包含支原體抗原的免疫原性組合物的制作方法
【專利說明】包含支原體抗原的免疫原性組合物
【背景技術(shù)】
[0001] 支原體（Mycoplasma)屬菌屬于柔膜菌綱（Mollicutes)且代表一組源自厚壁菌門 (Firmicutes)譜系之生物體。柔膜菌綱系最小自主復制生物體，其在結(jié)構(gòu)上與其它真細菌 之不同之處在于其缺少細胞壁。業(yè)內(nèi)認為其單膜表面系在復雜免疫活性宿主環(huán)境中介導適 應及存活之關鍵界面。此外，柔膜菌綱具有小基因組及數(shù)目有限之代謝路徑。因此，亦將支 原體屬成員描述為"最小自我復制生物體"。然而，盡管其非常簡單，多種支原體菌系人類及 多種動物之病原體。與其它毒力主要取決于毒素、侵襲素及細胞溶素之病原性細菌相比，病 原性支原體菌似乎不具有該等典型主要毒力因子（Chambaud，I.等人，2001，Nucleic Acids Res. 29:2145-2153, Fraser 等人，1995, Science 270:397-403)。目前可獲得之對容許病原 性支原體引起宿主細胞損傷、發(fā)炎及疾病之分子機制及效應物之了解極少。
[0002] 病原性支原體主要引起人類及動物之非典型肺炎、泌尿生殖道感染及 關節(jié)炎（Blanchard, A?及 G.F.Browning(編輯）.2005.Mycoplasmas:Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U. K. ；Kobisch M.及 Friis N. F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605)。已知該等癥狀之再活化或加重會反復并逐漸轉(zhuǎn)變成慢性疾病， 且因此藉由早期診斷及早期治療預防或治療加重或再活化非常重要。豬肺炎支原體 (M. hyopneumoniae)系地方性肺炎之病因。在豬中，其因體重增長降低及飼料效率低而系 最常見且經(jīng)濟上最重要之疾病之一。該疾病引起肺損害、慢性咳嗽、毛色無光、生長遲滯及 持續(xù)數(shù)周之不興旺外觀。肺損害、尤其在腹側(cè)頂葉及心葉中之損害之特征在于上皮細胞增 生及單核細胞之血管周及細支氣管周累積增加。豬呼吸道之另一常見支原體豬鼻支原體 (M. hyorhinis)可引起仔豬之多發(fā)性衆(zhòng)膜炎及關節(jié)炎。豬滑液支原體（M. hyosynoviae) - 般位于扁桃體中且可引起關節(jié)炎疾病，從而導致經(jīng)濟損失。豬滑液支原體系自關節(jié)及咽/ 扁桃體樣品分離且可在血液及關節(jié)液中誘導抗體。牛支原體（Mbovis)被認為系致病性更 強之支原體物種中之一者且在世界上造成顯著經(jīng)濟損失。支原體引起所有年齡之牛之嚴重 臨床病征。牛支原體系發(fā)現(xiàn)引起牛之肺炎、乳腺炎及關節(jié)炎之最常見支原體病原體，且其病 因?qū)W作用與母牛及公牛之耳炎、角膜結(jié)膜炎、滑膜炎及生殖障礙有關。
[0003] 由于支原體缺少細胞壁，許多靶向細胞壁合成之常見抗生素（例如青霉素或其它 0 _內(nèi)酰胺抗生素）對其無影響。實際使用之支原體感染之治療劑系一些抗生素，例如基于 大環(huán)內(nèi)酯或基于新喹諾酮或基于四環(huán)素之抗生素，但該等抗生素具有嚴重不良效應，例如 抗藥性菌株之出現(xiàn)，其導致支原體感染變嚴重同時預期治療效應不足，且成為轉(zhuǎn)變成慢性 疾病的病因。
[0004] 此外，疫苗接種系控制支原體感染之有效方法。先前文獻中已闡述有效抵抗若干 種支原體菌之疫苗。W02009058833 (A2)例示性地闡述用于疫苗接種之減毒無毒力牛支原體 菌菌株。此外，W02009126356(A2)闡述抵抗豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae)之 免疫原性組合物。然而，業(yè)內(nèi)需要針對多種病原體提供保護之有效組合疫苗。業(yè)內(nèi)非常需 要該等組合疫苗來使針對多種病原體提供保護所需之免疫數(shù)目降至最低，降低施用成本， 并提高接受率及覆蓋率。然而，抗原干擾問題使多組份疫苗之研發(fā)更加復雜。特定而言，抗 原干擾系指觀察到施用多種抗原經(jīng)常導致對某些抗原之反應相對于在個別施用該等抗原 時觀察到之免疫反應有所減小。
