專利名稱：一種曲霉免疫優(yōu)勢抗原及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫診斷領(lǐng)域，涉及一種曲霉免疫優(yōu)勢抗原及用途。更具體而言，本發(fā)明涉及新鑒定的一種曲霉抗原，這些煙曲霉抗原能與侵襲性曲霉病病人血清中的特異性抗體發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)。通過基因重組技術(shù)，用原核細(xì)胞表達(dá)體系獲得重組蛋白。本發(fā)明還涉及這種免疫優(yōu)勢抗原在侵襲性曲霉病血清學(xué)診斷中的用途。
背景技術(shù)：
侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，ΙΑ)屬于感染性疾病，是一種嚴(yán)重的、 死亡率高的真菌感染。近年來，這種感染的發(fā)病率明顯上升，成為血液病、器官移植、骨髓移植、艾滋病、自身免疫病等免疫功能低下的患者重要死因，也是重癥監(jiān)護(hù)病人、大手術(shù)后病人、導(dǎo)管留置病人的重要并發(fā)癥。多種曲霉都可引起侵襲性曲霉病，如煙曲霉、黑曲霉、土曲霉、黃曲霉和構(gòu)巢曲霉等，其中煙曲霉感染占曲霉病的90% [1]。在血液惡性腫瘤患者中，曲霉病的發(fā)生率為5-25%，在異體造血干細(xì)胞移植受者中發(fā)生率為8-15%，在實(shí)體器官移植受者中為5% -15%。由于抗生素的濫用及激素類藥物的廣泛使用，甚至在免疫功能正常者，侵襲性曲霉病發(fā)病率也在上升。侵襲性曲霉病患者的病死率高達(dá)30-80%，不治療死亡率幾乎達(dá)100%。研究表明，如果能夠早期做出病原學(xué)診斷，在患者的臨床癥狀還不十分嚴(yán)重時就開始抗曲霉治療，則患者的存活率會提高到80% β]，因此早期診斷、早期治療對提高侵襲性曲霉病患者的生存率具有重要意義。然而，侵襲性曲霉病的病原學(xué)診斷一直是臨床上的難題。目前常用于真菌感染的診斷方法包括真菌顯微鏡檢查和培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、血清學(xué)檢測檢測曲霉代謝產(chǎn)物、 以及特異性病原體基因檢測，等等。但是目前已有的這些用于診斷侵襲性曲霉病的方法效果還不理想。臨床標(biāo)本真菌培養(yǎng)需要至少2周時間，且血培養(yǎng)的陽性率一般低于5% ω。我們曾用煙曲霉感染家兔，造成家兔彌散性煙曲霉感染模型，采集血樣進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果證實(shí)， 雖然感染動物器官組織內(nèi)有大量病灶，但血培養(yǎng)煙曲霉卻陰性Μ。組織病理學(xué)的診斷需活檢取材，對多數(shù)患者來說比較困難，可行性差；基因診斷方法檢測DNA，對其他病原體而言， 具有快速、靈敏的特點(diǎn)，但由于曲霉胞壁厚實(shí)堅(jiān)韌，DNA提取困難[5]，不易得到陽性結(jié)果 ’另一方面，由于空氣中存在大量煙曲霉孢子，容易在實(shí)驗(yàn)操作中造成污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[6’7]；因此，到目前為止，測定曲霉DNA的PCR方法還未被臨床實(shí)驗(yàn)室采用。近期研究證明，以測定真菌抗原、抗體和循環(huán)代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)的血清學(xué)診斷方法潛力較大[8 11]。曲霉在體內(nèi)發(fā)生侵襲性感染時，由孢子狀態(tài)延伸生長成菌絲，此時向體液中釋放菌絲蛋白，并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。鑒于曲霉感染的這個特征，一般認(rèn)為，血循環(huán)中抗原或特異抗體水平上升，預(yù)示著菌絲體延伸和/或曲霉感染的發(fā)展。由于曲霉蛋白質(zhì)成分復(fù)雜，而且基礎(chǔ)疾病、前期用藥不同的病人其機(jī)體處于不同免疫狀態(tài)，導(dǎo)致體內(nèi)曲霉抗原、 抗體種類和量也有差別。因此，作為實(shí)驗(yàn)室診斷用的目標(biāo)抗原和抗體，應(yīng)該選擇在不同免疫狀態(tài)的的病人罹患侵襲性曲霉病時，在其體內(nèi)優(yōu)勢大量表達(dá)、并能夠強(qiáng)烈刺激人體產(chǎn)生抗體的曲霉蛋白質(zhì)抗原組分。迄今，國內(nèi)外對這些優(yōu)勢抗原組分的認(rèn)識很少。
參考文獻(xiàn)1.Bellocchio S, Bozza S, Montagnoli C, et al. Immunity to Aspergillus fumigatus :the basisfor immunotherapy and vaccination. Medical Mycology. 2005, 43 (Si) :S181-S1882. Caillot D,Casanovas O,Bernard A,et al. Improved management of invasive pulmonaryaspergillosis in neutropenic patients using early thoracic compted tomographic scan andsurgery. J clin oncol. 1997,15 (1) :139-147.3. Tarrand JJ, Lichterfeld M, Warraich I，et al. Diagnosis of invasive septate mold infections. Am J Clin Pathol. 