專利名稱：一種瘧疾免疫層析快速檢測試紙條及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種惡性瘧(P. f)和非惡性瘧 (P. V、P. O、P. m)快速聯(lián)測的免疫層析檢測試紙條及其制備方法。
背景技術：
瘧疾(Malaria)是一種嚴重危害人類健康的蟲媒傳染病，寄生于人體的瘧原蟲有 四種惡性瘧原蟲(Plasmodium falcipar μ m)、間日瘧原蟲(Plasmodi μ m vivax)、三日 瘧原蟲(Plasmodiym malariae)和卵形瘧原蟲(Plasmodiym ovale)。我國以前二種為 常見。血檢瘧原蟲迄今仍是確診瘧疾最可靠的方法，此法能鑒別蟲種和蟲期，但耗時、費力， 需要熟練的技術人員和一定的實驗室條件。對于瘧疾的實驗室診斷主要是依靠病毒分離培 養(yǎng)，蟲體形態(tài)學觀察、PCR和免疫學方法ELISA進行鑒定。雖然靈敏度高，但是需要時間長， 往往不便于現場檢測。因此，尋找快速、敏感、特異的瘧原蟲檢測方法是當今瘧疾防治工作 中迫切需要解決的問題之一。免疫層析技術在瘧疾診斷中的運用主要是檢測3種靶抗原富組氨酸蛋白 (HRP-II)、瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)和瘧原蟲谷氨酸脫氫酶(ρ⑶H)。(I)HRP-II是惡性瘧 原蟲消化血紅蛋白后形成的代謝產物，由血液期無性體和早期配子體合成，含有大量組氨 酸，具有種特異性，由于是水溶性抗原其可在瘧疾患者的血漿、尿、全血中檢測到，是診斷惡 性瘧的理想靶抗原。0)pLDH是瘧原蟲體內代謝酶，紅內期瘧原蟲無性期和配子體期均有 表達，其物理生化、免疫學特性、酶催化作用等與人體紅細胞和其他許多微生物的乳酸脫氫 酶(LDH)差異性大，瘧原蟲LDH具有種屬特異性，可以作為免疫診斷的靶抗原。研究表明， 只有活蟲體才可以產生LDH，血液pLDH水平與原蟲血癥平行，且LDH活性與活蟲密度消長 呈平行改變，因此通過檢測PLDH可監(jiān)測藥物療效以及復燃情況。瘧原蟲LDH，在瘧原蟲的 整個紅內期均表達，在瘧原蟲能量代謝中發(fā)揮重要作用。早期的研究揭示了在各種瘧原蟲 LDH之間不但具有共同抗原表位，還具有特異性抗原表位，因而能同時鑒別診斷惡性瘧和非 惡性；另外LDH僅由活體蟲產生，因此可用于鑒別瘧原蟲的死活，監(jiān)測治療效果和復燃的情 況，是理想的瘧疾免疫診斷試劑的靶抗原。目前，國際、國內在本技術領域的現有技術有利用雙抗體夾心法瘧疾(Malaria) 的膠體金快速診斷試劑，如艾康公司的惡性瘧\間日瘧免疫層析檢測試紙條，該試紙條 可以檢測惡性瘧及間日瘧，通過排除法檢測蟲種，但是不能鑒別混合感染和鑒別蟲期。 MALAR-check公司的瘧疾免疫試紙條基于免疫層析原理，利用雙抗體夾心法檢測血液標本 中惡性瘧原蟲在血液無性期和配子體早起分泌的富組氨酸蛋白。其檢測的敏感性和特異性 與PARASHGHT-F法相近。此檢測可提高常規(guī)鏡檢測診斷不能區(qū)別的混合感染的早起滋養(yǎng)體 期。另有現有技術中有產品采用檢測惡性瘧原蟲HRP-II的雙抗體夾心法，以重組的 惡性瘧原蟲HRP-II診斷抗原為靶點，制備相應的單克隆抗體檢測惡性瘧。其缺陷均是無法 進行惡性瘧和非惡性瘧的聯(lián)檢。目前以納米膠體金為標記物的免疫層析技術發(fā)展很成熟，但其在靈敏度和穩(wěn)定性方面比Elisa法或者PCR法有一定的差距，且膠體金標記制備工藝 復雜，成本較高。且由于膠體金只能顯示紅色，不能多樣式的顯示檢測結果，特別是對于多 項目聯(lián)檢的試紙條來說，不易區(qū)分檢測線和質控線，對于檢測結果容易造成判斷失誤。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種瘧疾免疫層析快速檢測試紙 條，該試紙條可以進行惡性瘧和非惡性虐的聯(lián)檢，具有快速、簡便、靈敏、操作方便的優(yōu)點。為實現上述目的，本發(fā)明采取了以下技術方案一種瘧疾免疫層析快速檢測試紙條，所述試紙條由樣品墊、標記墊、包被膜、吸水 紙順次搭接粘貼在底襯上構成，所述標記墊上涂覆有彩色膠乳顆粒標記的惡性瘧原蟲富組 氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體，包被膜包括檢測區(qū)和控 制區(qū)，所述檢測區(qū)包被與標記墊上的單克隆抗體處于不同表位的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白 II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體，所述控制區(qū)包被抗鼠IGg單克隆抗 體。優(yōu)選地，所述標記墊上惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體與彩色膠乳顆粒 的比例為1 5 1 30，所述非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比 例為1 5 1 30。優(yōu)選地，所述彩色膠乳顆粒標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非 惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的濃度均為5 15μ g/ml，涂敷在標記墊上的稀釋參數 為 20cm2/ml 30cm2/ml。