專利名稱：：抗福美雙單克隆抗體和快速檢測福美雙的試紙及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)藥檢測領(lǐng)域，利用免疫化學(xué)技術(shù)快速檢測殘留的農(nóng)藥，具體地，本發(fā)明涉及一種雜交瘤細(xì)胞株，以及所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗福美雙單克隆抗體。本發(fā)明還涉及一種檢測福美雙的組合物、一種檢測福美雙的試紙、所述試紙的制備方法、一種檢測福美雙的酶聯(lián)免疫試劑、以及所述抗福美雙單克隆抗體在檢測福美雙中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：福美雙(Thiram)，CAS登記號為137_26_8化學(xué)名稱為四甲基秋蘭姆二硫化物，屬硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥，是一種具有保護(hù)作用的殺菌劑，其抗菌譜廣，可處理種子和土壤，防治禾谷類黑穗病和多種作物的苗期立枯病，噴灑后可防治一些果樹，蔬菜病害。目前對食品中福美雙殘留常用的檢測方法主要為色譜分析方法，如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、以及色質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS-MS和GC-MS)。色譜技術(shù)對福美雙檢測是非常有效、準(zhǔn)確和靈敏的，但也存在如下缺點(1)樣品預(yù)處理需要衍生化，程序繁瑣費時；(2)需要專業(yè)的技術(shù)人員操作，操作人員要有豐富的相關(guān)經(jīng)驗，必須了解影響色譜分析的各種干擾因素，了解所使用的預(yù)處理方法的優(yōu)缺點，才能獲得可靠的分析結(jié)果；(3)需要昂貴的儀器設(shè)備輔助，難以在中小城市以及中小企業(yè)中普及；(4)儀器維護(hù)和保養(yǎng)的技術(shù)要求高。保養(yǎng)是否得當(dāng)，會直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；(5)檢測費用高。本發(fā)明制備了抗福美雙單克隆抗體，并應(yīng)用該抗體制備一種特異性強、靈敏度高、操作簡便、能夠快速準(zhǔn)確地檢測福美雙的試紙，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個方面涉及一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為CGMCCNo.3580，保藏日期2010年1月13日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，該雜交瘤細(xì)胞株建議的分類命名為BALA/C小鼠抗-福美雙單克隆抗體骨髓瘤雜交細(xì)胞。本發(fā)明的另一個方面涉及一種抗福美雙單克隆抗體，其由保藏編號為CGMCCNo.3580的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。該抗福美雙單克隆抗體具有很好的特異性。本發(fā)明的還一個方面涉及一種檢測福美雙的組合物，其中含有上述的抗福美雙單克隆抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種檢測福美雙的試紙，其含有有效量的上述的抗福美雙單克隆抗體。所述抗體可以以多種方式標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記。優(yōu)選地，所述抗福美雙單克隆抗體用膠體金標(biāo)記。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述試紙具有福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線，優(yōu)選地，所述試紙還具有抗鼠IgG抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。在本發(fā)明中，所述檢測線為福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物形成的條帶，所述質(zhì)控線為抗鼠IgG包被形成的條帶，這兩個條帶的寬度并不特別限定。檢測線和質(zhì)控線的距離并不特別限定，優(yōu)選5-8mm。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述試紙包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、蛋白結(jié)合膜(3)、吸水墊(4)和背襯(7)，并且所述樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、蛋白結(jié)合膜(3)、吸水墊(4)沿水平方向依次粘附在背襯(7)上(如圖2所示)；其特征在于，所述結(jié)合墊(2)上包被有上述的抗福美雙單克隆抗體，所述抗福美雙單克隆抗體用膠體金標(biāo)記；所述蛋白結(jié)合膜(3)上分別包被有福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線(5)和抗鼠IgG抗體構(gòu)成的質(zhì)控線(6)。