[0005] 因此，業(yè)內(nèi)需要針對多種病原體提供保護之有效組合疫苗。
[0006] 發(fā)明詳沐
[0007] 在闡述本發(fā)明各方面之前，必須注意，除非上下文明確指示其它含義，否則如在本 文中及在隨附申請專利范圍中使用之單數(shù)形式"一（a) "、"一（an)"及"該（the)"包括復 數(shù)。因此，例如，在提及"一抗原"時包括復數(shù)種抗原，在提及"細胞"時系指一或多個細胞 及本領域技術(shù)人員已知之其等效物，等等。除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術(shù)及 科學術(shù)語皆具有熟習本發(fā)明所屬領域技術(shù)者一般理解之相同意義。盡管在本發(fā)明之實踐或 測試中可使用任何與本文所述之方法及材料類似或等效之彼等，但現(xiàn)在闡述較佳方法、裝 置及材料。本文所提及之所有出版物皆系以引用方式并入本文中，用于闡述及揭示該等出 版物中所報導可結(jié)合本發(fā)明使用之細胞系、載體及方法之目的。本文中所有內(nèi)容皆不應視 為承認該揭示內(nèi)容由于先前發(fā)明而有資格先于本發(fā)明。
[0008] 本發(fā)明解決先前技術(shù)中固有之問題并提供技術(shù)現(xiàn)況之獨特進步。概言之，本發(fā)明 提供免疫原性組合物，其包含：a) -或多種豬滑液支原體抗原及一或多種選自由豬肺炎支 原體及豬鼻支原體組成之群之抗原及其組合；以及b)醫(yī)藥上可接受之載劑。
[0009] 此外，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含：a) -或多種豬鼻支原體抗原及一或 多種豬滑液支原體抗原；以及b)醫(yī)藥上可接受之載劑。
[0010] 有利地，本發(fā)明所提供之實驗數(shù)據(jù)揭示本文所提供免疫原性組合物之功效及沒有 抗原干擾。特定而言，在施用包含豬鼻支原體、豬肺炎支原體及豬滑液支原體抗原之免疫原 性組合物后，已顯示關于豬鼻支原體及豬肺炎支原體之功效沒有干擾。
[0011] 因此，根據(jù)一方面，本申請?zhí)峁┟庖咴越M合物，其包含a) -或多種豬鼻支原體 抗原；一或多種豬滑液支原體抗原；b) -或多種豬肺炎支原體抗原；以及c)醫(yī)藥上可接受 之載劑。
[0012] 術(shù)語"免疫原性組合物"系指包含至少一種抗原之組合物，其引發(fā)被施用該免疫原 性組合物之宿主之免疫反應。該免疫反應可為細胞和/或抗體介導之針對本發(fā)明免疫原性 組合物之免疫反應。該宿主亦被稱為"對象"。較佳地，本文所闡述或提及之任一宿主或?qū)?象系動物。
[0013] 通常，"免疫反應"包括（但不限于）以下效應中之一或多者：特異性指向本發(fā)明 免疫原性組合物中所包括抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞和/或細胞毒 性T細胞和/或y - S T細胞之產(chǎn)生或活化。較佳地，宿主將展示保護性免疫反應或治療反 應。
[0014] "保護性免疫反應"將顯示為受感染宿主通常展示之臨床病征之減少或缺少、較短 恢復時間和/或縮短之感染性持續(xù)時間或組織或體液中降低之病原體效價或受感染宿主 之排泄。
[0015] 若宿主展示保護性免疫反應而使得對新感染之抗性將增強和/或疾病之臨床嚴 重度降低，則將免疫原性組合物稱為"疫苗"。
[0016] 術(shù)語"感染"或"受感染的"系指對象被病原體（即豬鼻支原體或豬鼻支原體及豬 滑液支原體或豬鼻支原體、豬肺炎支原體及豬滑液支原體）感染。
[0017] "治療反應"將顯示為在宿主已被通常引起臨床病征之病原體（例如支原體）感染 時該宿主通常展示之該（等）臨床病征之減少和/或治愈。
[0018] 術(shù)語"支原體"為本領域技術(shù)人員已知。"支原體"系指一細菌屬，例如如以下 文獻中所述：Blanchard, A?及 G.F. Browning(編輯）? 2005. Mycoplasmas:Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham ILK. ；Kobisch M.及 Friis N. F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15,1569-1605?？苫诩毦锘瘜W及微生物性質(zhì)以及其形態(tài)對其加以分類。該 等分類準則為業(yè)內(nèi)所熟知。一般而言，支原體感染與本說明中其它地方闡述之臨床病征有 關。