優(yōu)選地，所述包被膜上惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和所述非惡性瘧 原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度均為1. 5mg/ml 2. Omg/ml ；所述抗 鼠IgG單克隆抗體在所述控制區(qū)的包被濃度為1. Omg/ml 2. Omg/ml。優(yōu)選地，所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃 度為1.7mg/ml ；所述非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度為 2. Omg/ml ；所述抗鼠IgG單克隆抗體在所述控制區(qū)的包被濃度為2. Omg/ml。優(yōu)選地，所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫 酶單克隆抗體在檢測區(qū)的包被用量均為0. ομ 1/mm 0. 25 μ 1/mm ；所述抗鼠IgG單克隆 抗體在控制區(qū)的包被用量為0. 10 μ 1/mm 0. 30 μ 1/mm。本發(fā)明還提供了上述瘧疾免疫層析快速檢測試紙條的制備方法，采取了以下技術 方案一種制備瘧疾免疫層析快速檢測試紙條的方法，包括以下步驟A.按常規(guī)方法純化惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克 隆抗體的生產菌株；B.篩選制備多株富組氨酸蛋白II和瘧原蟲乳酸脫氫酶的單克隆抗體；按常規(guī)方 法，經過篩選配對篩選合適的兩株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和兩株非惡性 瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體；所述兩株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和兩株 非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體分別處于不同的表位；C.彩色膠乳標記單克隆抗體
采用彩色膠乳標記一株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲 乳酸脫氫酶單克隆抗體；所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳 酸脫氫酶單克隆抗體的濃度均為5 15μ g/ml，按稀釋參數為20cm7ml 30Cm2/ml，將所 述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體噴點標 記墊上，然后將標記墊烘干，密封；D.將另一株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶 單克隆抗體均稀釋至1. 5mg/ml 2. Omg/ml，按0. 10μ 1/mm 0. 25 μ 1/mm的包被用量分別 包被至包被膜的檢測區(qū)的Tl線和T2線；將抗鼠IgG單克隆抗體稀釋至1. Omg/ml 2. Omg/ ml，按0. 10 μ 1/mm 0. 30 μ 1/mm的包被用量包被至包被膜的控制區(qū)；E.將樣品墊、標記墊、包被膜和吸水紙順次粘貼在底襯上，即得。優(yōu)選地，所述包被膜上Tl線和T2線之間的間距為3mm-5mm。彩色膠乳標記層析檢測技術是繼膠體金標記技術以后，在膠乳凝集試驗的基礎上 發(fā)展起來的，即用抗體致敏高分子膠乳，以直徑ι μ m左右或更大一些的球形膠乳顆粒作為 載體，將抗原或抗體結合在此載體上，即成為帶有免疫配基的微球。作為一種免疫學方法， 這種免疫微球兼有固相化試劑特有的優(yōu)點和免疫反應的高度專一性，具有快速、操作簡便、 試劑穩(wěn)定、可室溫儲運、不易污染的特點，在疾病診斷、免疫學測定、細胞的標記和識別以及 細胞的分離等領域中應用日益廣泛。相對于目前的膠體金產品，彩色膠乳的制備相對簡單， 膠乳載體與蛋白以共價形式結合，穩(wěn)定性好，靈敏度高，同時彩色膠乳色彩豐富，有利于OTC 產品多元分析、批間差小和標記方式多樣化。本發(fā)明采用了彩色膠乳免疫層析法和雙抗體夾心的原理，制備一種可以同時檢測 惡性瘧(P. f)和非惡性瘧(P.v、P.o、P.m)的試紙條。本發(fā)明中使用彩色膠乳標記的惡性瘧 原蟲富組氨酸蛋白II(HRP-II)單克隆抗體和非惡性瘧乳酸脫氫酶(pLDH)單克隆抗體，使 用雙抗體夾心的方法來檢測惡性瘧或非惡性瘧。彩色膠乳微球具有球徑可控、反應過程可 控以及靈敏性可控的優(yōu)點，可以進一步提高試紙條的靈敏度和測試的準確度，且顯示結果 可以多樣化顯示，更加醒目。與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明的試紙條結合多種指標聯(lián)合檢測，提高了在瘧疾篩查的準確性和便捷性， 避免漏檢，提高瘧疾和登革熱的預防能力，具有重大的經濟和社會效益；使用本發(fā)明試紙條操作簡便，無需技術熟練專業(yè)人員，具有快速、簡便、直觀以 及不需要特殊儀器的優(yōu)點，靈敏性和特異性分別為92. 56%和98. 57%，與鏡檢符合率為 96. 38%。


圖1是本發(fā)明的結構示意圖；附圖標記1、底襯；2、樣品墊；3、標記墊；4、包被膜；5、吸水紙；6、檢測區(qū)；7、控制區(qū)。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。