優(yōu)選地，所述檢測線(5)與質(zhì)控線(6)的間距為5-8mm。在本發(fā)明中，所述蛋白結(jié)合膜的作用為結(jié)合包被的蛋白(例如，福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物或者抗體)，然后包被的蛋白與待檢測物質(zhì)反應(yīng)，因此可以選用具有該作用的任何材料，包括但不限于硝酸纖維素膜、PVDF膜等。優(yōu)選地，蛋白結(jié)合膜為硝酸纖維素膜。在本發(fā)明中，所述載體蛋白為能夠與福美雙偶聯(lián)的任何蛋白，包括但是不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白。優(yōu)選地，載體蛋白為牛血清白蛋白。在本發(fā)明中，所述背襯可以選用多種起支持作用的材料，例如，其可以是PVC背襯。本發(fā)明選用福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物作為檢測線，抗福美雙特異性單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用競爭法來檢測待測樣品中是否含有福美雙，通過待測樣品中的福美雙與包被于蛋白結(jié)合膜上的福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物共同競爭抗福美雙單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，由于膠體金顆粒的不同程度的堆積，在檢測線處出現(xiàn)顏色深淺不同的紅色條帶或不出現(xiàn)條帶，質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶。若待測樣品試紙檢測不出現(xiàn)條帶，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測樣品中福美雙的濃度高于500ppb；若待測樣品試紙檢測出現(xiàn)了紅色條帶，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷待測樣品中福美雙的濃度低于500ppb；如果質(zhì)控線上沒有出現(xiàn)紅色條帶，則該試紙無效(如圖3所示)。本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖如圖1所示。上述試紙的制備方法，包括如下步驟1)將福美雙與載體蛋白偶聯(lián)，形成福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物；2)用福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物作為抗原制備上述的抗福美雙單克隆抗體；3)制備抗鼠IgG抗體；4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；5)將步驟2)中制備的抗福美雙單克隆抗體加入步驟4)制備的膠體金中，得到抗福美雙單克隆抗體_膠體金標(biāo)記物；6)將抗福美雙單克隆抗體_膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合墊(2)上；7)將福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物包被在蛋白結(jié)合膜(3)上構(gòu)成檢測線(5)；并將抗鼠IgG包被在蛋白結(jié)合膜(3)上構(gòu)成質(zhì)控線(6)；8)在所述的PVC背襯(7)上沿水平方向依次粘附樣品墊⑴、結(jié)合墊(2)、蛋白結(jié)合膜(3)、吸水墊(4)。在本發(fā)明中，所述蛋白結(jié)合膜的作用為結(jié)合包被的蛋白(例如，福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物或者抗體)，然后讓包被的蛋白與待檢測物質(zhì)反應(yīng)，因此可以選用具有該作用的任何材料，包括但不限于硝酸纖維素膜、PVDF膜等。優(yōu)選地，蛋白結(jié)合膜為硝酸纖維素膜。在本發(fā)明中，所述載體蛋白為能夠與福美雙偶聯(lián)的任何蛋白，包括但是不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白。優(yōu)選地，載體蛋白為牛血清白蛋白。在本發(fā)明中，所述背襯可以選用多種起支持作用的材料，例如，其可以是PVC背襯。在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟3)中的所述抗鼠IgG抗體為兔抗鼠IgG抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種檢測福美雙的酶聯(lián)免疫試劑，其本發(fā)明的抗福美雙單克隆抗體作為第一抗體。