專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種微流控生物芯片，特別涉及一種針對(duì)病原微生物樣品分選/ 富集、內(nèi)涵物裂解和生物發(fā)光定量檢測(cè)的集成化微流控芯片。
背景技術(shù)：
強(qiáng)致病性病原微生物往往致病力強(qiáng)，如幽門(mén)螺桿菌大腸桿菌0157:H7(E. coli 0157:H7)的最低感染劑量可少于10個(gè)病原菌。因此，發(fā)展對(duì)環(huán)境、食品和臨床標(biāo)本中病原 微生物的快速、靈敏、特異的分析檢測(cè)方法是人類(lèi)社會(huì)預(yù)防傳染性疾病擴(kuò)散，確保人類(lèi)健康 的迫切需要。目前，常規(guī)的病原微生物檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和分子生物學(xué) 法，且都因其自身研究手段的局限性而存在許多不足傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法和生化鑒定法特 異性低、耗時(shí)費(fèi)力、對(duì)培養(yǎng)環(huán)境和操作人員要求嚴(yán)格，不適宜病原菌的快速檢測(cè)。免疫學(xué)檢 測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、生物發(fā)光免疫分析法、免疫膠體金技術(shù)等一般需要 提供數(shù)量較多的純化細(xì)菌，或需對(duì)樣品進(jìn)行濃縮富集，同樣難以在短時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果。 PCR及其相關(guān)技術(shù)雖具有高度的特異性和靈敏度，但由于方法過(guò)度敏感，在檢測(cè)過(guò)程中，因 為樣本污染、RNA非法轉(zhuǎn)錄、靶RNA低水平表達(dá)、引物設(shè)計(jì)不合理以及實(shí)驗(yàn)條件未優(yōu)化、取材 的局限等常常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。相對(duì)于現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的缺陷，20世紀(jì)90年代初期出現(xiàn)的微流控芯片技術(shù)以其高 度的集成化、微型化、分析手段的多樣化、分析速度快、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，在技術(shù)上呈現(xiàn)出獨(dú) 特的優(yōu)勢(shì)，適合病原微生物快速檢測(cè)的多項(xiàng)要求首先，微流控芯片系統(tǒng)具有多種操作單元 靈活組合、整體可控和規(guī)模集成的特點(diǎn)，可將整個(gè)病原微生物的樣品處理和檢測(cè)分析過(guò)程 整合在一塊芯片上；第二，通過(guò)MEMS加工，可以很容易的在芯片上刻蝕密集的分析通道陣 列，大大增加了分析通量，并且芯片每一通道之間均相互獨(dú)立，避免了樣本的交叉干擾，分 離分析過(guò)程完全在一個(gè)相對(duì)密閉的通道中進(jìn)行，降低了操作者被感染的危險(xiǎn)性。第三，鑒于 芯片微通道的結(jié)構(gòu)(微升級(jí)或納升級(jí))，微尺度下的高比表面積，流體傳質(zhì)、傳熱快，有效地 降低了樣品和試劑的消耗量，大大縮短整個(gè)分析時(shí)間，達(dá)到快速分析的目的。因此，利用微 流控芯片技術(shù)進(jìn)行微生物研究越來(lái)越受到人們的重視。目前，經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，各種基于微流控技術(shù)開(kāi)展的病原微生物預(yù)處理(Inami H, et al.Biosens Bioelectron. 2009,24(11) 3299-3305 ；KulinskiMD, et al. Biomed Microdevices. 2009,11(3) :671_678·)、富集 / 分選(Bao N, et al. J Chromatogr A，2008， 1181(1-2) 153-158 ；Qiu J, et al. Talanta. 