏度；小分子的金屬配合物作為標(biāo)記物，穩(wěn)定性高。因此，電化學(xué)發(fā)光生物分析有其突出的優(yōu)點(diǎn)標(biāo)記物穩(wěn)定，靈敏度高，過程可控性強(qiáng)。ECL具有更好的發(fā)展趨勢。
根據(jù)科學(xué)界公認(rèn)的ECL反應(yīng)機(jī)理(如圖1所示)，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號的物種是激發(fā)態(tài)的標(biāo)記物Ru (bpy) 32+。激發(fā)態(tài)的Ru (bpy) 32+可以通過兩種反應(yīng)途徑生成⑴Ru (bpy) 32+ 在電極上被氧化生成Ru (bpy)33+，同時共反應(yīng)物三丙胺(TPA)也在電極上被氧化成為TPA+。由于這個有機(jī)陽離子在水溶液中不穩(wěn)定，迅速分解成為自由基TPA+。后者是個極強(qiáng)的還原劑，能與Ru (bpy)33+進(jìn)行快速氧化還原反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+。(2) Ru (bpy) 32+在電極上被氧化生成Ru (bpy) 33+，然后通過溶液均相氧化還原反應(yīng)將TPA氧化，二者再通過上述的反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的Ru (bpy) 32+。在生物檢測中，一般采用Ru (bpy) 32+作為信號標(biāo)記物，它的濃度非常低，所以ECL信號產(chǎn)生的主要途徑是第一個。由此可以看出，TPA的電極氧化反應(yīng)是ECL檢測中一個非常關(guān)鍵的步驟。在現(xiàn)在通用的體系中，絕大多數(shù)都使用金、鉬金、碳等作為電極材料，對TPA的電極氧化反應(yīng)具有較高的活性，所以ECL信號較高。而在常規(guī)的金屬氧化物電極如氧化銦錫(ITO)電極上，TPA的電極氧化反應(yīng)非常緩慢，導(dǎo)致ECL信號低。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種提高電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
a)以一種金屬氧化物導(dǎo)電納米材料制備成電極；
b)用該電極加快電化學(xué)發(fā)光體系(發(fā)光劑+共反應(yīng)物)中共反應(yīng)物的電極反應(yīng)速率，由此增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光的信號強(qiáng)度；
所述的電化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)方法中，其所述的金屬氧化物，為氧化銦、氧化錫、氧化鋅、氧化銦錫或其復(fù)合物。
所述的電化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)方法中，其所述的納米材料，其形狀為球形、線形、管狀、片狀、立方體形，其尺寸在1-100納米之間。
所述的電化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)方法中，所述的電化學(xué)發(fā)光體系，發(fā)光劑是三聯(lián)吡啶釕Ru (bpy) 32+或其化學(xué)類似物，共反應(yīng)物是三丙胺或其化學(xué)類似物。
本發(fā)明與現(xiàn)有的其他方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
1)目前流行的電化學(xué)發(fā)光檢測方法中，均使用常規(guī)導(dǎo)電材料作為電極，如金、 鉬金、玻碳、氧化銦錫厚膜電極等。在這些電極上，特別是在氧化銦錫厚膜電極上，共反應(yīng)物三丙胺的電極氧化反應(yīng)速率較慢，導(dǎo)致三丙胺電化學(xué)氧化電流偏低，最終影響發(fā)光劑Ru (bpy) 32+的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度。本發(fā)明使用了納米級的金屬氧化物材料如氧化銦錫納米顆粒作為電極，提高了共反應(yīng)物三丙胺的電極氧化反應(yīng)速率，最終增強(qiáng)了發(fā)光劑 Ru (bpy) 32+的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度。
2)常規(guī)導(dǎo)電材料做成的電化學(xué)發(fā)光電極，如金、鉬金、玻碳等，這些電極的透光性較差，不適合光信號的檢測。本發(fā)明使用了納米級的金屬氧化物材料如氧化銦錫納米顆粒作為電極，在提高電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的同時，也保證了電極的透光性，有利于光信號的檢測。


圖1含有發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕(Ru (bpy) 32+)和共反應(yīng)物三丙胺(TPA)的電化學(xué)發(fā)光體系的信號產(chǎn)生原理圖。