本發(fā)明的還一方面涉及抗福美雙單克隆抗體在檢測福美雙中的應(yīng)用。本發(fā)明的還一方面涉及抗福美雙單克隆抗體在檢測蔬菜或水果中的福美雙中的應(yīng)用。發(fā)明的有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點1.本發(fā)明的抗福美雙單克隆抗體具有很好的特異性和靈敏度。2.本發(fā)明的檢測福美雙的免疫膠體金試紙，特異性強，靈敏度高，特別是檢測時間短，大約為20分鐘，而現(xiàn)有色譜檢測至少需要2個小時以上。3.本發(fā)明的檢測試紙不需要任何特殊儀器、設(shè)備，檢測成本低。4.本發(fā)明的檢測試紙操作簡便，不需由專業(yè)人員進(jìn)行操作。5.本發(fā)明的檢測試紙儲存方便、穩(wěn)定，對溫度要求不高，在4_8°C下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個月。圖1本發(fā)明技術(shù)路線圖。圖2本發(fā)明的檢測試紙的示意圖。其中1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為蛋白結(jié)合膜，4為吸收墊，5為檢測線，6為質(zhì)控線，7為背襯。圖3本發(fā)明檢測試紙結(jié)果判定的示意圖。A為陰性結(jié)果，上方的線為質(zhì)控線，下方的線為檢測線，兩條線均出現(xiàn)紅色條帶；B為陽性結(jié)果，只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶；C、D均為試紙失效，質(zhì)控線均未出現(xiàn)紅色條帶。具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1檢測福美雙的免疫膠體金試紙的制備1、福美雙_載體蛋白偶聯(lián)物的制備1)稱取40mg福美雙溶于含有0.02%Tween-20的20mMPBS溶液中，配制成福美雙溶液。2)冰水浴且磁力攪拌下，將福美雙溶液逐滴加到2.4mlImol/lHCl中，進(jìn)行重氮化(ItaruY,KohjiI.Enzymeimmunoassayforclenbuteol,an^2-adrnergicstimulant[J].Journalofimmunoassay,1982,3(2):155-171)反應(yīng)，力口完后繼續(xù)反應(yīng)5min。3)磁力攪拌下，將重氮化產(chǎn)物分別逐滴加到人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(0VA)溶液中，用llmol/lNaOH調(diào)PH值到9.5，4°C緩慢攪拌過夜，得到三種連接產(chǎn)物，即福美雙-HSA、福美雙-BSA、福美雙-0VA。4)將步驟3)得到的連接產(chǎn)物福美雙-HSA、福美雙-BSA、福美雙-0VA分貝裝入透析袋，用0.01MPH7.4的磷酸鹽緩沖液(配方:NaCl8g，KC10.2g，Na2HP0412H202.9g，KH2P040.2g，用蒸餾水定溶至1000ml)透析3天，去除游離的福美雙小分子后，_20°C保存?zhèn)溆谩?、抗福美雙單克隆抗體的制備利用本發(fā)明人所制備的福美雙-人血清白蛋白(HSA)偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠，免疫程序是取含福美雙-人血清白蛋白(HSA)偶聯(lián)物100yg的溶液與等體積的弗氏完全佐劑(購自Sigma公司)乳化，注射小鼠腹腔，以后每間隔十天加強一次，換用弗氏不完全佐劑乳化(購自Sigma公司)。最后于融合前三天，(最好與上次免疫相隔4周以上)，腹腔強化免疫，抗原量加倍(200i!g)，不加佐劑。融合時，取經(jīng)最后強化免疫的Balb/C小鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%酒精中浸泡5min消毒。無菌取出小鼠脾臟，分離出脾細(xì)胞。將分離的脾細(xì)胞與新鮮制備的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按1-2X107個SP2/0與108個免疫細(xì)胞(110-115)的比例于50ml離心管中混勻，1500rpm，離心lOmin。倒凈上清(可用滅菌的濾紙吸干)，輕輕敲擊管底，使細(xì)胞沉淀略加松動。將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37°C水浴中。然后在lmin內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37°C的50%聚乙二醇(PEG)0.8ml(購自Sigma公司)，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，繼續(xù)攪拌lmin。然后慢慢加入37°C預(yù)溫的1640(購自Sigma公司商品)基礎(chǔ)液(配方164010.4g，NaHC032g，用蒸餾水定容至1000ml，調(diào)PH至7.2)10ml。具體方法為第一分鐘逐滴滴入lml。