[0019] 如本文所用術(shù)語"支原體"系指豬鼻支原體，或豬鼻支原體及豬滑液支原 體，或豬鼻支原體、豬肺炎支原體及豬滑液支原體。豬鼻支原體之全基因組序列例示 性地由例如 Liu, W.等人，J. Bacteriol. 2010,第 192 卷（21)，5844-45doi : 10. 1128/ JB. 00946-10. Epub 2010 年8 月 27 日或Calcutt MJ.等人，2012, J. Bacteriol?，第 194 卷（7)，1848doi :10. 1128/JB. 00033-12提供。豬滑液支原體之分離物例示性地以登錄號 ATCC 25591或ATCC 27095存放于美國組織培養(yǎng)物保藏中心（American Tissue Culture Collection)。豬肺炎支原體之分離物例示性地以登錄號ATCC 25095、ATCC 25617及ATCC 25934存放于美國組織培養(yǎng)物保藏中心。豬肺炎支原體J-菌株之基因組DNA以登錄號ATCC 25934D存放于美國組織培養(yǎng)物保藏中心。
[0020] 如本文所用"抗原"系指（但不限于）引發(fā)宿主對包含該抗原或其免疫活性組份 之所關注免疫原性組合物或疫苗之免疫反應之組份?？乖蛎庖呋钚越M份可為完整微生物 (呈滅活或改良活形式）或其任何碎片或部分，若將其施用宿主可引發(fā)宿主之免疫反應?？?原可為或可包含呈其原始形式或作為所謂改良活疫苗（MLV)中之減毒生物體之完整的活 生物體?？乖蛇M一步包含該等生物體之適當組件（亞單位疫苗），其中該等組件系藉由以 下方式來生成：破壞完整生物體或該等生物體之生長培養(yǎng)物且實施后續(xù)純化步驟以產(chǎn)生期 望結(jié)構(gòu)；或藉由對適宜系統(tǒng)（如但不限于細菌、昆蟲、哺乳動物或其它物種）進行適當操作 來誘導合成過程，且隨后視情況實施分離及純化程序；或藉由使用適宜醫(yī)藥組合物直接加 入遺傳物質(zhì)在需要疫苗之動物中誘導該等合成過程（多核苷酸疫苗接種）?？乖砂?謂的死菌疫苗（KV)中之藉由適當方法滅活之完整生物體。若生物體系細菌，則死菌疫苗稱 為死菌苗（bacterin)。
[0021] 術(shù)語"醫(yī)藥上可接受之載劑"包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、穩(wěn)定劑、稀釋 劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑、佐劑、免疫刺激劑及其組合。
[0022] 在本發(fā)明之一方面中，一或多種抗原系完整滅活死菌苗。一或多種完整滅活抗原 可為選自由以下組成之群之完整滅活死菌苗：豬鼻支原體；豬滑液支原體；豬肺炎支原體； 豬鼻支原體及豬滑液支原體；及豬鼻支原體、豬肺炎支原體及豬滑液支原體。
[0023] 因此，根據(jù)一方面，本申請?zhí)峁┟庖咴越M合物，其包含a) -或多種豬鼻支原體 抗原；及一或多種豬滑液支原體抗原；及b)醫(yī)藥上可接受之載劑，其中豬鼻支原體；豬滑液 支原體；或豬鼻支原體及豬滑液支原體抗原系完整滅活死菌苗。
[0024] 根據(jù)另一方面，本申請?zhí)峁┟庖咴越M合物，其包含a) -或多種豬鼻支原體抗 原；一或多種豬滑液支原體抗原及一或多種豬肺炎支原體抗原；b)醫(yī)藥上可接受之載劑， 其中豬鼻支原體、豬滑液支原體和/或豬肺炎支原體抗原系完整滅活死菌苗。本發(fā)明之此 方面涵蓋，豬鼻支原體抗原系完整滅活死菌苗，或豬肺炎支原體抗原系完整滅活死菌苗，或 豬滑液支原體抗原系完整滅活死菌苗。然而，本發(fā)明之此方面亦涵蓋本發(fā)明免疫原性組合 物中之所有抗原皆系完整滅活死菌苗，即豬鼻支原體及豬滑液支原體抗原或豬鼻支原體、 豬肺炎支原體及豬滑液支原體抗原系完整滅活死菌苗。