2003,119(6) :854-858.4.周萬青，李芳秋，王立魁，等.煙曲霉深部感染家兔模型的建立.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24 O) 86-885.周萬青，李芳秋，王立魁，等.不同破壁方法提取真菌DNA的比較.臨床檢驗(yàn)雜志，2009，27 (3) :212-214.6. Hope WW, Denning Dff. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis.2005，5(10) :609-622.7. Viscoli C, Machetti M, Cappellano P, et al. False-positive galactomannan Plsteliaaspergillus test results for patients receiving piperacillin-tazobactam. Clin Infect Dis. 2004,38 (15) :913-9168. Pfeiffer CD, Fine JP, Safdar N. Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannanassay :a meta-analysis. Clin Infect Dis.2006,42 (10) 1417-14279. Khan ZU, Ahmad S, Theyyathel AM. Detection of Aspergillus fumigatus-specific DNA, (1-3)-b-D-glucan and galactomannan in serum and bronchoalveolar lavage specimens ofexperimentalIy infected rats. Mycoses. 2008, 51(2) :129-13510.Einsele H, Loeffler J. Contribution of new diagnostic approaches to antifungal treatmentplans in high-risk haematology patients. Clin Microbiol Infect. 2008,14(S4) :37-45.11.李芳秋，周萬青，史利寧，等.煙曲霉分泌蛋白抗體的ELISA檢測及診斷價值評估.臨床檢驗(yàn)雜志，2010, ) =107-109

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題提供一種能與侵襲性曲霉病病人血清中的特異性抗體發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)的曲霉免疫優(yōu)勢抗原。本發(fā)明另一個目的是提供上述曲霉免疫優(yōu)勢抗原的用途。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種曲霉免疫優(yōu)勢抗原，該抗原為曲霉硫氧還蛋白還原酶、果糖二磷酸醛縮酶、肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白VIP1、分泌型二肽基肽酶中的一種或多種。所述的曲霉免疫優(yōu)勢抗原，該抗原為曲霉硫氧還蛋白還原酶。
一種曲霉免疫優(yōu)勢抗原，該抗原為上述曲霉硫氧還蛋白還原酶的基因重組蛋白即基因重組曲霉硫氧還蛋白還原酶。上述曲霉免疫優(yōu)勢抗原在制備侵襲性曲霉病的診斷試劑中的應(yīng)用。一種侵襲性曲霉病的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述曲霉免疫優(yōu)勢抗原中的一種或多種。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述基因重組曲霉硫氧還蛋白還原酶。本發(fā)明利用具有代表性的侵襲性曲霉病病人血清中的特異性抗體，通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對煙曲霉抗原成分進(jìn)行識別，再通過生物信息學(xué)技術(shù)分析，篩選鑒定出四個不同優(yōu)勢抗原蛋白，包括硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase GliT)、果糖二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase, class II)、肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白 VIPl (actincytoskeleton protein(VIPl))、分泌型二肽基肽酶(secreted dip印tidy 1 peptidase DppV)。最后通過基因重組技術(shù)，用原核細(xì)胞表達(dá)體系獲得一種重組蛋白。本發(fā)明還涉及這種曲霉免疫優(yōu)勢抗原在侵襲性曲霉病的診斷中的應(yīng)用。進(jìn)一步，本發(fā)明的技術(shù)方案首先篩選了多例病理組織學(xué)檢查和真菌培養(yǎng)均證實(shí)為侵襲性曲霉病(IA)的確診病人，并用煙曲霉抗原包被的ELISA法證實(shí)抗體為陽性。其次用 ELISA法和Wfestern blot法比較了煙曲霉菌體抗原和分泌抗原的免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)分泌蛋白與IA確診病人血清的免疫反應(yīng)性明顯高于菌體抗原，而與正常對照血清的反應(yīng)均為陰性。