實施例1請參閱圖1，為本發(fā)明的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條的結構示意圖。本發(fā)明提 供的一種惡性瘧和非惡性瘧快速檢測試紙條，包括底襯1、樣品墊2、標記墊3、包被膜4以 及吸水紙5。標記墊3上涂覆有彩色膠乳標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II(HRP-II)單 克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(PLDH)單克隆抗體，包被膜4由檢測區(qū)6和控制區(qū)7 組成，檢測區(qū)6包括有檢測線Tl和檢測線T2，其中Tl處包被與彩色膠乳標記的惡性瘧原 蟲富組氨酸蛋白II(HRP-II)單克隆抗體處于不同表位的另一株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白 II(HRP-II)單克隆抗體；T2處包被有與彩色膠乳標記的非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH) 單克隆抗體處于不同表位的另一株非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(PLDH)單克隆抗體，控制區(qū) 7C線包被抗鼠IGg單克隆抗體。在該實施例中，所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體與彩色膠乳顆粒 的比例為1 10，所述非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為 1 10，彩色膠乳顆粒標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸 脫氫酶單克隆抗體的濃度均為5μ g/ml，涂敷在標記墊上的稀釋參數為20cm2/ml。所述惡 性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度和所述非惡性瘧原蟲乳酸 脫氫酶單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度均為1. 5mg/ml ；所述抗鼠IgG單克隆抗體在所 述控制區(qū)的包被濃度為1.0mg/ml。所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性 瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在檢測區(qū)的包被用量為0. ΙΟμΙ/mm ；所述抗鼠IgG單克隆抗 體在控制區(qū)的包被用量為0. 10μ 1/mm。該實施例的制備方法為A.按常規(guī)方法純化惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克 隆抗體的生產菌株；B.使用免疫原蛋白免疫小鼠，提取含單抗的小鼠腹水，采用飽和硫酸銨法純化，獲 取多株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的單克隆抗體；與相應的 抗原反應，比對反應效果，篩選效果較好的兩株，一株作為標記單抗，一株作為包被單抗；C.彩色膠乳標記單克隆抗體分別使用不同顏色的400nm直徑的聚苯乙烯膠體大分子復合物作為彩色膠乳標 記惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體；惡性 瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的濃度均為 5μ g/ml，按稀釋參數為20cm2/ml，用點膠乳機將惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體 和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體噴點標記墊3上，然后將標記墊3置于37°C下烘干 2-3小時，密封并置于室溫；D.采用濃度為0. 05M碳酸鹽緩沖液(CBS，pH9. 6)作為包被稀釋液，將惡性瘧原蟲 富組氨酸蛋白II單克隆抗體(4. Omg/ml)和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體(4. Omg/ ml)均稀釋至1. 5mg/ml，按0. 10 μ 1/mm的包被用量分別包被至包被膜4的檢測區(qū)的Tl線 和T2線；將抗鼠IgG單克隆抗體(5. 62mg/ml)稀釋至1. Omg/ml，按0. 10 μ 1/mm的包被用 量包被至包被膜4的控制區(qū)；Tl和T2線之間的間距為4. 7mm。包被膜4噴膜后將其放置在 干燥房(20°C 45°C，濕度10% -30% )，時間為12_24h。Ε.將樣品墊2、標記墊3、包被膜4和吸水紙5順次粘貼在底襯1上，即得。