[0025] 任何習用滅活方法皆可用于本發(fā)明之目的。因此，滅活可藉由本領域技術(shù)人員已 知之化學和/或物理處理來實施。較佳滅活方法包括添加環(huán)化二乙烯亞胺（BEI)，包括添 加已環(huán)化為二乙烯亞胺（BEI)之2-溴乙烯胺氫溴化物（BEA)。其它較佳化學滅活劑包含 (但不限于）曲拉通（Triton)X-100、脫氧膽酸鈉、溴化十六烷基三甲銨、0-丙內(nèi)酯、硫柳 采（Thimerosal)、酷及甲醛（福爾馬林）。然而，滅活亦可包含中和步驟。較佳中和劑包括 (但不限于）硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及諸如此類。
[0026] 較佳福爾馬林滅活條件包括介于約0.02% (v/v) -2.0% (v/v)之間、更佳約 0? 1 % (v/v) - I. 0 % (v/v)、更佳約 0? 15 % (v/v) - 0? 8 % (v/v)、甚至更佳約 0? 16 % (v/ v) -0.6% (v/v)且最佳約0.2% (v/v) -0.4% (v/v)之福爾馬林濃度。培育時間取決于 支原體之抗性。一般而言，實施滅活過程直至在適宜培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測不到支原體生長。
[0027] 在本發(fā)明之一方面中，完整滅活死菌苗系福爾馬林滅活死菌苗，較佳使用如上文 所述之濃度。因此，根據(jù)一方面，本申請?zhí)峁┟庖咴越M合物，其包含a) -或多種豬鼻支原 體抗原；及一或多種豬滑液支原體抗原；及b)醫(yī)藥上可接受之載劑，其中一或多種抗原系 完整滅活死菌苗，且其中一或多種完整滅活死菌苗系福爾馬林滅活死菌苗。根據(jù)另一方面， 該免疫原性組合物進一步包含一或多種豬肺炎支原體抗原。本發(fā)明之此方面涵蓋，豬鼻支 原體抗原系福爾馬林滅活死菌苗，或豬肺炎支原體抗原系福爾馬林滅活死菌苗，或豬滑液 支原體抗原系福爾馬林滅活死菌苗。然而，本發(fā)明之此方面亦涵蓋，本發(fā)明免疫原性組合物 中之所有支原體抗原皆系福爾馬林滅活死菌苗，即豬鼻支原體及豬滑液支原體抗原或豬鼻 支原體及豬肺炎支原體及豬滑液支原體抗原系福爾馬林滅活死菌苗。
[0028] 可使用已知技術(shù)將本發(fā)明滅活死菌苗組份納入脂質(zhì)體中，例如 Nature, 1974, 252, 252-254 或 Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13 中所述之技術(shù)。 在本發(fā)明之另一實施例中，可將本發(fā)明滅活死菌苗組份偶聯(lián)至適宜生物化合物，例如多糖、 肽、蛋白質(zhì)或諸如此類或其組合。
[0029] 在另一方面中，如本文所提供之免疫原性組合物可有效治療和/或預防有需要對 象中由豬鼻支原體引起之臨床病征。因此，根據(jù)一方面，本申請?zhí)峁┟庖咴越M合物，其包 含a) -或多種豬鼻支原體抗原；及一或多種豬滑液支原體抗原；及b)醫(yī)藥上可接受之載 劑，其中免疫原性組合物可有效治療和/或預防有需要對象中由豬鼻支原體引起之臨床病 征。根據(jù)另一方面，該免疫原性組合物進一步包含一或多種豬肺炎支原體抗原。根據(jù)另一 方面，一或多種支原體抗原系如上文所述該等支原體之完整滅活死菌苗。
[0030] 在另一方面中，如本文所提供且亦包含一或多種豬肺炎支原體抗原之免疫原性組 合物可有效治療和/或預防有需要對象中由豬肺炎支原體引起之臨床病征。因此，根據(jù)一 方面，本申請?zhí)峁┟庖咴越M合物，其包含a) -或多種豬鼻支原體抗原；一或多種豬滑液 支原體抗原；b) -或多種豬肺炎支原體抗原；及c)醫(yī)藥上可接受之載劑，其中該免疫原性 組合物可有效治療和/或預防有需要對象中由豬肺炎支原體引起之臨床病征。根據(jù)另一方 面，該免疫原性組合物可有效治療和/或預防有需要對象中由豬鼻支原體及豬肺炎支原體 引起之臨床病征。根據(jù)另一方面，一或多種支原體抗原系如上文所述該等支原體之完整滅 活死菌苗。
[0031] 術(shù)語"治療和/或預防"系指減小畜群中具體支原體感染之發(fā)病率或降低由具體 支原體感染引起或與該感染相關之臨床病征之嚴重度。因此，術(shù)語"治療和/或預防"亦系 指減小畜群中受具體支原體菌感染之動物數(shù)（=減小具體支原體感染之發(fā)病率），或與動 物未接受如本文所提供免疫原性組合物之動物組相比，在動物已接受有效量之該免疫原性