最后，對分泌蛋白進(jìn)行二維電泳0-DE)分離，并與確診IA病人血清進(jìn)行免疫印跡，通過質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)技術(shù)鑒定有免疫反應(yīng)的蛋白點(diǎn)，鑒定的一組新抗原即為本發(fā)明的煙曲霉免疫優(yōu)勢抗原。以下是本發(fā)明的具體技術(shù)措施1、選擇一組共781例病人共1099份血清，其中8例是確診為IA的病人，6例血清用于篩選鑒定新的免疫優(yōu)勢抗原。其他病例為臨床診斷IA33例，擬診IA 189例，排除IA 551例。以上所有血清標(biāo)本用來考查新鑒定出的抗原作為血清學(xué)試劑檢測病人標(biāo)本的診斷效果；2、比較煙曲霉菌體抗原和分泌抗原的免疫反應(yīng)性；3、對分泌蛋白進(jìn)行二維電泳分離，并與確診IA病人血清進(jìn)行免疫印跡，通過質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)技術(shù)鑒定有免疫反應(yīng)的蛋白點(diǎn)；4、從上述方法中鑒定出的新的抗原蛋白中，優(yōu)選下列4個中的一個或多個，即硫氧還蛋白還原酶、果糖二磷酸醛縮酶、肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白VIP1、分泌型二肽基肽酶為所述的煙曲霉免疫優(yōu)勢抗原。5、通過基因重組技術(shù)，克隆上述硫氧還蛋白還原酶蛋白質(zhì)的基因，用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，獲得重組蛋白。6、用上述重組蛋白抗原作為試劑，檢測上述病人血清，考查在診斷侵襲性煙曲霉感染中的應(yīng)用價值。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用一種快捷有效地篩選煙曲霉免疫優(yōu)勢抗原的方法，并鑒定了一組新的煙曲霉抗免疫優(yōu)勢抗原。本發(fā)明新鑒定的煙曲霉優(yōu)勢抗原，能被多數(shù)侵襲性煙曲霉感染病人血清中特異性抗體識別。用上述反應(yīng)最強(qiáng)的免疫優(yōu)勢抗原硫氧還蛋白還原酶蛋白的基因
5序列，制備出的基因重組抗原，用于檢測侵襲性煙曲霉感染病人血清，取得理想結(jié)果，其診斷敏感性為48. 9 % 85. 1 %，特異性為83. 5 % 86. 9 %。


圖1是煙曲霉抗原蛋白SDS-PAGE電泳以及與人血清的免疫印跡結(jié)果。其中=Lane1 菌體蛋白，Lane 2 分泌蛋白，Lane M 蛋白 Marker ；A =SDS-PAGE 電泳，B 與確診IA病人血清的免疫印跡，C 與健康對照血清的免疫印跡。圖2是6例確診IA病人血清與曲霉分泌蛋白的免疫印跡結(jié)果。圖3是曲霉分泌蛋白雙向電泳以及與病人及健康人免疫印跡結(jié)果。其中A :2-DE銀染圖；B 與確診病人的免疫印跡結(jié)果；C 與健康對照血清的免疫印跡結(jié)果。Lane M 蛋白Marker (在圖3A左側(cè))。圖4是硫氧還蛋白還原酶質(zhì)譜鑒定圖譜。圖5是PCR和雙酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+) /GliT電泳圖。其中Lanel :2000bp DNA marker ；Lane2 重組表達(dá)質(zhì)粒；Lane3 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；Lane4 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖6是重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/GliT在E. coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)。其中LaneM蛋白質(zhì) marker，Lanel :IPTG 誘導(dǎo)的 pEI^8a(+)/GliT 轉(zhuǎn)化菌，Lane2 未加誘導(dǎo)劑的陽性克隆，Lane3純化的重組蛋白。圖7是煙曲霉硫氧還蛋白還原酶重組蛋白與確診IA病人免疫印跡結(jié)果。其中LaneM 蛋白質(zhì)marker，Lanel 6確診IA病人血清，Lane7健康人血清對眧。另，圖1、圖3A、圖6中marker數(shù)值均X IO30
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例一病人標(biāo)本來源、診斷標(biāo)準(zhǔn)1.病人標(biāo)本來源收集781例患者的1099份血清標(biāo)本，分別來自南京及周邊地區(qū) 26家醫(yī)院的血液科、呼吸科、ICU病房、腫瘤科、腎臟病科、風(fēng)濕免疫科。男484例，女297例， 年齡18-99歲。這些病人的基礎(chǔ)疾病為惡性血液病如急慢性白血病、重型再障、惡性淋巴瘤等及造血干細(xì)胞移植術(shù)后230例，慢性肺病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性支氣管炎、 支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核及重癥肺炎等247例，自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、皮肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等47例，腎臟病如腎病綜合癥、急慢性腎功能衰竭、急慢性腎炎等36例，惡性腫瘤如肺癌、食道癌、肝癌、腸癌等及術(shù)后35例，肝、腎、肺移植術(shù)后31例，其他疾病巧5例。