當用本發(fā)明的試紙條來檢測樣本時，(1)如果試紙條上的兩條檢測線Tl和T2分 別形成一條顏色反應線，表明樣本為惡性瘧原蟲和非惡性瘧原蟲混合感染；(2)如果試紙 條上的檢測線Tl形成一條顏色反應線，T2無顏色反應線出現時，表明樣本為惡性瘧原蟲陽 性；(3)當檢測區(qū)T2形成一條顏色反應線，Tl無顏色反應線出現時，此時為非惡性瘧原感 染(間日瘧、卵形瘧或三日瘧)陽性，表明樣本中含有非惡性瘧間日瘧、卵形瘧或三日瘧特 異性抗原(非惡性瘧原蟲特異性抗原)；(4)如檢測區(qū)內沒有條帶出現，則是陰性結果，表明 樣本中不含有瘧原蟲抗原。無論樣本中是否存在于瘧原蟲抗原，一條顏色條帶都會出現在 質控區(qū)C。當C線不出現顏色條帶時，檢測結果無效。使用實施例1的試紙條操作簡便，具有快速、簡便、直觀以及不需要特殊儀器的優(yōu) 點，敏感性(陽性相符率)和特異性(陰性符合率)分別為92. 56%和98. 57%，與鏡檢符 合率為96. 38%。實施例2該實施例中的檢測試紙條結構均與實施例1相同。在該實施例中，在該實施例中，所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體與彩 色膠乳顆粒的比例為1 15，所述非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體與彩色膠乳顆粒的 比例為1 15，彩色膠乳顆粒標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原 蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的濃度均為10 μ g/ml，涂敷在標記墊上的稀釋參數為^cm2/ml。 所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度為1. 7mg/ml ；所述 非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度為2. Omg/ml ；所述抗鼠IgG 單克隆抗體在所述控制區(qū)的包被濃度為2. Omg/ml。所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克 隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在檢測區(qū)的包被用量為0. 15μ 1/mm ；所述 抗鼠IgG單克隆抗體在控制區(qū)的包被用量為0. 20 μ 1/mm。該實施例的制備方法與使用方法均與實施例1相同。使用實施例1的試紙條操作簡便，具有快速、簡便、直觀以及不需要特殊儀器的優(yōu) 點，敏感性(陽性相符率)和特異性(陰性相符率)分別為90. 36%和98. 27%，與鏡檢符 合率為96. 26%o實施例3該實施例中的檢測試紙條結構均與實施例1相同。在該實施例中，在該實施例中，所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體與彩 色膠乳顆粒的比例為1 20，所述非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體與彩色膠乳顆粒的 比例為1 20，彩色膠乳顆粒標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原 蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的濃度均為15 μ g/ml，涂敷在標記墊上的稀釋參數為25cm2/ml。 所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度和所述非惡性瘧原 蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度均為2. Omg/ml ；所述抗鼠IgG單克隆抗 體在所述控制區(qū)的包被濃度為1.5mg/ml。所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和 非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在檢測區(qū)的包被用量為0. 25 μ 1/mm ；所述抗鼠IgG單 克隆抗體在控制區(qū)的包被用量為0.觀μ 1/mm。該實施例的制備方法與使用方法均與實施例1相同。使用實施例1的試紙條操作簡便，具有快速、簡便、直觀以及不需要特殊儀器的優(yōu)點，敏感性(陽性相符率)和特異性(陰性相符率)分別為91. 38%和97. 45%，與鏡檢符 合率為96. 11%。
權利要求
1.一種瘧疾免疫層析快速檢測試紙條，所述試紙條由樣品墊O)、標記墊(3)、包被膜 G)、吸水紙( 順次搭接粘貼在底襯(1)上構成，其特征在于，所述標記墊C3)上涂覆有彩 色膠乳顆粒標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白Π單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單 克隆抗體，所述包被膜⑷包括檢測區(qū)(6)和控制區(qū)(7)，所述檢測區(qū)(6)包被與標記墊(3) 上的單克隆抗體處于不同表位的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲 乳酸脫氫酶單克隆抗體，所述控制區(qū)(7)包被抗鼠IGg單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于，所述標記墊上 惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為1 5 1 30，所述非 惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為1 5 1 30。
3.根據權利要求1所述的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于，所述彩色膠乳 顆粒標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗 體的濃度均為5 15 μ g/ml，涂敷在標記墊上的稀釋參數為20cm2/ml 30cm2/ml。