第二分鐘加lml，第3-4分鐘加3ml，第5分鐘加其余的5ml，每次加時需緩慢加入，并不但輕輕的攪拌。最后加入30ml1640液，也需慢慢加入。800rpm離心5min，去上清，于37°C放置5-8min。用HAT(購自Sigma公司商品，其成分為100%含量)培養(yǎng)基懸浮，同時也用HAT培養(yǎng)基懸浮制備好的飼養(yǎng)脾細(xì)胞并與融合后的細(xì)胞混合，根據(jù)需要補加適量的HAT培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的成份80ml1640基礎(chǔ)液，20ml滅菌小牛血清，lml100%的HAT，lml雙抗)，分種于96孔培養(yǎng)版中，約250u1/孔。一次融合可接種4-8塊96孔板。根據(jù)需要也可少種，一般按SP2/0的細(xì)胞數(shù)計算，每孔接種量約含104左右個SP2/0細(xì)胞。于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后第二天開始觀察有無污染，于第4天補加1滴HAT培養(yǎng)基，第8_10天吸去100iil培養(yǎng)基換HT(購自Sigma公司)培養(yǎng)基100yl。待融合細(xì)胞集落長至培養(yǎng)孔1/4，培養(yǎng)基略變黃時，進(jìn)行抗體檢測。采用福美雙-卵清蛋白(0VA)作為篩選抗原，利用ELISA方法篩選出分泌抗福美7雙的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法(參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版)進(jìn)行克隆、篩選。經(jīng)過3-4次克隆，最終篩選出分泌抗福美雙的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株于2010年01月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCCNo.3580。此外，對該細(xì)胞株進(jìn)行了染色體計數(shù)，結(jié)果顯示，SP2/0的染色體的平均數(shù)為70，脾細(xì)胞染色體為40條，而雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目在80-94之間。均高于兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)目，說明融合細(xì)胞的確是SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交產(chǎn)物，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目明顯多于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的染色體。將該細(xì)胞株注射Balb/C小鼠腹腔，生產(chǎn)單克隆抗體。3、抗福美雙單克隆抗體的純化參照朱立平等，《免疫學(xué)常用實驗方法》，人民軍醫(yī)出版社2000版教導(dǎo)的方法取所得的小鼠腹水5ml與適量的二氧化硅混合，加入等體積的巴比緩沖液(配方氯化鈉85.00g,巴比妥鈉3.75g，疊氮鈉2.00g，用蒸餾水定容至2000ml)，室溫振蕩1H后，室溫靜置30min，取上清與潔凈離心管中，4°C，3000rpm離心lOmin；取上清液8ml，加入16ml0.06mol醋酸鈉緩沖液，用HCL調(diào)PH至4.5，充分?jǐn)嚢柘戮従徏尤胄了?32yl后，室溫攪拌30min，然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱充分沉淀2h，4°C，15000rpm離心30min，得上清液22ml，加入2.2mlPH7.2,0.lm的磷酸緩沖液(PB)，用NaOH調(diào)PH值至7.6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為0.277g/ml，4°C，12000rpm離心30min，棄上清，沉淀用5mlMpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，裝入透析袋，對5000ml0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液充分透析后，再對2000ml蒸餾水透析，最后對3000ml三蒸去離子水透析，將充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇-20000(PEG-20000)濃縮至3ml，然后4°C，12000rpm離心30min，棄沉淀，收集上清液，測得蛋白濃度為1.6mg/ml。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠變性電泳(SDS-PAGE)鑒定為純化的單克隆抗體，純度大于95%。該單克隆抗體可用于制備免疫膠體金。