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      抗甲型肝炎病毒IgMAlphaLISA檢測(cè)試劑盒的制作方法

      文檔序號(hào):5943009閱讀:257來源:國(guó)知局
      專利名稱:抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA檢測(cè)試劑盒的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及甲肝病毒的免疫學(xué)檢測(cè),具體地說,涉及抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA檢測(cè)試劑盒。
      背景技術(shù)
      甲型肝炎病毒(HAV)是感染人類甲型肝炎的主要病原。主要是經(jīng)糞口傳播途徑感染,即由病人的潛伏期或急性期糞便、血液中的甲肝病毒污染水源、食物、用具及生活密切接觸經(jīng)口進(jìn)入胃腸道而傳播。兒童和青少年人群多發(fā)。HAV感染的診斷依據(jù)是檢出HAV的抗體。當(dāng)前,抗-HAV IgM是早期診斷甲型肝炎的特異性較高的指標(biāo),且有簡(jiǎn)便,快速的優(yōu)點(diǎn)。 抗-HAV IgM在發(fā)病后I周左右即可在血清中測(cè)出。因此,可以通過檢測(cè)抗-HAV IgM來建立診斷甲型肝炎的診斷方法。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明的一種抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA檢測(cè)試劑盒, 其包括供體微珠、受體微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原,其中,所述供體微珠包被有含25mM HEPESUOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300,pH7. 2的鏈霉親和素溶液;所述受體微珠包被有含 O. 05% Proclin-300, ρΗ7· 2 的 Anti-IgM 的 PBS 溶液。前述的試劑盒,包括供體微珠20 μ g/ml、受體微珠5 μ g/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6X10_8ng/孔;使用時(shí),以總體系10μ I計(jì),每孔添加量為受體微珠4μ I、 供體微珠5 μ I、生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原6Χ l(T8ng及血清I μ I。前述抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA檢測(cè)試劑盒的制備方法,其是將含25mM HEPESUOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300, pH7. 2的鏈霉親和素溶液包被至供體微珠上; 將含O. 05% Proclin-300, pH7. 2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受體微珠上;生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制備過程為用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株,培養(yǎng)細(xì)胞至病毒增殖高峰期,14天后收獲細(xì)胞懸液,經(jīng)氯仿抽提、PEG沉淀、離心后,用β-丙內(nèi)酯滅活,濃縮后即得甲肝病毒ΤΖ84株抗原,最后對(duì)得到的甲肝病毒ΤΖ84株抗原進(jìn)行生物素化。具體地,生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原的制備方法包括以下步驟(I)將甲肝病毒ΤΖ84株接種到人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株中,培養(yǎng)至病毒增殖高峰期;(2) 14天后收獲的感染細(xì)胞懸液經(jīng)凍融、超聲各3次釋放病毒;(3)進(jìn)行氯仿抽提,10%聚乙二醇濃縮,8000r/min,4°C離心Ih ;(4)用含2% SDS的Tris-NaCl緩沖液懸浮沉淀,經(jīng)蔗糖/甘油不連續(xù)密度梯度離心,從底層收獲甲肝病毒抗原;其中,蔗糖/甘油不連續(xù)密度梯度為0.5ml 80%甘油,1.8ml 30%鹿糖,I. 8ml 20%鹿糖,I. 8111110%鹿糖,I % SDS ;離心條件為 18°C, 37000r/min, 6h ;