4.根據權利要求1所述的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于，所述包被膜上 惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和所述非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在所 述檢測區(qū)的包被濃度均為1. 5mg/ml 2. Omg/ml ；所述抗鼠IgG單克隆抗體在所述控制區(qū) 的包被濃度為1. Omg/ml 2. Omg/ml。
5.根據權利要求4所述的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于，所述惡性瘧原 蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度為1. 7mg/ml ；所述非惡性瘧原蟲 乳酸脫氫酶單克隆抗體在所述檢測區(qū)的包被濃度為2. Omg/ml ；所述抗鼠IgG單克隆抗體在 所述控制區(qū)的包被濃度為2. Omg/ml。
6.根據權利要求1所述的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于，所述惡性瘧原 蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體在檢測區(qū)的包被 用量均為0. ομ 1/mm 0. 25μ 1/mm;所述抗鼠IgG單克隆抗體在控制區(qū)的包被用量為 0. 10 μ 1/mm 0· 30 μ 1/mm。
7.一種制備權利要求1所述的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條的方法，其特征在于，包 括以下步驟A.按常規(guī)方法純化惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗 體的生產菌株；B.篩選制備多株富組氨酸蛋白II和瘧原蟲乳酸脫氫酶的單克隆抗體；按常規(guī)方法，經 過篩選配對篩選合適的兩株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和兩株非惡性瘧原蟲 乳酸脫氫酶單克隆抗體；所述兩株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和兩株非惡性 瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體均分別是相同抗原處于不同的表位單抗；C.彩色膠乳標記單克隆抗體采用彩色膠乳標記一株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸 脫氫酶單克隆抗體；所述惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫 氫酶單克隆抗體的濃度均為5 15μ g/ml，按稀釋參數為20cm7ml 30Cm2/ml，將所述惡 性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體噴點標記墊 (3)上，然后將標記墊C3)烘干，密封；D.將另一株惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體均稀釋至1. 5mg/ml 2. Omg/ml，按0. 10μ 1/mm 0. 25 μ 1/mm的包被用量分別包被 至包被膜(4)的檢測區(qū)的Tl線和T2線；將抗鼠IgG單克隆抗體稀釋至1. Omg/ml 2. Omg/ ml，按0. 10 μ 1/mm 0. 30 μ 1/mm的包被用量包被至包被膜⑷的控制區(qū)；E.將樣品墊O)、標記墊(3)、包被膜(4)和吸水紙(5)順次粘貼在底襯⑴上，即得。
8.根據權利要求7所述的瘧疾免疫層析快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所 述包被膜上Tl線和T2線之間的間距為3mm-5mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種瘧疾免疫層析快速檢測試紙條及制備方法，所述試紙條由樣品墊、標記墊、包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底襯上構成，標記墊上涂覆有彩色膠乳顆粒標記的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體，包被膜包括檢測區(qū)和控制區(qū)，所述檢測區(qū)包被與標記墊上的單克隆抗體處于不同表位的惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II單克隆抗體和非惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體，所述控制區(qū)包被抗鼠IGg單克隆抗體。本發(fā)明的試紙條提高了在瘧疾篩查的準確性和便捷性；操作簡便，具有快速、簡便、直觀的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/573GK102087294SQ201010620089
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權日2010年12月31日
發(fā)明者李國存, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術有限公司