專利名稱：一種不同季節(jié)堆肥中酶的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及不同季節(jié)堆肥中的酶的種類和性質(zhì)，篩選出酶活性較高的，微生物生長(zhǎng)發(fā)育較好季節(jié)時(shí)期的堆肥菌種。
背景技術(shù)：
堆肥化(composting)是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等) 或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)〔humicsubstance，HS) 轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程。這一過程也是地球表面生態(tài)過程的一部分，它參與地球表面的物質(zhì)和能量循環(huán)。在人為控制條件下，通過堆肥化可以將固體廢物中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成為有機(jī)肥料一堆肥(compost)，這種有機(jī)肥料作為堆肥化的最終產(chǎn)物，不僅性能穩(wěn)定，并且對(duì)環(huán)境的危害甚小。因此，堆肥化是固體廢物，尤其是城市生活垃圾無害化、穩(wěn)定化和資源化的有效途徑之一。堆肥化發(fā)展至今，已經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的歷史，對(duì)其產(chǎn)生和發(fā)展的歷史過程進(jìn)行回顧和分析，可為今后開發(fā)新的堆肥工藝技術(shù)提供理論和實(shí)踐上的借鑒和幫助。陳世和等(1989)采用垃圾培養(yǎng)基，在城市生活垃圾堆肥處理過程中，溫度達(dá) 45°C和55°C時(shí)，對(duì)堆肥菌株進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在45°C時(shí)曲霉菌[Aspergillus]、芽孢桿菌屬[Bacillus]、假單孢菌屬[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳桿菌屬[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌群。而到55°C時(shí)則有所不同，除了芽孢桿菌屬[Bacillus]和假單孢菌屬Pseudomonas]仍然為優(yōu)勢(shì)菌群外，乳酸桿菌屬[LactcAacilIus]、鏈球菌屬 [Streptococcus]和小單孢菌[Micromonospora]屬則成為新的優(yōu)勢(shì)菌群，替代了其它種微生物，表明在堆肥化過程中，微生物種群處在一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)平衡之中。從城市生活垃圾中分離出大量參與高溫好氧堆肥的微生物，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等5屬細(xì)菌；曲霉屬，毛霉屬、紅曲霉屬，青霉屬、地霉屬、霉屬、脈孢苗屬、頭孢霉屬等8屬霉菌；鏈霉菌屬1屬放線菌；酵母菌屬，裂殖酵母菌等2屬酵母菌。該研究結(jié)果有力地促進(jìn)了對(duì)垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)對(duì)城市垃圾堆肥過程誒生物變化的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，分解有機(jī)物產(chǎn)生的高溫引起微生物群落的重要變化，使致病菌、酵母菌及中溫菌大量減少，而產(chǎn)芽孢的桿菌大量存在，在堆肥過程中，高溫階段初期和中文階段細(xì)菌均占主要地位。馬文漪等也報(bào)道了嗜熱真菌，嗜熱褐色放線菌等參與垃圾堆肥的微生物種群。從城市生活垃圾中有機(jī)物的組成來看，而被微生物所分解利用。但各種微生物對(duì)各種物質(zhì)的分解能力和分解速度是不盡相同的，不同溫度下(中溫、高溫)堆肥過程中出現(xiàn)的微生物種群和數(shù)量上亦截然不同。近期的相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)際生產(chǎn)表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥處理的技術(shù)水平、提高處理效率、改善產(chǎn)品質(zhì)量，一直是相關(guān)科研人員所重點(diǎn)關(guān)注的研究?jī)?nèi)容；在堆肥物料中針對(duì)特定物質(zhì)有目的的添加一些人工微生物制劑，已經(jīng)被很多研究所證實(shí)是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法?？紤]到在很多研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，合理配比的復(fù)合菌劑往往較單一菌株更具好的效果，于是如何將堆肥中提取和篩選出來的各種功能菌株結(jié)合起來開發(fā)高效堆肥復(fù)合菌劑，從根本上優(yōu)化和合理配制使用城市垃圾堆肥基質(zhì)便成了相關(guān)科研人員研究的熱點(diǎn)問題。