圖2合成的粒徑為25nm的氧化銦錫納米顆粒的透射電子顯微鏡照片。
圖3由25nm氧化銦錫納米顆粒制備的納米電極的掃描電子顯微鏡照片。
圖4不同電極在0. IM三丙胺中的電化學(xué)電流響應(yīng)曲線圖，其中(a)常規(guī)氧化銦錫電極；(b)氧化銦錫納米電極；(c)常規(guī)金膜電極。測量條件Ag/AgCl (3M KCl)參比電極， 100mV/s電壓掃速。
圖5不同電極的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)曲線圖，其中(a)常規(guī)氧化銦錫電極；(b)氧化銦錫納米電極；(c)常規(guī)金膜電極。測量條件:1 μ M Ru(bpy)32+，0. IM三丙胺，150mM磷酸緩沖液，pH 7. 4，Ag/AgCl (3M KCl)參比電極，100mV/s 電壓掃速。
圖6不同電極對可見光的透光率，其中(a)常規(guī)氧化銦錫電極；(b)由1. 25%納米氧化銦錫膠體制備的納米電極；(c)由10%納米氧化銦錫膠體制備的納米電極。(d)常規(guī)金膜電極。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明方法在實(shí)施過程中使用的試劑包括以下幾種成分金屬氧化物納米材料， 由金屬氧化物納米材料制備的納米電極，以及可以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號的發(fā)光劑和共反應(yīng)物。使用的裝置包括恒電位儀和弱光檢測器(光電倍增管PMT或C⑶成像儀等)。采用上述納米電極作為工作電極，在電化學(xué)發(fā)光劑和共反應(yīng)物存在時，通過恒電位儀向工作電極施加電壓，可產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號，光信號由弱光檢測器進(jìn)行定量檢測。
以氧化銦錫納米顆粒、Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光劑、三丙胺共反應(yīng)物為例，來說明本發(fā)明方法的具體實(shí)施流程
(1)粒徑為25nm的氧化銦錫納米顆粒的合成
取結(jié)晶四氯化錫、三氯化銦以超純水配成100mL、0. 5M的10% SnCl4+90% MCl3溶液。取IOmL此溶液轉(zhuǎn)入放有磁力攪拌子的錐形瓶中，置于恒溫加熱磁力攪拌器上(實(shí)驗(yàn)過程中恒溫在80°C，攪拌轉(zhuǎn)速為600r/min，并加入一片聚乙二醇約0. 03g)。取約0. 8g氫氧化鈉以超純水配成40mL溶液轉(zhuǎn)入固定在錐形瓶上方的滴液漏斗中?？刂频嗡僭诩slmL/min 向錐形瓶中滴加NaOH溶液至整個錐形瓶中溶膠pH值為7為止。將已呈灰白色的上述溶膠轉(zhuǎn)移至燒杯中，80°C下加入40mL超純水，攪拌，靜置，分層。去除上層清液后，向溶膠中加入 0. 04% Triton-IOO溶液定容至50mL備用。圖2為合成的粒徑為25nm的氧化銦錫納米顆粒的透射電子顯微鏡照片。
(2)氧化銦錫納米電極的制備
導(dǎo)電玻璃購買于深圳南玻集團(tuán)，導(dǎo)電膜厚度為900 ± 100 A，方阻為19 士 2. 1 Ω / 口。 將導(dǎo)電玻璃自行加工至5cmX5cm規(guī)格，分別用洗滌劑(15分鐘)、純水Qmin，兩次)、丙酮 (5min)、異丙醇(5min)和純水(lOmin，兩次)超聲洗滌，置于50°C烘干。用CTD-1000型等離子體表面處理儀(南京昆侖電子有限公司產(chǎn)品)對導(dǎo)電玻璃表面進(jìn)行60s處理，以獲得更為潔凈的表面。取適量(1)中制備的納米氧化銦錫膠體溶液均勻鋪展在導(dǎo)電玻璃表面， 干燥后，置于450°C燒結(jié)30min，即獲得氧化銦錫納米電極。經(jīng)燒結(jié)后，氧化銦錫納米顆粒膜層牢固地吸附于導(dǎo)電玻璃表面(見圖3氧化銦錫納米顆粒制備的納米電極的掃描電子顯微鏡照片)。
(3)電化學(xué)電流信號的檢測
電化學(xué)電流信號檢測在0. IM三丙胺溶液中(pH 7. 4，150mM磷酸緩沖液)進(jìn)行。 電化學(xué)電流檢測裝置為CHI 660B電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司)，采用的三電極體系為納米氧化銦錫、常規(guī)氧化銦錫或常規(guī)金膜電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極(3M KCl)，鉬片為輔助電極，工作電極接觸面積為0. 25cm2。不同電極在0. IM三丙胺中的電化學(xué)電流響應(yīng)見圖4，可見三丙胺在納米氧化銦錫電極上的氧化電流顯著高于常規(guī)氧化銦錫電極上的電流。
(4)電化學(xué)發(fā)光信號的檢測