2009,79(3) :787_795·)以及分離檢測(cè)(Lee SJ, et al. Sensors and ActuatorsB,2008,132(2) 443448 ；Zordan MD, et al. Cytometry Α. 2009,75(2) :155_162.)的新方法不斷涌現(xiàn)。但現(xiàn)有的技術(shù)和方法主要是針對(duì)病原微生 物分析檢測(cè)中的某一單元或步驟，如富集/分選、預(yù)處理或分離檢測(cè)展開(kāi)的，通常檢測(cè)需要 分幾次完成，有檢測(cè)誤差大、時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)時(shí)消耗的藥品和試劑量大等缺點(diǎn)。因此，在同一微流控芯片上實(shí)現(xiàn)病原微生物的分選/富集、內(nèi)涵物裂解、生物發(fā)光 反應(yīng)和檢測(cè)一步完成的芯片，是目前亟待即將的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型目的在于提供一種用于病原微生物檢測(cè)的微流控芯片，采用本案所述 微流控芯片，能夠?qū)崿F(xiàn)免疫親和識(shí)別/富集、內(nèi)涵物裂解、生物發(fā)光反應(yīng)和檢測(cè)等一體化操 作，大大簡(jiǎn)化病原微生物的分析檢測(cè)過(guò)程，顯著降低樣品用量和試劑耗量，并且還具有檢測(cè) 誤差小、時(shí)間短、成本低、攜帶方便、消耗的藥品和試劑量少的優(yōu)點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用以下技術(shù)方案用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，所述微流控芯片包括蓋片和基片，蓋片和基 片封接貼合，蓋片上設(shè)置有兩條流體傳輸通道、六邊形識(shí)別/富集腔、生物發(fā)光檢測(cè)單元和 兩個(gè)儲(chǔ)液池，填充有抗體修飾的微珠的識(shí)別/富集腔的兩端分別與第一、第二流體傳輸通 道連通，第一儲(chǔ)液池與第一流體傳輸通道連接、第二儲(chǔ)液池與第二流體傳輸通道連接，第 一、二儲(chǔ)液池分別位于芯片的兩端，儲(chǔ)液池與外部傳輸裝置相連，生物發(fā)光檢測(cè)單元位于第 二流體傳輸通道的末端或第二儲(chǔ)液池，第二流體傳輸通道與免疫富集腔為臺(tái)階狀。所述第一流體傳輸通道為入口通道，第二流體傳輸通道為出口通道；第一流體傳 輸通道寬200 μ m、深70μπκ長(zhǎng)Icm ；第二流體傳輸通道寬200 μ m，深30 μ m，長(zhǎng)1. 8cm。所述第二流體傳輸通道深度小于免疫富集腔深度。所述識(shí)別/富集腔腔體長(zhǎng)7mm、寬3mm，其腔體深度為大于微珠直徑的1倍并小于 微珠直徑的2倍。所述識(shí)別/富集腔與通道相連的兩斜邊之間的夾角α為60°。所述識(shí)別/富集腔富集腔內(nèi)的微珠呈單層排列。所述第一儲(chǔ)液池和第二儲(chǔ)液池的直徑分別為1. 5mm和3mm。所述微珠材料為玻璃或聚苯乙烯材料，所述蓋片材料為聚合物聚二甲基硅氧烷。所述微珠的表面固載的探針?lè)肿涌贵w為具有靶向各類(lèi)病原微生物有機(jī)體的抗體。本實(shí)用新型具有如下的優(yōu)點(diǎn)1.將病原微生物樣品的進(jìn)樣，分選/富集、加試劑、混合、反應(yīng)和內(nèi)涵物的高靈敏 檢測(cè)等功能集成在微芯片上，可大大簡(jiǎn)化分析流程，降低樣品和試劑的消耗量，減少因多次 檢測(cè)操作所帶來(lái)的操作誤差，避免樣品轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的樣品損失，提高檢測(cè)的分析速度、檢測(cè) 準(zhǔn)確度和靈敏度。2.以抗體為識(shí)別分子，可增強(qiáng)檢測(cè)特異性，利用共價(jià)修飾可便利地將相應(yīng)抗體固 載于微珠表面。微珠價(jià)格低廉，可根據(jù)樣本的需要控制微珠的數(shù)量，保證檢測(cè)靈敏度和檢測(cè) 范圍。