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報(bào)道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等)或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程，是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個(gè)微生物群體共同作用而實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化、無害化的動(dòng)態(tài)過程。研究表明，單一的細(xì)菌、真菌、放線菌群體，無論其活性多高，在加快堆肥化進(jìn)程中的作用都比不上復(fù)合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接種外源微生物復(fù)合菌劑對(duì)堆肥化過程中微生物的影響，有利于了解堆肥過程的生物化學(xué)過程及加入微生物制劑對(duì)堆肥的影響。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)堆肥過程中的微生物現(xiàn)象進(jìn)行了一系列理論和實(shí)踐研究，Vaz-Moreira等人對(duì)堆肥中細(xì)菌的群落多樣性進(jìn)行分析，以期深入認(rèn)識(shí)堆肥過程的本質(zhì)，為堆肥技術(shù)和工藝的研究提供理論基礎(chǔ)。但在復(fù)合微生物菌劑研究過程中，有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及將堆肥微生物菌劑應(yīng)用于正常條件下對(duì)植物生長(zhǎng)的影響方面，相關(guān)研究也鮮為報(bào)道。而有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及從城市生活垃圾堆肥中提取篩選和配制堆肥復(fù)合有益微生物菌劑，對(duì)草坪植物生長(zhǎng)、生理特性的影響方面的研究還未見報(bào)道。隨著城市發(fā)展的不斷加快，生活垃圾產(chǎn)生量也與日俱增，如何有效處理這些垃圾成為一個(gè)亟待解決的社會(huì)問題。垃圾堆肥法在消納城市生活垃圾的同時(shí)，還可以起到腐殖質(zhì)源、補(bǔ)充土壤損失的營(yíng)養(yǎng)成分，提高土壤肥力，改善土壤環(huán)境及向植物提供各種基本微量元素的作用。盡管這些研究為垃圾堆肥其理化性質(zhì)提供了理論依據(jù)，但從城市垃圾堆肥中存在的酶的種類和活性的角度與微域營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)方面研究，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道目前還較少。如何利用這些固體廢棄物自身的價(jià)值營(yíng)養(yǎng)成分為人們所用，已經(jīng)越來越所到關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過在基于城市生活垃圾堆肥理化性質(zhì)的研究的基礎(chǔ)上，意在探索四個(gè)不同季節(jié)時(shí)期堆肥中的酶的種類和性質(zhì)，篩選出酶活性較高的，微生物生長(zhǎng)發(fā)育較好季節(jié)時(shí)期的堆肥菌種，一方面為生活垃圾堆肥在微域營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)方面研究提供依據(jù)，另一方面為生活垃圾堆肥中提取出的微生物菌種在草坪建植體系中的安全有效利用提供科學(xué)依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開了如下的技術(shù)方案
一種不同季節(jié)時(shí)期堆肥中酶的測(cè)定方法，其特征在于分別在春、夏、秋、冬四個(gè)不同季節(jié)時(shí)期采集(T20cm的新鮮堆肥樣，將采集的堆肥樣品，放在蔭涼處，攤開晾干，然后剔出植物殘?bào)w，石塊和其它的雜物，過2-5mm篩孔的土樣用來測(cè)定堆肥中的酶活性包括
(1)不同季節(jié)時(shí)期堆肥蔗糖酶活性的變化取0、l、2、3、4、5、6、7ml葡萄糖工作液，分別注入50ml容量瓶中，并按與測(cè)定蔗糖酶活性同樣的方法進(jìn)行顯色，比色后以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)同一個(gè)堆肥標(biāo)準(zhǔn)地的不同季節(jié)的取樣測(cè)定的基質(zhì)蔗糖酶取均值，分別和土壤中的蔗糖酶變化對(duì)比；