所有血液樣本均于采血Mh內(nèi)分離出血清，-70°C保存。2.病人診斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲癌癥治療組織及真菌病研究組(E0RTC/MSG)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)及中國侵襲性肺部真菌感染工作組制訂的侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)，將診斷分為確診、臨床診斷、擬診及排除IA。①確診至少符合1項(xiàng)宿主因素，肺部感染的1項(xiàng)主要或2項(xiàng)次要臨床特征，肺組織標(biāo)本用組織病理學(xué)或細(xì)胞化學(xué)方法檢出菌絲或球形體(非酵母菌的絲狀真菌)，并發(fā)現(xiàn)伴有相應(yīng)的肺組織損害。肺組織標(biāo)本、胸液或血液霉菌培養(yǎng)陽性。②臨床診斷至少符合1項(xiàng)宿主因素，肺部感染的1項(xiàng)主要或2項(xiàng)次要臨床特征，合格痰液經(jīng)直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，二次培養(yǎng)出曲霉，或支氣管肺泡灌洗液直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲或培養(yǎng)出曲霉。③擬診至少符合1項(xiàng)宿主因素，肺部感染的1項(xiàng)主要或2項(xiàng)次要臨床特征。④非IA組不滿足上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者。原發(fā)患者可無宿主因素。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，781例患者中，確診為IA 8例，臨床診斷IA33例，擬診IA 189例，排除IA 551例。 另收集200名正常人血清作為對照。3.病人分組根據(jù)患者的基礎(chǔ)疾病及是否接受影響免疫功能的藥物分三組，A組為惡性血液病及造血干細(xì)胞移植術(shù)后(HSCT)組(共230例，其中真菌感染92例)，B組為非惡性血液病及非HSCT但使用了影響免疫功能藥物的患者組(共154例，其中真菌感染57 例)，C組為非惡性血液病及非HSCT且未使用影響免疫功能藥物的患者組(共397例，其中真菌感染81例)。實(shí)施例二煙曲霉免疫優(yōu)勢抗原篩選方法1.菌株與培養(yǎng)條件煙曲霉Al為中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心保藏的標(biāo)準(zhǔn)菌株，保藏號為CMCC(F)Ala。真菌于沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分生孢子懸于0. 9% NaCl (含0. 1 % Tween 80)，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。2.菌體蛋白和分泌蛋白的制備將2X IO7煙曲霉分生孢子分別接種于YEPG培養(yǎng)基，37°C 150rpm震蕩培養(yǎng)若干天。取培養(yǎng)上清和菌絲用于制備真菌抗原。菌體蛋白的制備將培養(yǎng)物過濾，收集菌絲，PBS洗滌數(shù)次后，經(jīng)液氮充分研磨，用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取蛋白；即50mg菌體蛋白中加入500μ 1 TCA/丙酮蛋白沉淀液(含13. 3% TCA和 0. 093%的β -巰基乙醇的丙酮)，_20°C放置2h，14000 Xg離心5分鐘，沉淀用冰冷的丙酮洗3次，室溫干燥30分鐘后，溶于蛋白裂解液(7M尿素，2%SDQ。分泌蛋白的制備將培養(yǎng)物過濾，收集上清，加入4倍體積的TCA/丙酮沉淀液，其余操作步驟同菌體蛋白的提取。 Bradford法定量蛋白濃度，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。3.用煙曲霉分泌蛋白進(jìn)行ELISA測定病人血清提取的煙曲霉分泌蛋白用包被液 (pH 9. 6碳酸鹽緩沖液)稀釋至lyg/ml，加入ELISA反應(yīng)板，IOOyl/孔，4°C冰箱過夜。用
0.01mol/L PBS洗滌3次，1分鐘/次，將上述病人781例血清做適當(dāng)稀釋(血清稀釋液為含0. l%Tween-20和1 %小牛血清的PBS緩沖液)后，加入反應(yīng)板，100 μ 1/孔，每個稀釋度均設(shè)復(fù)孔，每板均設(shè)陽性、陰性和空白對照。37°C溫育45分鐘，同上洗滌。加1 10000稀釋的HRP-兔抗人IgG，37°C溫育45分鐘，同上洗滌，加TMB-過氧化脲溶液，100 μ 1/孔，顯
色15分鐘，以2mol/L H2S0450 μ 1/孔終止反應(yīng)，測定450nm處吸光度(A)。結(jié)果以[+2S即
1.03為臨界值(cutoff值)，A > 1. 03為抗體水平升高。4.從全部病例中篩選6例經(jīng)病理組織學(xué)和真菌培養(yǎng)確診為侵襲性曲霉病(IA)的病人(表1)，并經(jīng)ELISA法證實(shí)抗煙曲霉抗體水平升高的血清，用于免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析。5.免疫印跡法比較煙曲霉菌體抗原和分泌抗原的免疫反應(yīng)性 煙曲霉菌體蛋白和分泌蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，按0. 8mA/cm2膠經(jīng)半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。浸入50g/L脫脂奶粉緩沖液中，在室溫震搖狀態(tài)下封閉1小時。將轉(zhuǎn)印蛋白的硝酸纖維膜裁剪成條，分別與1 1000稀釋的健康人血清以及6例確診IA病人血清在4 °C反應(yīng)過夜，PBS-T洗膜3次，每次10分鐘。加入 HRP標(biāo)記的羊抗人Ig G(1 2000) 37 °C 1小時，PBS-T洗膜3次，每次10分鐘。加入
