專利名稱：一種小粒徑勻相溶膠顆粒型胱抑素c測定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒及其制備方法，特別是小粒徑的 勻相溶膠顆粒型胱抑素C免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
1983年Anastasi等首次在雞蛋清中分離純化得到高純度的半胱氨酸蛋白酶抑制 劑(cysteine proteinase inhibitor，CPI)，后被命名為胱抑素 C (CysC)。胱抑素 C 是一 種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，也被稱為Y-微量蛋白及Y-后球蛋白，屬非糖基化的堿性蛋白 質(zhì)，分子量約為13KD，幾乎所有的有核細(xì)胞均能產(chǎn)生，經(jīng)由腎小球濾過并幾乎全部被近曲小 管重吸收和分解，產(chǎn)生率多處在相對衡定狀態(tài)。胱抑素C是一種比較接近理想的反映腎小 球率過濾的內(nèi)源性標(biāo)志物，研究表明該物質(zhì)不受生理、性別、年齡、炎癥等因素影響，體內(nèi)含 量恒定，能早期敏感提示腎功能損害，是近幾年新發(fā)現(xiàn)用來診斷腎臟疾病的一個理想指標(biāo)。研究資料已表明，胱抑素C較血清BUN、Cr有更高的敏感性和特異性，對于評價腎 小球濾過率有非常重要的價值。目前對于胱抑素C的檢測方法比較常用的有顆粒增強(qiáng)免疫 比濁法和勻相溶膠顆粒型免疫測定法。由于顆粒增強(qiáng)免疫比濁法測定時間短，而且可以在 自動生化分析儀上進(jìn)行，所以成為胱抑素C檢測的常規(guī)應(yīng)用技術(shù)，但是上述方法反應(yīng)后會 產(chǎn)生沉淀，不利于生化儀的清洗。而后者不僅具有前者的那些優(yōu)點，也不會產(chǎn)生沉淀，所以 在胱抑素C的常規(guī)臨床應(yīng)用中可以優(yōu)先選擇勻相溶膠顆粒型免疫測定法。目前該技術(shù)已趨 于成熟，而且操作簡便，干擾因素少，對各種疾病的診斷及病情觀察具有重要的臨床意勻相溶膠顆粒型免疫測定法的基本原理是采用標(biāo)記了抗胱抑素C抗體的膠體 金，與待測標(biāo)本中的胱抑素C發(fā)生凝聚反應(yīng)使膠體金顏色發(fā)生變化，用540nm檢測這種變 化，以胱抑素C標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線測出樣本中目標(biāo)檢測物胱抑素C的濃度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是建立一種小粒徑勻相溶膠顆粒型胱抑素C檢測試劑盒，提 供一種特異性的高穩(wěn)定性的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，可以測定0. 027mg/L的胱抑 素C含量。另外，本發(fā)明的目的還在于提供使用本發(fā)明勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒測 定胱抑素C含量的方法。為了解決上述問題，本發(fā)明采用^-32nm膠體金顆粒標(biāo)記于抗胱抑素C抗體，通過 勻相溶膠顆粒免疫測定法檢測血清或血漿中胱抑素C含量。采用開瓶穩(wěn)定性實驗檢測了該 試劑盒與國際知名企業(yè)相關(guān)產(chǎn)品的的穩(wěn)定性差異。本發(fā)明提供以下的技術(shù)方案。1.根據(jù)權(quán)利要求1-3記載的一種小粒徑勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其用于 測定胱抑素C的含量，該試劑盒包含試劑Rl和試劑R2以及胱抑素C標(biāo)準(zhǔn)品，試劑Rl和試 劑R2的體積比為4 1，所述試劑Rl為含有多聚物的緩沖溶液，所述試劑R2為結(jié)合有抗人胱抑素C抗體的膠體金的緩沖溶液，其中膠體金顆粒的直徑為^-32nm。2.根據(jù)權(quán)利要求4-5記載的小粒徑勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其特征在 于，我們利用開瓶實驗檢測了本發(fā)明和某國際知名品牌試劑盒的穩(wěn)定性相比較為優(yōu)。我們使用本發(fā)明的方法靈敏度高，能夠檢測極低水平(約0. 027mg/L)的胱抑素C， 具有很高的臨床實用價值。另外，本發(fā)明的試劑盒為液體雙試劑，因此具有特異性好，靈敏 度高，準(zhǔn)確性好及抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點，可用于檢測血清或血漿中胱抑素C的濃度，適用于 臨床全自動生化分析儀。


圖1顯示6種不同含量的胱抑素C參考標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個點代表不同含量的 胱抑素C參考標(biāo)準(zhǔn)，其中，X軸表示胱抑素C的含量，y軸表示吸光度。圖2顯示本發(fā)明的試劑和對照試劑(某國際知名公司胱抑素C試劑盒)的相關(guān)性。 圖中的X、Y軸均為測定值(胱抑素C含量mg/L)。