(2)不同季節(jié)時(shí)期堆肥多酚氧化酶或過氧化物酶活性的變化取0.75gK2Cr207溶于1L0. 5N的HCl (相當(dāng)于50ml乙醚中含5mg紫色沒食子素)；取重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0. 5N HCl稀釋成各種不同濃度；定容后，在分光光度計(jì)上于430nm處比色測(cè)定；以光密度值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(3)不同季節(jié)時(shí)期堆肥脲酶活性的變化取0、1、3、5、7、9、11、131111氮工作液，移于501111 容量瓶中，然后加蒸餾水至20mL ；再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻， 20min后顯色，定容，Ih內(nèi)在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)578nm處比色，根據(jù)吸光值與氮溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下 1材料與方法
1. 1試驗(yàn)供試堆肥
分別在四個(gè)不同季節(jié)時(shí)期(春季，夏季，秋季和冬季)采集天津市六里臺(tái)實(shí)驗(yàn)基地試驗(yàn)地(T20cm的新鮮堆肥樣，將采集的堆肥樣品，放在蔭涼處，攤開晾干，然后剔出植物殘?bào)w， 石塊和其它的雜物，過2-5mm篩孔的土樣用來測(cè)定堆肥中的酶活性。1.2測(cè)定指標(biāo)與方法
測(cè)定指標(biāo)包括不同顆粒粒徑堆肥的容重、PH值、孔隙度、飽和含水量、有機(jī)質(zhì)含量、全氮 (TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)。垃圾堆肥的容重采用重量法；pH值采用pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定?？紫抖炔捎帽戎?重量法測(cè)定)和容重比值法，依照如下公式進(jìn)行計(jì)算 P^ = (I-ClAl1) X 100，式中P為孔隙度，Cl1為比重，d為容重；飽和含水量采用重量法，依照如下公式進(jìn)行計(jì)算飽和含水量(%)=(原堆肥重量-烘干堆肥重量)X100/烘干堆肥重量； 以上測(cè)定方法均參照土壤農(nóng)化分析方法(鮑士旦，2000)
有機(jī)質(zhì)采用濃硫酸浴外加熱重鉻酸鉀氧化法；全氮采用濃硫酸-高氯酸消煮，半微量凱式定氮法(鮑士旦，2000);全磷、全鉀含量的測(cè)定以3 ml H2SO4, 7 ml而03和21 ml HCl在 120 140°C下分別對(duì)稱取的0.5 g垃圾堆肥和土樣進(jìn)行消化，當(dāng)棕黃色的煙散盡后，再加入2 ml此104直到溶液變得澄清透明，然后將溫度提高到150 160°C以除盡殘余的HClO4, 最后加入1 ml HNO3和少量去離子水將消化物溶解，過濾后再用去離子水定容到25 ml，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AEQ測(cè)定。1.3堆肥酶活性的測(cè)定方法
①蔗糖酶的測(cè)定采用硫代硫酸鈉滴定法(嚴(yán)昶升，1988)。稱取IOg過Imm篩的的風(fēng)干土樣于IOOml容量瓶中，并加入^iil甲苯在室溫下放置15分鐘，然后加入10ml20%的蔗糖和IOml磷酸鹽緩沖液(pH5. 5)，仔細(xì)搖勻，并將瓶置于 37°C恒溫箱中培養(yǎng)23小時(shí)之后，用熱至38°C的水將瓶中混合物稀釋至刻度(甲苯應(yīng)浮在刻度之上)，充分混勻之后，再放入37°C恒溫箱中培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，過濾。吸取20ml 濾液于IOOml三角瓶中，加入10啡啉溶液和20ml蒸餾水后，將三角瓶至于沸騰水浴上10分鐘，然后立即放在自來水流下冷卻至25°C，向三角瓶中加入:3ml，33%碘化鉀溶液和細(xì)1稀硫酸(1 :3)，最后用0. IN的硫代硫酸鈉滴定。在到達(dá)終點(diǎn)前加入0. 5ml淀粉指示劑，滴定至藍(lán)色剛剛消失為終點(diǎn)。并設(shè)無土對(duì)照和無基質(zhì)對(duì)照。轉(zhuǎn)化酶活性用M小時(shí)后單位土重的 0. IN硫代硫酸鈉的毫升數(shù)表示。②脲酶的測(cè)定方法采用苯酚一次氯酸鈉比色法(靛酚比色法)(嚴(yán)昶升，1988) 取IOg過Imm篩的土樣于100容量瓶中，用甲苯處理后15分鐘后，加入尿素和檸檬酸溶液(PH6. 7)，并仔細(xì)混合，并將容量瓶放入37°C恒溫箱中培養(yǎng)M小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用熱至 38°C水稀釋至刻度，仔細(xì)搖蕩，并將懸液用致密濾紙過濾于三角瓶中，吸取Iml濾液于50ml 容量瓶中，加入IOml蒸餾水，充分搖蕩，然后加入細(xì)1苯酚鈉，仔細(xì)混合，再加入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘，用水稀釋至刻度，溶液呈現(xiàn)靛酚的藍(lán)色，在光電比色計(jì)上用Icm 液槽，于578nm處將顯色液進(jìn)行比色測(cè)定。同時(shí)設(shè)置無土對(duì)照和無基質(zhì)對(duì)照。脲酶活性以 24小時(shí)后Ig堆肥中NH3-N的毫克數(shù)表示。③多酚氧化酶測(cè)定采用鄰苯三酚比色法(嚴(yán)昶升，1988)