6. 二維電泳O-DE)分離煙曲霉分泌蛋白A.上樣煙曲霉在YEPG基質(zhì)中培養(yǎng)14天分泌蛋白150 μ g加入相應(yīng)體積的IPG (固相PH梯度)Buffer以及水化液至終體積350 μ 1，平鋪在膠條槽中，撕去Mcm IPG膠條的保護(hù)膜，將膠條凝膠面向下小心放入膠條槽中均勻覆蓋上樣液，在膠條上方加入適量凝膠條覆蓋液后蓋上膠槽蓋(注意放入膠條時避免在膠條下產(chǎn)生氣泡)。注水化液成份8M尿素，2% 3-[(3_膽酰胺丙基)_ 二乙胺]-丙磺酸，20mM 二硫蘇糖醇0.5% (ν/ν)B.第一向等電聚焦設(shè)置IPGphor儀器運(yùn)行參數(shù)①低電壓水化，30v 6h ；60v 6h;②升壓，500v Ih ； IOOOv Ih ；③等電聚焦，8000v約10h。待Mcm膠條等電聚焦達(dá)到 80000vhr,第一向等電聚焦結(jié)束。C.膠條的平衡取出剛剛等電聚焦完畢的IPG膠條，放入IOml含二硫蘇糖醇(DTT) (w/v, g/ml)的膠條平衡緩沖液中，于搖床上輕微振蕩平衡15分鐘；后在IOml含 2.5% (w/v)碘乙酰胺的膠條平衡緩沖液中，于搖床上輕微振蕩15分鐘。取出膠條，在SDS 電泳緩沖液中稍微清洗一下，濾紙吸干多余水分。D.第二向SDS-PAGE電泳配制12. 5 %的SDS聚丙烯酞胺分離凝膠，水飽和正丁醇封壓，凝固后用電泳緩沖液沖洗膠面3次。將平衡好的IPG膠條小心地置于SDS-PAGE凝膠的頂端，輕輕排除氣泡，使膠條與凝膠表面緊密接觸。將蛋白Marker加于濾紙上，置于膠條的的酸性端。用低熔點(diǎn)瓊脂封膠液凝固后，進(jìn)行第二向電泳，先按每塊膠IOmA電泳30分鐘， 然后按每塊膠20mA電泳直至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)凝膠底部時，終止電泳。7.免疫印跡A.半干轉(zhuǎn)印將裁好的PVDF膜用甲醇浸泡后，兩蒸水沖洗數(shù)次，于轉(zhuǎn)膜緩沖液中搖 30分鐘。依次鋪好濾紙/凝膠/PVDF膜/濾紙，趕走氣泡，確保沒有短路，緩沖液用量適中。 180mA轉(zhuǎn)印池。轉(zhuǎn)印完成后，凝膠置于銀染固定液中固定過夜；PVDF膜置于50g/L脫脂奶粉緩沖液，于搖床上室溫封閉lh。B.免疫印跡封閉好的PVDF膜分別與多位健康人混合血清以及多位確診IA病人混合血清(1 1000稀釋)4°C反應(yīng)過夜，PBS-T洗膜3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的羊
ECL (enhancedchemiluminescence reagent,Amersham Biosciences) Il影液Il影。結(jié)果 病人血清的與分泌蛋白免疫反應(yīng)性強(qiáng)于菌體蛋白(圖1，B)，健康人血清與兩種蛋白的反應(yīng)很少(圖1，C)。從圖2可見，6例病人血清都與煙曲霉分泌蛋白免疫反應(yīng)，大部分反應(yīng)強(qiáng)的蛋白質(zhì)分子量在30-55kDa之間。表16例確診IA病人的基本特征抗人 IgG(l 2000 稀釋)37°C lh，PBS-T 洗膜 3 次，每次 10 分鐘。ECL(Amersham)顯影。8.硝酸銀染色A.固定將轉(zhuǎn)印后的凝膠置于固定液中固定過夜(50ml冰醋酸，200ml無水乙醇， 加去離子水至500ml)。B.敏化固定結(jié)束后敏化30分鐘(150ml無水乙醇，1. 57g硫代硫酸鈉.5H20，34g 無水醋酸鈉，加去離子水至500ml)。C.水洗500ml去離子水洗3次，5分鐘/次。D.銀染銀染20分鐘(硝酸銀1.25g，加去離子水定容至500ml，臨用前加甲醛 100 μ 1)。Ε.水洗500ml去離子水洗3次，5分鐘/次。F.顯色加入顯色液顯色至蛋白點(diǎn)顯影滿意，一般為5-10分鐘(12. 5g無水碳酸鈉，加去離子水定容至500ml，臨用前加甲醛100 μ 1)。G.終止加入終止液終止10分鐘(甘氨酸2g，加去離子水定容至500ml)。
H.保存10 %乙醇保存待用。9.圖像掃描與分析染色后的雙向電泳凝膠采用Imagekarmer掃描儀進(jìn)行掃描， 數(shù)字化圖像文件用Amersham Pharmaeia公司的ImageMaster 2D Platinum軟件進(jìn)行凝膠的數(shù)據(jù)分析。圖像分析過程包括蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測、量化、背景扣除、點(diǎn)的匹配(Match)、 建立平均凝膠等。蛋白質(zhì)點(diǎn)自動檢測后，與免疫印跡圖像匹配前，先選取一些匹配點(diǎn) (seedmatches)，然后自動匹配其他蛋白質(zhì)點(diǎn)。10.膠內(nèi)酶切A.先將膠用去離子水洗10分鐘，3次。B.用切膠專用移液器，直徑1. 5mm的塑料吸頭，從銀染膠上將對應(yīng)于免疫印跡陽性反應(yīng)點(diǎn)的蛋白質(zhì)點(diǎn)取下，盡可能將目的點(diǎn)取完整，共取出40個蛋白質(zhì)點(diǎn)，放入預(yù)先編號
的96孔板中。
C.每孔加50 μ 1乙腈，室溫脫水5分鐘，吸去乙腈。