4、兔抗鼠IgG抗體的制備利用本發(fā)明人所在微生物與免疫實驗室提取的Balb/C小鼠IgG免疫健康家兔，制備高特異性，高效價的兔抗鼠IgG高免血清，對高免血清采用飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗提，經(jīng)DEAE過柱后得到高純度的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體作為質(zhì)控線。5、抗福美雙單克隆抗體_膠體金標(biāo)記物的制備(1)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入2ml1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈橙紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。(2)抗福美雙單克隆抗體_膠體金標(biāo)記物的制備磁力攪拌下，用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的PH值至8.2，按1-2iig抗體/ml膠體金加入抗福美雙單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10%BSA至終濃度為1%，靜置30min。12000rp、4°C離心30min，棄上清，沉淀用0.02mPH9.0的硼酸鹽緩沖液(配方硼酸0.1237g,PEG-20000lg，用三餾水定容至1000ml，調(diào)PH至9.0)洗滌兩次，用二十分之一初始膠體金體積的0.02MPH9.0的硼酸鹽緩沖液(配方硼酸0.1237g，PEG-20000lg，用三餾水定容至1000ml，調(diào)PH至9.0)將沉淀重懸，置4°C備用，有效期60天。6、結(jié)合墊的包被將重懸的抗福美雙單克隆抗體-膠體金重懸液采用0.01MPH7.4磷酸緩沖液(配方及制備:BSA20g，蔗糖25g,pvpk-303g,NaN30.2gNaCl8g,KC10.2g,Na2HP0412H202.9g，KH2P040.2g，用蒸餾水定容至1000ml)進(jìn)行稀釋獲得抗福美雙單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，均勻滴加于結(jié)合墊上，每100平方厘米結(jié)合墊滴加20ml抗福美雙單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物稀釋液，真空干燥，真空封裝，置4°C備用。7、樣品墊的處理將樣品墊浸泡于0.01MPH7.4磷酸鹽緩沖液(配方及制備BSA20g，蔗糖25g，pvpk-303g,NaN30.2g,NaCl8g,KC10.2g,Na2HP0412H202.9g,KH2P040.2g，用蒸餾水定容至1000ml)中30min后，于37°C烘干，真空封裝，置4°C備用。8、蛋白結(jié)合膜的包被用0.01MPH7.4PBS緩沖液(含3%的甲醇)將福美雙-牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物稀釋到65yg/ml，用Biodot點膜儀將其包被于蛋白結(jié)合膜作為檢測線，包被量為0.6u1/cm,質(zhì)控線靠近吸水墊，距吸收墊約8mm，兩線距離5_8mm。37°C烘干，封裝備用。9、試紙的組裝將樣品墊⑴、結(jié)合墊⑵、蛋白結(jié)合膜(3)、吸水墊⑷按圖2所示的順序依次粘附在PVC背襯(7)上，切成3mm寬的小條，真空封裝。4_8°C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個月。所述樣品墊、結(jié)合墊、蛋白結(jié)合膜、吸水墊、PVC背襯均購自Millipore公司。實施例2抗福美雙單克隆抗體的靈敏度和特異性的檢測在微孔板上包被福美雙-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，包被量為10ng/孔；用所述抗福美雙單克隆抗體與HRP酶進(jìn)行標(biāo)記獲得抗福美雙單克隆抗體酶標(biāo)試劑，11000使用；采用PBST(0.5%Tween-20,0.02MpH7.4的磷酸鹽緩沖液)作為洗液；顯色采用TMB顯色系統(tǒng)；顯色終止采用0.2M濃硫酸。以此作為福美雙檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，結(jié)果采用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取。選擇緩沖液(0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液，配方NaCl8g，KC10.2g，Na2HP0412H202.9g，KH2P040.2g，用蒸餾水定容至1000ml)，在其中加入不同含量的福美雙以及濃度為3000ppb福美鋅、福美鐵、福美甲胂、丙森鋅、代森銨、代森錳鋅、二硫氰基甲烷、百菌清、撲海因、乙蒜素，制備不同類型樣本。采用應(yīng)用本發(fā)明的抗福美雙單克隆抗體的酶聯(lián)免疫試劑進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。