電化學(xué)發(fā)光信號檢測在0. IM三丙胺和1 μ M的Ru (bpy) 32+溶液中(pH 7. 4，150mM 磷酸緩沖液)進(jìn)行。電極電壓控制裝置為CHI 660B電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司)， 采用的三電極體系為納米氧化銦錫、常規(guī)氧化銦錫或常規(guī)金膜電極為工作電極，Ag/AgCl 電極為參比電極(3M KCl)，鉬片為輔助電極，工作電極接觸面積為0.25cm2。電化學(xué)發(fā)光信號使用光電倍增管(日本濱松，型號H9306-0;3)采集，利用CHI 660B電化學(xué)分析儀對產(chǎn)生的光電流信號進(jìn)行記錄。電化學(xué)發(fā)光檢測在密閉的暗箱中進(jìn)行。不同電極在0. IM三丙胺和1 μ M的Ru (bpy) 32+溶液中的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)見圖5?？梢娫诩{米氧化銦錫電極上的電化學(xué)發(fā)光信號是常規(guī)氧化銦錫電極上的10倍，是常規(guī)金電極上的2倍。
(5)電極透光率的測量
以空氣作為空白，分別將納米氧化銦錫、常規(guī)氧化銦錫和常規(guī)金膜電極放入美國安捷倫89090A型紫外-可見分光光度計(jì)的樣品池中，測量各個電極在可見光光譜(350-800 納米)范圍內(nèi)的透光率。不同電極對可見光的透光率見圖6，可見由1.25%納米氧化銦錫膠體制備的納米電極的透光率與常規(guī)氧化銦錫電極比較只有輕微的下降，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)金膜電極的透光率。
本發(fā)明方法通過采用金屬氧化物納米材料制備納米電極，加快電化學(xué)發(fā)光體系中共反應(yīng)物在電極上的氧化反應(yīng)速率，由此增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光劑的發(fā)光信號強(qiáng)度，同時保持電極的透光性。與現(xiàn)有的其他電化學(xué)發(fā)光電極相比，該方法中的電極具有信號高、透光性好等優(yōu)點(diǎn)，可以用于各種電化學(xué)發(fā)光檢測分析中。
權(quán)利要求
1.一種利用納米材料電極增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光信號的方法，其特征在于a)以一種金屬氧化物導(dǎo)電納米材料制備成電極；b)用該電極加快電化學(xué)發(fā)光體系(發(fā)光劑+共反應(yīng)物)中共反應(yīng)物的電極反應(yīng)速率， 由此增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光的信號強(qiáng)度；
2.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光新方法，其特征在于所述的金屬氧化物，為氧化銦、氧化錫、氧化鋅、氧化銦錫或其復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光新方法，其特征在于所述的納米材料，其形狀為球形、線形、管狀、片狀、立方體形。
4.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光新方法，其特征在于所述的納米材料，其尺寸在 1-100納米之間。
5.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光新方法，其特征在于所述的電化學(xué)發(fā)光體系中，發(fā)光劑是三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+或其化學(xué)類似物。
6.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光新方法，其特征在于所述的電化學(xué)發(fā)光體系中，共反應(yīng)物是三丙胺或其化學(xué)類似物。
全文摘要
一種利用納米材料電極增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光信號的方法，涉及電化學(xué)發(fā)光信號檢測技術(shù)。該方法以一種金屬氧化物導(dǎo)電納米材料制備成電極，用該電極加快電化學(xué)發(fā)光體系中共反應(yīng)物的電極反應(yīng)速率，由此增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光的信號強(qiáng)度，提高電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的靈敏度。本發(fā)明與現(xiàn)有的電化學(xué)發(fā)光電極材料相比，具有信號強(qiáng)度高、透光性好等優(yōu)點(diǎn)，特別適合電化學(xué)發(fā)光信號的檢測。
文檔編號G01N21/76GK102539411SQ201010578278
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者郭良宏 申請人:郭良宏