同時(shí)，利用微流控技術(shù)，可便利地將微珠導(dǎo)入/導(dǎo)出微芯片，芯片可反復(fù)多次使用而 無(wú)污染，能保證測(cè)定的準(zhǔn)確度。3.微米級(jí)或納米級(jí)微珠具有較大的比表面積，可增加抗原/抗體的結(jié)合幾率，有 利于加快免疫反應(yīng)，縮短分析時(shí)間，提高病原微生物的檢出速度。4.將樣品預(yù)處理(包括識(shí)別/富集、內(nèi)涵物裂解)、生物發(fā)光反應(yīng)和檢測(cè)等功能集 成至單一微流控芯片上，可使微流控芯片裝置構(gòu)造更為緊湊，利于發(fā)展微型化、便攜化的病 原微生物檢測(cè)系統(tǒng)。

圖1為本實(shí)用新型芯片的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖；[0023]圖2為本實(shí)用新型芯片的側(cè)視圖；圖3為本實(shí)用新型芯片的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖，其中α為識(shí)別/富集腔斜邊與通道向識(shí)別/ 富集腔內(nèi)的延長(zhǎng)線之間的夾角。圖中，1為第一流體傳輸通道，2為識(shí)別/富集腔，3為第二流體傳輸通道，4為微 珠，5為第一儲(chǔ)液池，6為第二儲(chǔ)液池。
具體實(shí)施方式
運(yùn)用模塑法(孟斐等.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)· 2002，23 (7) 1264-1268 ；劉長(zhǎng)春等，微 細(xì)加工技術(shù)，2004，1 :58-61)制作出如圖1所示微結(jié)構(gòu)的PDMS蓋片，經(jīng)紫外光光化學(xué)處理 后，將此蓋片與玻璃基片封接即可得到完整的微流控芯片。參見(jiàn)圖1、圖2及圖3，該芯片由 流體傳輸通道1、3、識(shí)別/富集腔2、生物發(fā)光檢測(cè)單元4和第一、第二儲(chǔ)液池5、6組成。蓋 片上設(shè)置有第一、第二流體傳輸通道1、3、六邊形識(shí)別/富集腔2、生物發(fā)光檢測(cè)單元4和第 一、第二儲(chǔ)液池5、6，填充有抗體修飾的微珠4的識(shí)別/富集2腔的兩端分別與第一、第二 流體傳輸通道1、3連通。識(shí)別/富集腔富集腔內(nèi)的微珠呈單層排列。第一流體傳輸通道為 入口通道，第二流體傳輸通道為出口通道；第一流體傳輸通道寬200 μ m,深70 μ m，長(zhǎng)Icm ； 第二流體傳輸通道寬200 μ m,深30 μ m，長(zhǎng)1. 8cm。第一儲(chǔ)液池和第二儲(chǔ)液池的直徑分別為 1. 5mm和3mm。第一儲(chǔ)液池5與第一流體傳輸通道1連接、第二儲(chǔ)液池6與第二流體傳輸通 道3連接，第一、二儲(chǔ)液池分別位于芯片的兩端。所述識(shí)別/富集腔腔體長(zhǎng)7mm、寬3mm，深 70 μ m0識(shí)別/富集與通道相連的兩斜邊之間的夾角α為60°，其腔體深度為大于微珠直 徑的1倍并小于微珠直徑的2倍。采用這種結(jié)構(gòu)的六邊形微腔，使其具有較大的有效腔體 面積，可擁有較高的微珠填充率；六邊形的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，可使裝填的微珠排列為穩(wěn)定的六邊形 晶格聚集模式，不易受到液流剪切的影響而保持其排列的穩(wěn)定性；而且六邊形腔體結(jié)構(gòu)較 相同體積的圓形、方形、菱形等幾何形狀具有更大的徑向長(zhǎng)度，液流進(jìn)/出腔體時(shí)，流體的 線速度沿腔體徑向呈線性改變，減少了流速較大時(shí)腔體內(nèi)產(chǎn)生死體積的可能性。腔內(nèi)填充 有經(jīng)抗體修飾的微珠，微珠粒徑為微米級(jí)，略小于腔體深度，使其在微腔內(nèi)呈單層排列。微 珠采用玻璃或聚苯乙烯材料。微珠的表面固載的探針?lè)肿涌贵w為具有靶向各類(lèi)病原微生物 有機(jī)體的抗體，所述蓋片材料為聚合物聚二甲基硅氧烷。儲(chǔ)液池與外部傳輸裝置相連，生物 發(fā)光檢測(cè)單元位于第二流體傳輸通道3的末端或第二儲(chǔ)液池6，本實(shí)施例的發(fā)光檢測(cè)位點(diǎn) 位于出口儲(chǔ)液池6中。