檢測結(jié)果顯示本發(fā)明的抗福美雙單克隆抗體具有優(yōu)秀的靈敏度以及極佳的特異性。表1應(yīng)用本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行的檢測(波長450nm)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3免疫膠體金試紙的特異性和靈敏度檢測1、特異性檢測將福美鋅、福美鐵、福美甲胂、丙森鋅、代森銨、代森錳鋅、二硫氰基甲烷、百菌清、撲海因、乙蒜素配制成濃度為3000ppb的樣品。直接吸取80yl加入本發(fā)明的檢測福美雙的免疫膠體金試紙。試驗結(jié)果(見表2)表明，檢測福美鋅、福美鐵、福美甲胂、丙森鋅、代森銨、代森錳鋅、二硫氰基甲烷、百菌清、撲海因、乙蒜素樣品時，試紙檢測線出現(xiàn)紅色條帶，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，這表明福美鋅、福美鐵、福美甲胂、丙森鋅、代森銨、代森錳鋅、二硫氰基甲烷、百菌清、撲海因、乙蒜素與本發(fā)明試紙無交叉反應(yīng)，顯示本發(fā)明試紙具有好的特異性。表2本發(fā)明試紙?zhí)禺愋詸z測的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注“+”表示陽性，“_”表示陰性。2、靈敏度試驗用本發(fā)明檢測試紙分別檢測濃度為0、5、50、500、1000、3000ppb福美雙標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)8次，檢測具有可重復(fù)性，結(jié)果見表3?？梢姳景l(fā)明的檢測試紙靈敏度可以達(dá)到500ppb，完全能夠滿足需要。表3本發(fā)明試紙靈敏度(敏感性)試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注‘‘+，，表示陽性，‘‘_，，表示陰性。實施例4使用免疫膠體金試紙檢測蔬菜中的福美雙1、樣品的預(yù)處理取5.Og搗碎的試樣于50mL離心試管中，加入IOmL丙酮0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(14)和0.50g石墨化炭黑(GCB)，振蕩提取5-10min,以3000r/min的離心15min，取上清液，作為測試樣液。2、檢測0.01ΜρΗ7·4的磷酸鹽緩沖液(配方=NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H202.9g，KH2PO40.2g，用蒸餾水定容至1000ml)及待檢樣品各取80μ1加入膠體金試紙上，20分鐘后觀察結(jié)果。3、結(jié)果判定如圖3所示，若待測樣品試紙檢測線不出現(xiàn)條帶，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性結(jié)果，即待測樣品中福美雙的濃度高于500ppb(圖3Β)；若待測樣品試紙檢測線出現(xiàn)了紅色條帶，同時質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陰性結(jié)果(圖3A)，即待測樣品中福美雙的濃度低于500ppb；如果質(zhì)控線上沒有出現(xiàn)紅色條帶，則該試紙無效(圖3C、圖3D)。實施例5番茄樣品中添加福美雙的模擬檢測試驗分別向番茄樣品中添加福美雙標(biāo)準(zhǔn)溶液，使番茄樣品中福美雙濃度分別為Oppb，IOOOppb0按實施例4所述方法，用本發(fā)明檢測試紙分別對Oppb和IOOOppb福美雙番茄樣品進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，結(jié)果顯示，Oppb樣品檢測線出現(xiàn)紅色條帶，判讀為陰性樣品；而IOOOppb樣品檢測線未出現(xiàn)紅色條帶，判為陽性樣品。說明本發(fā)明檢測試紙可以用來檢測蔬菜(例如番茄)中的福美雙殘留。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。權(quán)利要求一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為CGMCCNo.3580，保藏日期2010年01月13日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2.一種抗福美雙單克隆抗體，其由權(quán)利要求1的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。3.—種檢測福美雙的組合物，其含有權(quán)利要求2所述的抗福美雙單克隆抗體。4.一種檢測福美雙的試紙，其含有有效量的權(quán)利要求2所述的抗福美雙單克隆抗體，優(yōu)選地，所述抗福美雙單克隆抗體用膠體金標(biāo)記。