專利名稱：一種甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測甲型肝炎病毒(HAV) IgM抗體試紙。
背景技術(shù)：
甲型肝炎是流行性肝炎的一種，由于甲型肝炎病毒(HAV)感染引起，是一類急性， 自限性疾病，預(yù)后良好，極少轉(zhuǎn)變?yōu)槁浴AV是通過糞-口途徑傳播的，即由病人的潛伏期或急性期糞便、血液中的甲肝病毒污染水源、食物、用具及生活密切接觸經(jīng)口進入胃腸道而傳播。該病毒感染可引起不同程度的急性癥狀，包括爆發(fā)性肝炎。1988年初春，上海發(fā)生的一場突如其來的甲肝大流行，整整持續(xù)了 2個月，甲肝感染者超過35萬人，死亡31人。甲肝的早期診斷具有重要意義。抗HAV-IgM是診斷甲型病毒肝炎的特異性指標?？?HAV IgM陽性意味著患者處于甲型病毒性肝炎的急性期，并可作為早期診斷的可靠指標。免疫層析膠體金技術(shù)是一種新型的診斷技術(shù)，已得到較為廣泛運用，其基本原理為利用膠體金標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對抗原或抗體，檢測時當(dāng)樣品中含有相應(yīng)的特異性抗體或抗原時，膠體金標記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測線，通過檢測線的有無實現(xiàn)對結(jié)果的判定。具有操作簡便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點ο
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種具有簡便、準確、快速、靈敏度和特異性高、經(jīng)濟實用、適合于現(xiàn)場檢測等特點的甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙。為了達到本實用新型的目的采取如下技術(shù)方案一種甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，在塑料支撐板上粘貼上樣墊，上樣墊的一端緊密連接含有標記HAV抗體的膠體金墊，膠體金墊的另一端緊密連接的含有HAV抗原的抗原墊，抗原墊的另一端緊密連接硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，檢測線為包被在硝酸纖維素膜上的抗人IgM抗體，質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG抗體，在檢測線和質(zhì)控線之間且距檢測線2. 5 3mm處劃有指示線用于標識加樣位置，硝酸纖維素膜的另一端緊密連接吸樣墊形成試紙條，試紙條也可以裝入塑料卡中形成卡式包裝。所述的指示線加樣量為3 5ul。所述的上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊為吸水濾紙。所述的甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的抗人IgM抗體的包被方法為以0. 01MpH7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人IgM抗體配制成1. 5mg/ml的溶液， 有噴膜機在NC膜下部以1. 3ul/cm的參數(shù)進行劃線，包被T線，同時在NC膜上部包被羊抗鼠IgG作為C線，劃線后將NC膜在干燥間(溫度20 25°C，濕度小于30% )干燥8 10小時。所述的甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的HAV抗體標記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30 50nm的膠體金溶液， 制備完成后取IOOml膠體金液放在燒杯中，用0. 2MK2C03調(diào)至pH8. 2，按IOOml膠體金溶液加入0. 5mgHAV單克隆抗體，室溫攪拌2小時，加入終濃度0. 酪蛋白鈉，0. 聚乙二醇 20000封閉20min，12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至66. 7ml，按Iml溶液鋪16cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間溫度20 25°C，，濕度小于30 %干燥2 4小時，制成膠體金墊，備用。所述的甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的HAV抗原墊制備方法為將HAV抗原膠體金工作液按(1 4)稀釋，按Iml溶液鋪18. 5cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間溫度20 25°C，濕度小于30%干燥2 4小時，制成抗原墊，備用。試紙條的裝配方法為在干燥室內(nèi)溫度20 25°C，濕度小于30%，取塑料支撐板， 將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)距邊緣Imm搭接抗原墊， 在抗原的另一側(cè)距邊緣Imm搭接膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)距邊緣2mm搭接粘貼上樣墊； 在NC膜C線一側(cè)距邊緣1. 5mm處搭接吸樣墊。然后用裁剪機將貼好的塑料板切成3mm或 4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成HAV IgM抗體檢測試劑卡。檢測方法將被檢血清或血漿平衡至室溫，將制備好的試紙條或試劑卡平放，在 NC膜標示線上加入3 5ul被檢樣品，若樣品中含抗HAV IgM抗體則被NC膜上的抗人IgM 抗體捕獲，并與擴散到NC膜上的Ag-Ab-HAV-膠體金的Ag相結(jié)合，形成復(fù)合物，當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達到一定數(shù)量時，則形成一條肉眼可見的T線，C線作為試劑的質(zhì)控標準，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在20分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果。本實用新型甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙的優(yōu)點檢測時將樣本加在指示線8上，在上樣墊上加稀釋液，然后觀察免疫反應(yīng)結(jié)果。具有簡便、準確、快速、靈敏度和特異性高、經(jīng)濟實用、適合于現(xiàn)場檢測等特點。


圖ι為本實用新型甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙結(jié)構(gòu)示意圖,