D.加50 μ 1 IOmM DTT，56°C還原Ih ；加碘乙酰胺避光常溫放置45分鐘。
E.用50 μ 1 25mM碳酸氫胺洗5分鐘，加50 μ 1乙腈脫水，抽真空干燥。
F.每個膠粒加入2-3 μ 1 lOng/μ 1的胰酶溶液，37°C過夜。
G.力口 10 μ 1 2%三氟乙酸終止酶解反應(yīng)。
11.MALDI-T0F質(zhì)譜分析酶解樣本上樣，用已知肽混合物作為外標(biāo)。用UltrafIexII
型培養(yǎng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-T0F)質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics，德國)上測定，電離模式為正離子模式，分辨率達(dá)15000-20000，質(zhì)量準(zhǔn)確度小于0. IDa0
12.數(shù)據(jù)庫查詢所得肽質(zhì)量指紋譜(PMF)用FleXAnalySiS2.4軟件處理。肽段檢測算法為SNAP算法，信噪比(S/N)的閾值為3，質(zhì)量因子的閾值為50，用胰蛋白酶 (porcinetrypsin, promega)的自角軍片段(trypsin[108-115] ,842. 509 ；trypsin[58-77], 2211. 104)作為內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)。用檢索軟件Mascot 2. 1. 03對檢測得到的PMF圖譜進(jìn)行檢索。 數(shù)據(jù)庫選NCBhr，種屬選煙曲霉，作用酶trypsin，1個誤切，肽段分子量最大允許誤差范圍 lOOppm，氨基酸固定修飾方式選Carbamidomethyl(c)，可變修飾選Oxidation (M)，蛋白質(zhì)整個序列覆蓋率至少15%，至少有5個肽匹配。
二維電泳銀染結(jié)果及免疫印跡的結(jié)果見圖3。共取40個蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，成功鑒定了 39個免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，代表17種蛋白質(zhì)，13種蛋白質(zhì)的分子量在30-55kDa之間，與I-DE的結(jié)果相一致。在鑒定出的17種蛋白質(zhì)中，有2個為已知抗原，15個為新發(fā)現(xiàn)的免疫原性蛋白，包括硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductaseGliT)、FTVD f衣賴型氧化還原8| (FAD dependent oxidoreductase, putative) > 延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase FahA)、醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenaseAldA)、芳香氨基轉(zhuǎn)移酶(aromatic a otransferase Aro8)、果糖二磷酸酸縮酶(fructose-bisphosphate aldolase, class II)、G 蛋白復(fù)合體 β 亞基(G-protein comlpex betasubunit CpcB)、肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白 VIPl (actin cytoskeleton protein(VIPl))、phytanoyl_CoA二氧酶(phytanoyl-CoA dioxygenase family)、果膠酸裂合酶A(peCtate lyaseA)、尿酸鹽氧化酶(urate oxydase UaZ)、3_羥丁酰輔酶A脫氫酶(3 -hydroxybutyryl-CoAdehydrogenase)、蛋白Sl體組分 Pre8 (proteasome component Pre8, putative)(aspartyl aminopeptidase)禾口一^^^^胃胃白(hypothetical protein)。這些蛋白質(zhì)點(diǎn)的具體標(biāo)注見圖3，蛋白質(zhì)詳細(xì)信息見表2。且在新發(fā)現(xiàn)的免疫原性蛋白中，2號蛋白(共13個蛋白點(diǎn))免疫反應(yīng)最強(qiáng)，鑒定結(jié)果為硫氧還蛋白還原酶，其質(zhì)譜鑒定圖譜見圖4。實(shí)施例三煙曲霉硫氧還蛋白還原酶基因克隆1.菌株、載體與工具酶煙曲霉Al標(biāo)準(zhǔn)株來自中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心，保藏號為CMCC(F)Ala。;pEI^8a(+)表達(dá)載體、PMD18-T克隆載體購自大連寶生物公司，宿主菌為E. coli JM109及E. coli BL21(DE3)；限制性內(nèi)切酶Nde I及BamH I、T4 連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、切膠回收試劑盒均購自大連寶生物公司； Taq DNA polymerase、總RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑盒均購自Promega公司。2.引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genbank上已報(bào)道的煙曲霉GliT編碼序列，使用I^rimer 5軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，并在引物的5'端加入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)及若干保護(hù)堿基。