具體實施例方式實施例1一種小粒徑勻相溶膠顆粒型胱抑素C測定試劑盒及其制備方法。1.本發(fā)明試劑Rl的配制按照常規(guī)方法進(jìn)行制備。2.本發(fā)明試劑R2的配制I.膠體金溶液的制備(1)用超純水配制氯金酸和10%檸檬酸三鈉；(2)超純水配制萬分之四氯金酸500ml (20ml 氯金酸加480ml超純水)；(3)加熱攪拌至微沸，快速加入與氯金酸質(zhì)量比為1. 2 1的檸檬酸三鈉(即細(xì)1 10%檸檬酸三鈉)；(5)加熱攪拌至顏色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱攪拌5-8min后停止；(6)用紫外分光光度計檢測500nm-560nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值分析出波 峰的位置，以此大致確定金顆粒的粒徑。II.抗體標(biāo)記(以標(biāo)記IOOml膠體金為例)(1) IOOml膠體金加IOml 0. IM ρΗ8· 4硼酸鹽緩沖液再加2mg lmg/ml CysC多抗， 混勻放置30min ；(2)加 IOml 10% BSA，混勻放置 30min ；(3) 1 IOOOrpm 離心 30min ；(4)去上清，用含 0. 4 % PEG8000 的 Tris 緩沖液(10mM/L，PH7. 5)重懸，離心 30min ；(5)同上重復(fù)洗滌兩次；(6)用上述緩沖液復(fù)溶至30ml。實施例2工作曲線測定本發(fā)明的用量本發(fā)明試劑Rl和本發(fā)明試劑R2用量分別為160ul和40ul，樣本用量為2ul。本發(fā)明采用終點法進(jìn)行測定160ul Rl加入2ul樣本，于37°C 5min后加入40ul 試劑R2，即開始讀點，反應(yīng)5min后再次讀點，得到吸光度差值。制作本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品(選擇6點校準(zhǔn)，校準(zhǔn)品胱抑素C含 量分別為0. 0,0. 5,1. 0,2. 0,4. 0,8. Omg/ml)，使用邁瑞B(yǎng)S300全自動生化儀，檢測主波長為 546nm,副波長為660nm ；按照上述測定步驟測得本發(fā)明胱抑素C標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)。圖1 中曲線上的每個點代表一個含量的標(biāo)準(zhǔn)品。其中X軸表示胱抑素C的含量，y軸表示吸光度。實施例3準(zhǔn)確性、精密度測定利用中國九強(qiáng)公司提供的質(zhì)控品，選取了兩個濃度(較低和較高濃度)，用本發(fā)明 的試劑盒進(jìn)行測定，結(jié)果如下表。表 權(quán)利要求
1.一種小粒徑勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其用于測定胱抑素C的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的小粒徑勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其特征在于，它是 基于免疫膠體金法定量檢測樣本中胱抑素C含量的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1記載的小粒徑勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其特征在于，其中 膠體金顆粒直徑為26-32nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1記載的小粒徑勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其特征在于，該試 劑盒性能比國際上知名的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒較優(yōu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4記載的小粒徑勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其特征在于，該試 劑盒的優(yōu)異性能包括但不限于試劑盒的穩(wěn)定性等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小粒徑勻相溶膠顆粒型胱抑素C免疫測定試劑盒及其制備方法。使用本發(fā)明的試劑盒能檢測血清或血漿中胱抑素C的含量。所述的勻相溶膠顆粒型胱抑素C免疫測定試劑盒，其膠體金顆粒直徑為26-32nm。本發(fā)明的試劑盒具有高靈敏度及高穩(wěn)定性的特點。
文檔編號G01N33/68GK102147413SQ201010583920
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者華權(quán)高, 周*, 沈鶴霄, 許可 申請人:武漢生之源生物科技有限公司