      (5)用β_丙內(nèi)酯滅活甲肝病毒抗原后,進(jìn)行超速離心濃縮;(6)對(duì)步驟(5)中得到的甲肝病毒抗原進(jìn)行生物素化,具體為⑴加入100 μ IffS緩沖液和60 μ I約123 μ g的濃縮甲肝病毒抗原到超濾管中;(ii)離心 IOOOg, IOmin ;(iii)將10 μ I 二甲基亞砜加入到裝有NH2-reactive biotin的管中,用移液器吹打混勻;(iv)加入100 μ I反應(yīng)緩沖液和8μ I NH2-reactive biotin到超濾管中,用移液器吹打混勻,37°C孵育30min ;(V)加100 μ I WS緩沖液到超濾管中,離心lOOOOg, IOmin,棄濾液;(vi)加200 μ I WS緩沖液到超濾管中,離心lOOOOg,lOmin,重復(fù)此步驟一次;(vii)加入200 μ I WS緩沖液,用槍頭吹打10至15次,重懸此結(jié)合物;(viii)分裝于200 μ I PCR中,加等量甘油,_20°C保存。借由上述技術(shù)方案,本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行甲型肝炎病毒的檢測(cè),特異性好,靈敏度高,血清用量少,無需洗滌步驟。用試劑盒對(duì)93份血清樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示靈敏度(真陽性率) =78% ;特異度(真陰性率)=98. 5% ;假陽性率=1% ;假陰性率=22% ;陽性預(yù)測(cè)值= 95% ;陰性預(yù)測(cè)值=93% ;準(zhǔn)確度=94%。


      圖I為點(diǎn)雜交(dot-blot)法摸索生物素化甲肝病毒抗原最適濃度的結(jié)果。其中, 上排為生物素化甲肝病毒抗原,質(zhì)量分別180、90、45、22. 5、11. 25、5. 625ng ;下排為未生物素化的甲肝病毒抗原作為對(duì)照,質(zhì)量分別180、90、45、22. 5、11. 25,5. 625ng。
      具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段,所用原料均為市售商品。以下實(shí)施例中使用的甲型肝炎病毒(Hapatitis A)TZ84株已在尹等人,病毒學(xué)報(bào), 1986,2 (3) :209中公開,該毒株可購(gòu)自北京科興生物制品有限公司。實(shí)施例一、甲型肝炎病毒釋放、濃縮和純化I、將甲肝病毒TZ84株在人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株中,培養(yǎng)至病毒增殖高峰期;2、14天后收獲的感染細(xì)胞懸液經(jīng)凍融、超聲各3次釋放病毒;3、進(jìn)行氯仿抽提,10%聚乙二醇濃縮,8000r/min,4°C離心Ih ;4、沉淀物用適量的Tris-NaCl (NT)緩沖液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% SDS,SDS :十二烷基磺酸鈉)懸浮,蔗糖/甘油不連續(xù)密度梯度(0.5ml 80%甘油,1.8ml 30%蔗糖,1.8ml 20% 蔗糖,1.8ml 10%蔗糖(含質(zhì)量份數(shù)為1% SDS)37000r/min,18°C離心6h,從底層收獲甲肝病毒TZ84株抗原;5、β-丙內(nèi)酯滅活。二、抗原濃縮
      I、二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定甲肝病毒抗原濃度為9. 2 μ g/ml,而后分兩步進(jìn)行濃縮第一步15ml,3千道爾頓(KD)超濾濃縮試驗(yàn)材料甲肝病毒TZ84株抗原,200 μ I移液器,15ml 3KD超濾管。試驗(yàn)儀器固定轉(zhuǎn)頭離心機(jī)。試驗(yàn)步驟(I)在超濾管內(nèi)加入IOml的甲肝病毒TZ84株抗原;(2)配平,4°C固定轉(zhuǎn)頭離心機(jī)5000g離心55分鐘(min);(3)收集濾過液;(4)用Iml移液器和200 μ I移液器沿濾膜底部將I. 3ml濃縮液吸入到I. 5mlEP管中。BCA法測(cè)定濃縮液和濾過液的濃度分別為43. 2 μ g/ml和3. 2 μ g/ml。第二步0. 5ml, 3KD超濾管濃縮試驗(yàn)材料甲肝病毒TZ84株抗原、Iml移液器、O. 5ml 3KD超濾管。