上游引物5' -CACACATATGTCGATCGGCAAACTAC‘ (SEQ ID No. 1，劃線處為 Nde I 酶切位點(diǎn))， 下游引物5' -CGAATTCCTATAGCTCCTGATCGAGACG-3‘ (SEQ ID No. 2，劃線處為 EcoRl 酶切位點(diǎn))。引物由大連寶生物公司合成。3.煙曲霉總RNA的提取煙曲霉接種沙氏培養(yǎng)基于培養(yǎng)數(shù)天，收獲孢子并接種 YEPG培養(yǎng)液于振蕩培養(yǎng)2天。取濕重IOOmg煙曲霉菌絲，加Iml RNA提取試劑，加液氮研磨成細(xì)粉，再依次加入氯仿、異丙醇、75%乙醇等試劑，具體操作見提取試劑說明書。4.基因的擴(kuò)增以煙曲霉總RNA為模板，用Promega公司的RT-PCR試劑盒進(jìn)行 cDNA第一鏈的合成，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下RNA 1.8μ1， oligo(dT) 15Primer 1· O μ 1，H2O 7. 2 μ 1，70°C 10 分鐘，冰浴 5 分鐘；然后加 MgCl24. O μ 1， 10 X RT-PCR buffer 2. O μ l，dNTP 2 μ l、Rnase 抑制劑 1· O μ 1，AMV 酶 1· O μ 1，室溫放置 10 分鐘，42°C 30s, 95°C 5分鐘，冰浴5分鐘。基因擴(kuò)增的體系如下10XPCRbuffer 2. 5 μ 1、MgCl2L 5 μ 1、dNTP 0· 5 μ 1、煙曲霉GliT上下游引物各0.5 μ 1，Taq酶0.3μl、模板cDNAlμl、補(bǔ)無菌水至25μl.反應(yīng)參數(shù)為95°C變性5分鐘，以95°C變性45s、57°C退火45s、72°C延伸80s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。結(jié)果增出約IOOObp的DNA片段，雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/GliT(按實(shí)施例三-6制備)的酶切產(chǎn)物也為IOOObp左右，與預(yù)期片段的大小相符。5.克隆載體的構(gòu)建及鑒定10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化試劑盒回收目的片段，與PMD18-T載體連接，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。體系如下:pMD18-T1. 0 μ 1 (0. 03pmol)目的基因1· 6μ 1(0. 2pmol)反應(yīng)液(含連接酶)5·0μ1雙蒸水2. 4μ1反應(yīng)體積共10 μ 1。16°C反應(yīng)2小時以上。轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。涂布含0. lg/L氨芐西林的LB培養(yǎng)基過夜，對長出的菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選陽性克隆。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。挑取PCR陽性菌落接種LB培養(yǎng)液，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。經(jīng)過PCR和酶切鑒定的重組質(zhì)粒，經(jīng)DNA序列測定，與基因Bank注冊的該蛋白質(zhì)基因序列一致。6.表達(dá)載體的構(gòu)建用Nde I和EcoR I雙酶切重組質(zhì)粒pMD18_T/GliT，總反應(yīng)體積為100 μ 1，瓊脂糖凝膠電泳后，切下含目的基因的凝膠，按Takara試劑盒說明書回收目的基因，測定DNA液的濃度。按試劑盒說明提取質(zhì)粒pET28a(+)，Nde I和EcoR I雙酶切， 總反應(yīng)體積為100μ 1，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，操作步驟同上。取純化后的酶切載體與目的基因連接。連接體系如下目的 DNA 3. 0μ 1pET28a 1. 2μ 1buffer Ι.ΟμΙT4Ligase 0. 5 μ 1無菌水 4. 3μ 116°C連接過夜，轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。0. lg/L卡那霉素抗性篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽性克隆，用菌落PCR和雙酶切來鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒(見圖5)。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28a(+)/GliT0實(shí)施例四硫氧還蛋白還原酶基因的原核細(xì)胞表達(dá)和純化將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌，接種于含卡那霉素(0. lg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200r/分鐘振搖培養(yǎng)過夜。