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙，其具有福美雙_載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線，優(yōu)選地，其還具有抗鼠IgG抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試紙，包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、蛋白結(jié)合膜(3)、吸水墊⑷和背襯(7)，并且所述樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、蛋白結(jié)合膜(3)、吸水墊(4)沿水平方向依次粘附在背襯(7)上；其特征在于，所述結(jié)合墊(2)上包被有權(quán)利要求2所述的抗福美雙單克隆抗體，所述抗福美雙單克隆抗體用膠體金標(biāo)記；所述蛋白結(jié)合膜(3)上分別包被有福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測線(5)和抗鼠IgG抗體構(gòu)成的質(zhì)控線(6)，所述檢測線(5)與質(zhì)控線(6)的間距為5-8mm。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試紙，其中，所述蛋白結(jié)合膜選自硝酸纖維素膜或PVDF膜，并且優(yōu)選硝酸纖維素膜；優(yōu)選地，所述背襯為PVC背襯。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試紙，所述載體蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白，并且優(yōu)選牛血清白蛋白。9.權(quán)利要求6所述的試紙的制備方法，包括如下步驟1)將福美雙與載體蛋白偶聯(lián)，形成福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物；2)用福美雙_載體蛋白偶聯(lián)物作為抗原制備權(quán)利要求2所述的抗福美雙單克隆抗體；3)制備抗鼠IgG抗體；4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；5)將步驟2)中制備的抗福美雙單克隆抗體加入步驟4)制備的膠體金中，得到抗福美雙單克隆抗體_膠體金標(biāo)記物；6)將抗福美雙單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合墊(2)上；7)將福美雙-載體蛋白偶聯(lián)物包被在蛋白結(jié)合膜(3)上構(gòu)成檢測線(5)；并將抗鼠IgG包被在蛋白結(jié)合膜(3)上構(gòu)成質(zhì)控線(6)；8)在所述的背襯(7)上沿水平方向依次粘附樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、蛋白結(jié)合膜(3)、吸水墊(4)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述載體蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或卵清蛋白，并且優(yōu)選牛血清白蛋白。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，步驟3)中的所述抗鼠IgG抗體為兔抗鼠IgG抗體；所述蛋白結(jié)合膜(3)選自硝酸纖維素膜或PVDF膜，并且優(yōu)選硝酸纖維素膜；優(yōu)選地，所述背襯⑵為PVC背襯。12.—種檢測福美雙的酶聯(lián)免疫試劑，其用權(quán)利要求2所述的抗體作為第一抗體。13.權(quán)利要求2所述的抗體在檢測福美雙中的應(yīng)用。14.權(quán)利要求2所述的抗體在檢測蔬菜或水果中的福美雙中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于農(nóng)藥檢測領(lǐng)域，利用免疫化學(xué)技術(shù)快速檢測殘留的農(nóng)藥。具體地，本發(fā)明涉及一種保藏編號為CGMCCNo.3580的雜交瘤細(xì)胞株，以及所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗福美雙單克隆抗體。本發(fā)明還涉及一種檢測福美雙的組合物、一種檢測福美雙的試紙、所述試紙的制備方法、一種檢測福美雙的酶聯(lián)免疫試劑、以及所述抗福美雙單克隆抗體在檢測福美雙中的應(yīng)用。本發(fā)明的單克隆抗體靈敏度高、特異性強。本發(fā)明的試紙具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測快速準(zhǔn)確等顯著優(yōu)點。文檔編號G01N33/558GK101825632SQ20101013969公開日2010年9月8日申請日期2010年4月6日優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日發(fā)明者王金花,羅海峰申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局;北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司