試驗(yàn)儀器小型離心機(jī)。試驗(yàn)步驟(I)在超濾管內(nèi)加入500μ1第一步濃縮的甲肝病毒TZ84株抗原濾過液;(2)配平,14000g,離心30min,收集濾過液;(3)將濃縮管口反向置于外離心管內(nèi),2000g,離心30min,收集濃縮液。結(jié)果IOml原液可濃縮至160 μ I。BCA法測(cè)定濃縮液濃度為205. 2 μ g/ml。三、甲肝病毒抗原的生物素化試驗(yàn)原理生物素與抗原結(jié)合,一個(gè)抗原分子可連接多個(gè)生物素分子,抗原的活性不受影響。試驗(yàn)材料生物素化試劑盒購(gòu)自Dojindo Molecular Technologies公司(商品編 LK03-10) UO μ I移液器、甲肝病毒抗原、200 μ I PCR管。試驗(yàn)儀器小型離心機(jī)。試驗(yàn)步驟(I)加入100 μ IWS緩沖液和60 μ I約123 μ g的濃縮甲肝病毒抗原到超濾管中,離心 IOOOg,IOmin ;(2)另外將10 μ I 二甲基亞砜(DMSO)加入到裝有NH2-reactive biotin的管中, 用移液器吹打混勻;(3)加入100 μ I反應(yīng)緩沖液和8 μ I NH2Teactive biotin到超濾管中,用移液器吹打混勻,37 °C孵育30min ;(4)加100 μ I WS緩沖液到超濾管中,離心lOOOOg, IOmin,棄濾液;(5)加200 μ I WS緩沖液到超濾管中,離心lOOOOg,IOmin,重復(fù)此步驟一次;(6)加入200 μ I WS緩沖液,用槍頭吹打10至15次,重懸此結(jié)合物;(7)分裝于200 μ I PCR中,加等量甘油,_20°C保存。結(jié)果
      BCA法測(cè)定生物素化后甲肝病毒TZ84株抗原濃度為125. 5 μ g/ml。加入等量甘油保存,濃度約60 μ g/ml。四、Dot-blot法摸索生物素化甲肝病毒TZ84株抗原的最適濃度I、試驗(yàn)原理生物素能與帶HRP標(biāo)記的SA特異性結(jié)合。2、試驗(yàn)材料硝酸纖維素(NC)膜、雜交袋、帶HRP標(biāo)記的SA、生物素化的甲肝病毒 TZ84株抗原,PCR管、顯色液。3、試驗(yàn)器材凝膠成像儀。4、試驗(yàn)步驟(I)在一張適當(dāng)大小的NC膜上用鉛筆畫二排圓圈,每排6個(gè),第一排為生物素化甲肝病毒抗原,第二排為未生物素化甲肝病毒抗原;(2)在二排的PCR管中分別加入3 μ I PBS,然后在每排第一個(gè)PCR管中加入6 μ I 約180ng的生物素化甲肝病毒抗原和未生物素化的甲肝病毒抗原,然后每排第一管中取 3μ I加入到第二管中,依次倍比稀釋;(3)從每個(gè)PCR管中分別取3 μ I體積的樣本到相對(duì)應(yīng)的NC膜圓圈上;(4)待膜上的樣本吸收完全,約30min ;(5)將膜裝入雜交袋內(nèi),加入6ml 5%脫脂奶封閉,以I : 500加入帶HRP的SA’ 4°C過夜;(6) PBST 洗膜 3 次,每次 IOmin ;(7)取出置于雜交袋內(nèi),加上等體積的A、B顯色液;(8)暗室壓片IOmin,顯影約3min,洗片,定影,洗片。5、試驗(yàn)結(jié)果(見表I及圖I):表I點(diǎn)雜交法得到的試驗(yàn)結(jié)果
      權(quán)利要求
      1.抗甲型肝炎病毒IgMAlphaLISA檢測(cè)試劑盒,其特征在于,包括供體微珠、受體微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原;其中,所述供體微珠包被有含 25mM HEPESUOOmM NaCl 和 O. 05% Proclin-300, pH7. 2 的鏈霉親和素溶液;所述受體微珠包被有含O. 05% Proclin-300,pH7. 2的Anti-IgM的PBS 溶液。
      2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒,其特征在于,包括供體微珠20μ g/ml、受體微珠 5 μ g/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6X l(T8ng/孔;使用時(shí),以總體系10 μ I計(jì),每孔添加量為受體微珠4 μ I、供體微珠5 μ I、生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原6Χ 10_8ng及血清I μ I。