取Ig過Imm篩的風(fēng)干土樣置于50ml帶磨口瓶塞的容量瓶中，加入鄰苯三酚溶液， 搖蕩混勻，于30°C恒溫箱中放置3小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，往瓶中加入乙醚，用力搖蕩多次，將紫色沒食子素提取到乙醚相中直至獲得無色的乙醚溶液，將萃取液合并至容量瓶中，用乙醚定容。然后在430nm下比色測(cè)定。另外設(shè)置無土對(duì)照和無基質(zhì)對(duì)照，并且繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。④過氧化物酶采用的是鄰苯三酚比色法(嚴(yán)昶升，1988)
取Ig過Imm篩的的風(fēng)干土樣置于50ml容量瓶中，然后加入10mll0%的鄰苯三酚溶液， 仔細(xì)搖蕩并將容量瓶至于30°C恒溫箱中放置3小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，往瓶中加入乙醚至刻度， 用力搖蕩多次，使紫色沒食子素提取到乙醚相中，將著色的乙醚相于430nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。同時(shí)設(shè)置無基質(zhì)對(duì)照和無土對(duì)照，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用MICROSOFT EXCEL 2003和SPSS 11. 5分析軟件進(jìn)行處 2研制結(jié)果分析 2.1堆肥理化性質(zhì)(見表1) 表1堆肥的理化性質(zhì)
權(quán)利要求
1. 一種不同季節(jié)中堆肥酶的測(cè)定方法，其特征在于分別在春、夏、秋、冬四個(gè)不同季節(jié)時(shí)期采集的新鮮堆肥樣，將采集的堆肥樣品，放在蔭涼處，攤開晾干，然后剔出植物殘?bào)w， 石塊和其它的雜物，過2-5mm篩孔的土樣用來測(cè)定堆肥中的酶活性包括(1)不同季節(jié)時(shí)期堆肥蔗糖酶活性的變化取0、l、2、3、4、5、6、7ml葡萄糖工作液，分別注入50ml容量瓶中，并按與測(cè)定蔗糖酶活性同樣的方法進(jìn)行顯色，比色后以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)同一個(gè)堆肥標(biāo)準(zhǔn)地的不同季節(jié)的取樣測(cè)定的基質(zhì)蔗糖酶取均值，分別和中的蔗糖酶變化對(duì)比；(2)不同季節(jié)時(shí)期堆肥多酚氧化酶或過氧化物酶活性的變化取0.75gK2Cr207溶于 1L0. 5N的HCl (相當(dāng)于50ml乙醚中含5mg紫色沒食子素)；取重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0. 5N HCl稀釋成各種不同濃度；定容后，在分光光度計(jì)上于430nm處比色測(cè)定；以光密度值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)不同季節(jié)時(shí)期堆肥脲酶活性的變化取0、1、3、5、7、9、11、131111氮工作液，移于501111 容量瓶中，然后加蒸餾水至20mL ；再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻， 20min后顯色，定容，Ih內(nèi)在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)578nm處比色，根據(jù)吸光值與氮溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不同季節(jié)時(shí)期堆肥中酶的測(cè)定方法，其特征在于分別在春、夏、秋、冬四個(gè)不同季節(jié)時(shí)期采集0～20cm的新鮮堆肥樣，將采集的堆肥樣品，放在蔭涼處，攤開晾干，然后剔出植物殘?bào)w，石塊和其它的雜物，過2-5mm篩孔的土樣用來測(cè)定堆肥中的酶活性。本發(fā)明探索了四個(gè)不同季節(jié)時(shí)期堆肥中酶的種類和性質(zhì)，篩選出酶活性較高的，微生物生長(zhǎng)發(fā)育較好季節(jié)時(shí)期的堆肥菌種，一方面為生活垃圾堆肥在微域營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)方面研究提供依據(jù)，另一方面為生活垃圾堆肥中提取出的微生物菌種在草坪建植體系中的安全有效利用提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102175681SQ20111003702
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者多立安, 王晶晶, 趙樹蘭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)