第二流體傳輸通道深度小于富集腔深度，使第二流體傳輸通道3與 免疫富集腔2為臺(tái)階狀，防止微珠流入出口通道。微珠的表面固載的探針?lè)肿涌贵w的方法如下準(zhǔn)確稱(chēng)取IOmg直徑50 μ m玻璃微珠于離心管中，用Piranha溶液(H2SO4 H2O2 =3 1)浸泡過(guò)夜后，再用無(wú)菌超純水洗滌5次，然后置于70°C干燥30min。在離心 管中加入2% APTES丙酮溶液反應(yīng)lmin，依次用丙酮和無(wú)菌超純水清洗5次。在10 μ L Img .mL—1 抗體工作液中加入 50 μ L MES 緩沖液、8 μ L 4mg 'mL^EDC C2mmol Γ1)禾口 12 μ L 4mg · Iiir1NHS C2mmol · ml/1)，室溫反應(yīng) 15min 后，加入 120 μ L 0. Imol · L-1PBS 緩沖液終止 NHS-抗體活化酯形成反應(yīng)，即得到抗體濃度為50 μ g .mL-1的反應(yīng)液。將反應(yīng)液加入上述裝 有玻珠的離心管中，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢后用0. Imol ^r1PBS清洗3次，得到經(jīng)抗E. coli 0157:H7多克隆抗體修飾的免疫微珠，置于4°C備用。[0029]將芯片依次用75%酒精、無(wú)菌超純水清洗后，用小牛血清白蛋白(BSA)封閉 30min,再用pH = 7. 20的0. Olmol · IZ1PBS緩沖液清洗。將經(jīng)抗體修飾后的微珠加入已 注滿0. Olmol · L-1PBS的芯片微通道入口儲(chǔ)液池內(nèi)，利用注射泵以10 μ 1 · mirT1流速正壓 驅(qū)動(dòng)填充入免疫微腔內(nèi)。該芯片免疫富集腔內(nèi)的微珠易于導(dǎo)入和導(dǎo)出，在富集腔內(nèi)成單層 緊密排列。本實(shí)施例采用標(biāo)準(zhǔn)菌株E. coli 0157:H7和經(jīng)抗E. coli 0157:H7多克隆抗體 (Kirkegaard&Perry Laboratorieslnc，USA)修飾的微珠進(jìn)行微流控芯片的分析檢測(cè)。上述方法根據(jù)不同的抗體，選擇不同的試劑和反應(yīng)條件，可以得到不同的抗體修 飾的微珠。采用本實(shí)用新型所述芯片檢測(cè)病原微生物的方法如下將含有病原微生物的樣品通過(guò)第一儲(chǔ)液池5，在泵壓驅(qū)動(dòng)下通過(guò)第一流體傳輸通 道1進(jìn)入免疫識(shí)別/富集腔2中；腔內(nèi)填充有經(jīng)抗體修飾的微珠，通過(guò)特異性的免疫識(shí)別反 應(yīng)，樣品中的病原微生物被識(shí)別、捕獲，并被富集于微珠表面；反應(yīng)結(jié)束后，驅(qū)動(dòng)生物發(fā)光試 劑經(jīng)第一儲(chǔ)液池5、第一流體傳輸通道1進(jìn)入免疫識(shí)別/富集腔2，富集的病原微生物被其 中的裂解劑裂解后，釋放出內(nèi)涵物并生成發(fā)光復(fù)合物，將生成的發(fā)光復(fù)合物洗脫至第二流 體傳輸通道3和第二儲(chǔ)液池6，以第二儲(chǔ)液池6作為發(fā)光檢測(cè)點(diǎn)檢測(cè)生物發(fā)光強(qiáng)度。根據(jù)發(fā) 光強(qiáng)度的大小即可判斷樣品中目標(biāo)病原微生物的是否存在和含量的多少，從而得到檢測(cè)結(jié)
果 ο如將LB培養(yǎng)基37 "C增菌8h的E. coli 0157:H7菌液用pH = 7. 20的 0. Olmol · L-1PBS緩沖液稀釋10倍。取此細(xì)菌懸液1 μ L加入至芯片入口儲(chǔ)液池中， 以5μ L · mirT1流速正壓驅(qū)動(dòng)至芯片內(nèi)，再用pH = 7. 20的0. Olmol · L^1PBS緩沖液以 IOyL-mirT1流速?zèng)_洗5min，以降低或消除芯片壁、微珠間隙產(chǎn)生的非特異性吸附或殘留。 將生物發(fā)光試劑(BacTiter-Glo Microbial CellViability Assay，Promega，USA)以 1 μ L · mirT1流速正壓傳輸至芯片中，于芯片出口儲(chǔ)液池為發(fā)光檢測(cè)點(diǎn)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。