      3.權(quán)利要求I或2所述抗甲型肝炎病毒IgMAlphaLISA檢測(cè)試劑盒的制備方法,其特征在于,將含25mM HEPESUOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300,pH7. 2的鏈霉親和素溶液包被至供體微珠上;將含O. 05% Proclin-300, pH7. 2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受體微珠上;生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制備過程為用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株,培養(yǎng)細(xì)胞至病毒增殖高峰期,14天后收獲細(xì)胞懸液,經(jīng)氯仿抽提、PEG沉淀、離心后,用丙內(nèi)酯滅活,濃縮后即得甲肝病毒TZ84株抗原,最后對(duì)得到的甲肝病毒 ΤΖ84株抗原進(jìn)行生物素化。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,生物素化的甲肝病毒ΤΖ84株抗原的制備包括以下步驟(1)將甲肝病毒ΤΖ84株接種到人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株中,培養(yǎng)至病毒增殖高峰期;(2)14天后收獲感染的細(xì)胞懸液經(jīng)凍融、超聲各3次釋放病毒;(3)進(jìn)行氯仿抽提,10%聚乙二醇濃縮,8000r/min,4°C離心Ih;(4)用含2%SDS的Tris-NaCl緩沖液懸浮沉淀,經(jīng)蔗糖/甘油不連續(xù)密度梯度離心,從底層收獲甲肝病毒抗原;其中,蔗糖/甘油不連續(xù)密度梯度為0.5ml 80%甘油,1.8ml 30% 鹿糖,I. 8ml 20%鹿糖,I. 8111110%鹿糖,I % SDS ;離心條件為 18°C,37000r/min, 6h ;(5)用丙內(nèi)酯滅活甲肝病毒抗原后,進(jìn)行超速離心濃縮;(6)對(duì)步驟(5)中得到的甲肝病毒抗原進(jìn)行生物素化,具體為(i)加入100μ IffS緩沖液和60 μ I約123 μ g的濃縮甲肝病毒抗原到超濾管中;(ii)離心IOOOg, IOmin ;(iii)將10μ I 二甲基亞砜加入到裝有NH2-reactive biotin的管中,用移液器吹打混勻;(iv)加入100μ I反應(yīng)緩沖液和8μ I NH2-reactive biotin到超濾管中,用移液器吹打混勻,37 °C孵育30min ;(V)加100 μ I WS緩沖液到超濾管中,離心IOOOOg, lOmin,棄濾液;(vi)加200μ I WS緩沖液到超濾管中,離心lOOOOg,lOmin,重復(fù)此步驟一次;(vii)加入200μ I WS緩沖液,用槍頭吹打10至15次,重懸此結(jié)合物;(viii)分裝于200μ I PCR中,加等量甘油,-20°C保存。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了一種抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA檢測(cè)試劑盒,其包括供體微珠、受體微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原。本發(fā)明通過純化、濃縮甲型肝炎病毒(HAV)TZ84株抗原并使其生物素化,通過點(diǎn)雜交法摸索出生物素化的HAV抗原的最適量為6×10-8ng/孔。通過優(yōu)化供體微珠、受體微珠、血清等試驗(yàn)反應(yīng)條件,建立了抗HAV IgMAlphaLISA檢測(cè)方法。其優(yōu)點(diǎn)在于特異性好,靈敏度高,血清用量少,無需洗滌步驟。用該試劑盒對(duì)93份血清樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示靈敏度(真陽性率)=78%;特異度(真陰性率)=98.5%;假陽性率=1%;假陰性率=22%;陽性預(yù)測(cè)值=95%;陰性預(yù)測(cè)值=93%;準(zhǔn)確度=94%。
      文檔編號(hào)G01N33/576GK102608313SQ20121004701
      公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
      發(fā)明者董小平, 陳操, 韓俊, 高晨 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
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