次日以1 50稀釋轉(zhuǎn)種于含卡那霉素(0. lg/L)的LB培養(yǎng)液中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液A6tltl 0. 6時，取出ImL菌液不加誘導(dǎo)劑作為陰性對照，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)證。同時用含pET28a (+) 空載質(zhì)粒的BL21菌作為空白對照。取ImL菌液，5000rpm離心5分鐘，棄上清，50. 0 μ 1 1 X SDS凝膠上樣緩沖液充分重懸菌體，隔水煮沸5分鐘，12000rpm離心5分鐘，取8 μ 1上清進(jìn)行SDS-PAGE (濃縮膠50g/L,分離膠120g/L)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色(圖3，lane 1， 2)。同上誘導(dǎo)重組融合蛋白表達(dá)。收集菌體并進(jìn)行超聲破碎處理，4°C 12000Xg離心20分鐘。按照TALON金屬親和層析柱說明書純化超聲裂解上清中的重組蛋白，用含有150mmol/ L咪唑的洗脫液洗脫，4°C平衡緩沖液透析除去咪唑。SDS-PAGE分析純化效果，Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(見圖6，lane 3)。實(shí)施例五煙曲霉硫氧還蛋白還原酶重組蛋白抗原性分析煙曲霉硫氧還蛋白還原酶重組蛋白免疫印跡鑒定蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳分離
11后，轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)印重組蛋白的硝酸纖維素膜用50g/L脫脂奶粉的PBS-T封閉過夜，PBS-T漂洗3次，分別與6名確診IA病人血清以及健康人血清(所有血清作1 1000稀釋)4°C反應(yīng)過夜，PBS-T洗膜3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的羊抗人Ig G(1 2000) 37°C lh, PBS-T洗膜3次，每次10分鐘。加入ECL顯影液顯影。結(jié)果示6例確診病人血清與重組蛋白的免疫印跡結(jié)果顯示強(qiáng)反應(yīng)，而健康對照血清幾乎不與重組蛋白反應(yīng)(見圖7)。實(shí)施例六硫氧還蛋白還原酶重組蛋白在測定病人血清抗體中的應(yīng)用以重組蛋白為包被抗原，用間接ELISA法測定IgG類特異抗體。用方陣滴定法選擇最佳反應(yīng)條件?？乖胮H9. 6,0. lmol/L NaHCO3稀釋，以0. 1 μ g/孔包被聚苯乙烯反應(yīng)板，4°C過夜。次日每孔加封閉液(含5. Og/L牛血清白蛋白、0. 28/1^鄉(xiāng)3的包被液)10(^1， 370C lh。用PBS-T洗3次，每次3分鐘；將待測血清用含10%小牛血清的PBS作系列稀釋， 加入微孔反應(yīng)板100 μ 1/孔，每一稀釋度均設(shè)復(fù)孔，37°C溫育45分鐘；PBS-T洗3次，每次 3分鐘；加HRP標(biāo)記羊抗人IgG抗體，370C 45分鐘；PBS-T洗3次，每次3分鐘；加入底物液 TMB-H2O2 顯色，37°C 15 分鐘，加終止液(2mol/L H2SO4) 50 μ 1/孔，于酶聯(lián)儀(Bio-Rad MAel 680型)上測450nm波長吸光度(A)。結(jié)果以 +兀即0. 6為臨界值(cutoff值)，A > 0. 6 為抗體水平升高。以值A(chǔ) > 0. 6為陽性標(biāo)準(zhǔn)，各組病人診斷的的敏感性、特異性見表3。表3不同患者組中抗體檢測的敏感性、特異性
權(quán)利要求
1.一種曲霉免疫優(yōu)勢抗原，該抗原為曲霉硫氧還蛋白還原酶、果糖二磷酸醛縮酶、肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白VIP1、分泌型二肽基肽酶中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的曲霉免疫優(yōu)勢抗原，其特征在于該抗原為曲霉硫氧還蛋白還原酶。
3.一種曲霉免疫優(yōu)勢抗原，該抗原為權(quán)利要求2所述曲霉硫氧還蛋白還原酶的基因重組蛋白。
4.權(quán)利要求1、2或3所述曲霉免疫優(yōu)勢抗原在制備侵襲性曲霉病的診斷試劑中的應(yīng)用。
5.侵襲性曲霉病的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求1、2或3所述曲霉免疫優(yōu)勢抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求3所述的曲霉免疫優(yōu)勢抗原。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫診斷領(lǐng)域，公開了一種曲霉免疫優(yōu)勢抗原及用途。該抗原為曲霉硫氧還蛋白還原酶、果糖二磷酸醛縮酶、肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白V1P1、分泌型二肽基肽酶中的一種或多種。該曲霉免疫優(yōu)勢抗原能與侵襲性曲霉病病人血清中的特異性抗體發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，可用于制備侵襲性曲霉病的診斷試劑。
文檔編號G01N33/569GK102174485SQ20111004072
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者史利寧, 李芳秋 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院