權(quán)利要求一種用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，所述微流控芯片包括蓋片和基片，蓋片和基片封接貼合，其特征在于蓋片上設(shè)置有兩條流體傳輸通道、六邊形識(shí)別/富集腔、生物發(fā)光檢測(cè)單元和兩個(gè)儲(chǔ)液池，填充有抗體修飾的微珠的識(shí)別/富集腔的兩端分別與第一、第二流體傳輸通道連通，第一儲(chǔ)液池與第一流體傳輸通道連接、第二儲(chǔ)液池與第二流體傳輸通道連接，第一、二儲(chǔ)液池分別位于芯片的兩端，儲(chǔ)液池與外部傳輸裝置相連，生物發(fā)光檢測(cè)單元位于第二流體傳輸通道的末端或第二儲(chǔ)液池，第二流體傳輸通道與免疫富集腔為臺(tái)階狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述第一 流體傳輸通道為入口通道，第二流體傳輸通道為出口通道；第一流體傳輸通道寬200 μ m、 深70μπκ長(zhǎng)Icm ；第二流體傳輸通道寬200 μ m，深30 μ m，長(zhǎng)1. 8cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述第二 流體傳輸通道深度小于免疫富集腔深度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述識(shí)別/ 富集腔腔體長(zhǎng)7mm、寬3mm，其腔體深度為大于微珠直徑的1倍并小于微珠直徑的2倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述識(shí)別/ 富集腔與通道相連的兩斜邊之間的夾角α為60°。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述識(shí)別/ 富集腔富集腔內(nèi)的微珠呈單層排列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述第一 儲(chǔ)液池和第二儲(chǔ)液池的直徑分別為1. 5mm和3mm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述微珠 材料為玻璃或聚苯乙烯材料，所述蓋片材料為聚合物聚二甲基硅氧烷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述微珠 的表面固載的探針?lè)肿涌贵w為具有靶向各類(lèi)病原微生物有機(jī)體的抗體。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型涉及一種用于檢測(cè)病原微生物的微流控芯片，所述芯片包括蓋片和基片，蓋片上設(shè)置有流體傳輸通道、識(shí)別/富集腔、生物發(fā)光檢測(cè)單元和儲(chǔ)液池，識(shí)別/富集腔的兩端分別與第一、第二流體傳輸通道連通，第一、二儲(chǔ)液池分別與第一、二流體傳輸通道連接，第一、二儲(chǔ)液池分別位于芯片的兩端，儲(chǔ)液池與外部傳輸裝置相連，生物發(fā)光檢測(cè)單元位于第二流體傳輸通道的末端或第二儲(chǔ)液池，第二流體傳輸通道與免疫富集腔為臺(tái)階狀。采用本案所述微流控芯片，能夠?qū)崿F(xiàn)免疫親和識(shí)別/富集、內(nèi)涵物裂解、生物發(fā)光反應(yīng)和檢測(cè)等一體化操作，大大簡(jiǎn)化病原微生物的分析檢測(cè)過(guò)程，顯著降低樣品用量和試劑耗量，具有檢測(cè)誤差小、時(shí)間短、成本低、攜帶方便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK201628717SQ20102011073
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者張惠靜, 張莉, 畢穎楠, 管瀟, 郝敦玲 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)