1 上樣墊 3 抗原墊 5 吸樣墊 7:質(zhì)控線 9 塑料支撐板
2 膠體金墊 4 硝酸纖維素膜 6 檢測線 8 指示線
具體實施方式
實施例制備甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙1主要材料HAV天然抗原、單克隆抗體、抗μ鏈單克隆抗體均為深圳市菲鵬生物股份有限公司提供，分別用于輔抗原墊、標記膠體金顆粒、包被硝酸纖維素(NC)膜；氯金酸和檸檬酸三鈉為Sigma公司產(chǎn)品，用于空白金制備；硝酸纖維素膜為Millipore公司產(chǎn)品；酪蛋白鈉、 聚乙二醇20000為Sigma公司產(chǎn)品，用于膠體金封閉；其它試劑均為分析純試劑。2 方法2. IHAV單克隆抗體的標記用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0. 2MK2C03可將溶液pH調(diào)到pH7. 0、pH8. 2、pH9. 2、然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液0. 5mg、1. Omg, 1. 5mgHAV單克隆抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時，再加入終濃度為0. 酪蛋白鈉，0. 聚乙二醇20000進行封閉20分鐘，12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至66. 7ml，按Iml溶液鋪16cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間溫度20 25°C，，濕度小于30%干燥 2 4小時，制成膠體金墊，備用。2. 2HAV抗原墊制備方法將HAV抗原用膠體金工作液按1 1、1 2、1 4、1 8稀釋，按Iml溶液鋪 18. 5cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間溫度20 25°C，濕度小于 30 %干燥2 4小時，制成抗原墊，備用。2. 3抗μ鏈單克隆抗體包被用0. OlM pH7. 2PBS抗μ鏈單克隆抗體包被分別稀釋成1. Omg/mlU. 5mg/ml、 2.0mg/ml，然后用噴膜儀將抗μ鏈單克隆抗體在NC膜上按1. Ml/cm劃線包被，同時包被羊抗鼠IgG抗體，包被完成后將NC膜置于干燥間干燥8-10小時，備用。2. 4試紙條的裝配在干燥室內(nèi)溫度20 25°C，濕度小于30 %，取塑料支撐析，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)距邊緣Imm搭接抗原墊，在抗原的另一側(cè)距邊緣Imm搭接膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)距邊緣2mm搭接粘貼上樣墊；在NC膜C線一側(cè)距邊緣1.5mm處搭接吸樣墊。然后用裁剪機將貼好的塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成HAV IgM抗體檢測試劑卡。2. 4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至室溫，將制備好的試紙條或試劑卡平放， 在NC膜標示線上加入3 5ul被檢樣品，若樣品中含抗HAV IgM抗體則被NC膜上的抗人 IgM抗體捕獲，并與擴散到NC膜上的Ag-Ab-HAV的Ag相結(jié)合，形成復(fù)合物，當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達到一定數(shù)量時，則形成一條肉眼可見的T線，C線作為試劑的質(zhì)控標準，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在20分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果。3 結(jié)果3. 1根據(jù)小樣的檢測結(jié)果，確定試紙的最佳標記pH值為8. 2，最佳標記量為0. 5mg 每IOOml膠體金溶液，最佳的膠體金工作液為pH9. O的Tris-檸檬酸緩沖液，含0. 2%的酪蛋白，5%蔗糖，0.2%的BSA，0. 2%的吐溫，最佳的抗μ鏈單克隆抗體包被濃度為1.5mg/ ml，最佳的抗原稀釋比例為1 4。20分鐘內(nèi)判讀結(jié)果。3. 2臨床樣本檢測以ELISA試劑為對照，20份陽性血清，本試劑檢測出陽性19份，靈敏度為95%，50份陰性樣本中，本試劑檢測出陰性49份，特異性為98%。
權(quán)利要求1.一種甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特征在于在塑料支撐板(9)上粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密連接含有標記HAV抗體的膠體金墊O)，膠體金墊O)的另一端緊密連接的含有HAV抗原的抗原墊(3)，抗原墊(3)的另一端緊密連接硝酸纖維素膜G)，硝酸纖維素膜(4)包被有相互分離的檢測線(6)和質(zhì)控線(7)，檢測線(6)為包被在硝酸纖維素膜上的抗人IgM抗體，質(zhì)控線(7)為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG抗體，在檢測線(6)和質(zhì)控線(7)之間且距檢測線(6) 2. 5 3mm處劃有指示線⑶用于標識加樣位置，硝酸纖維素膜(4)的另一端緊密連接吸樣墊( 形成試紙條，試紙條也可以裝入塑料卡中形成卡式包裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的指示線⑶加樣量為3 5ul。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙，其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊(5)為吸水濾紙。
專利摘要本實用新型涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種甲型肝炎病毒IgM抗體快速檢測試紙。由上樣墊、標記有HAV抗體的膠體金墊、HAV抗原墊，硝酸纖維素(NC)膜和吸樣墊構(gòu)成，NC膜包被有相互分離的檢測(T)線和質(zhì)控(C)線，在C線與T線之間噴有指示線。T線為抗人IgM抗體，C線為羊抗鼠IgG抗體。檢測時將樣本加在指示線上，在上樣墊上加稀釋液，然后觀察免疫反應(yīng)結(jié)果。具有操作簡便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/558GK201965131SQ201020665839
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者崔迎進, 李洲 申請人:天津中新科炬生物制藥有限公司