一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫分析和生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，其公開了一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，用于快速檢測禽白血病病毒抗原。其制作方案是：以玻碳電極為工作電極，將 β -CD/MWCNTs對其進(jìn)行修飾，然后依次加入金剛烷甲酸/捕獲抗體Ab1、牛血清白蛋白、禽白血病病毒抗原以及 β -CDFe3O4SiO2-Fc/Ab2溶液。 β -CDFe3O4SiO2-Fc由于氧化鐵納米材料超順磁性的特點(diǎn)，產(chǎn)品易于分離；利用環(huán)糊精具有超分子識別特性的特點(diǎn)，可以通過主客體作用捕獲大量二茂鐵甲酸Fc，具有良好的生物相容性以及水溶性，從而有利于抗體檢測量的提高，實(shí)現(xiàn)了較高的靈敏度，檢測限可低至0.33pg/mL。
【專利說明】一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫分析與生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于P-CTOFe3O4OS12-Fc的電化學(xué)免疫傳感器的制備及應(yīng)用，研制一種快速檢測禽白血病病毒抗原的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。

【背景技術(shù)】
[0002]禽白血病病毒是以主要引起禽各種造血細(xì)胞腫瘤性增生為特征的一類反錄病毒群，其中J亞群禽白血病病毒ALV-J作為一類主要感染肉用型雞的反轉(zhuǎn)錄病毒，自上世紀(jì)九十年代以來，對全世界范圍內(nèi)的禽類動物造成了巨大影響，引起了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前已經(jīng)有一系列分析方法致力于ALV-J的檢測，例如免疫組織化學(xué)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及表面等離子體共振等。然而，這些方法往往耗時過長，相比之下，夾心型電化學(xué)免疫分析憑借其預(yù)處理簡單、檢測周期短、成本低和靈敏度高的特點(diǎn)，已成為定量檢測的一個重要分析技術(shù)。
[0003]本發(fā)明以β -環(huán)糊精功能化的羧基化多壁碳納米管復(fù)合材料β -⑶/MWCNTs修飾的玻碳電極作為金剛烷甲酸/捕獲抗體Ab1的固載界面，氨基化環(huán)糊精修飾的二氧化硅包裹的氧化鐵負(fù)載二茂鐵甲酸Fe核殼納米材料氨基-β -⑶OFe3O4OS12-Fc來標(biāo)記檢測抗體，構(gòu)建一種用于檢測禽白血病病毒抗原的夾心型免疫傳感器。首先，β -CD/MWCNTs憑借其良好的電導(dǎo)性提高了電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率并以其大的比表面積的特點(diǎn)大大提高了一抗的負(fù)載量。其次，核殼納米材料氨基-⑶OFe3O4IiS12-Fc增加了其分子識別的特性，其表面可進(jìn)而形成穩(wěn)定的CD-Fc主客體包合配合物合，為與二抗的結(jié)合提供更大的自由空間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的免疫傳感器對J亞群禽白血病病毒ALV-J的檢測在0.001?15 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)，其檢測限低至0.33 pg/mL。實(shí)際檢測呈現(xiàn)出良好的選擇性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]1.一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.Γ1鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于80 mV ；
(2)將pH7.0,0.1 mo I/L的磷酸鹽緩沖溶液分散的β -⑶/MWCNTs修飾于玻碳電極表面，室溫干燥，所述β -CD/MWCNTs的濃度為0.5?2.5 mg.mL—1 ；
(3)滴涂金剛烷甲酸/捕獲抗體Ab1于電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干；
(4)滴涂3PL、100μg.mL—1的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
(5)滴涂6PL、0.001?15 ng.mL 1的禽白血病病毒抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液于電極表面,4°C下濕潤條件下晾干；
(6)滴涂6μ?的β-CDOFe3O4OSi02-Fc/Ab2溶液至電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，制得一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器。
[0005]2.所述 β -CDOFe3O4OS12-FcAb2 溶液的制備方法
(1)核殼納米材料氨基-β-CDOFe3O4IgS12-Fc的制備
將2.5?3.5g的Fe3O4.7H20與4.0g的Fe2 (SO4) 3溶解于裝有200mL超純水的500mL燒瓶中，加入50mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25?28 %的氨水調(diào)節(jié)pH為10，恒溫45?55 °C條件下攪拌I h，冷卻至室溫；加入8?12 mL的四乙基原硅酸鹽TE0S，攪拌16?20 h，離心分離，50°C真空干燥12h，制得 Fe3O4OS12 ；
取0.08?0.12g Fe3O4OS12與0.1 mL氨丙基三乙氧基硅烷APTES及1mL甲苯相混合，110 °C回流1.5 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離，得到的產(chǎn)物依次用甲醇和乙醇洗滌:Γ4次，真空干燥12 h，制得氨基化Fe3O4OS12 ；
將40?60 mg的氨基化Fe3O4OS12分散至ImL無水乙醇中，加入250?350 μ?、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛，室溫下攪拌6?10 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離；加入If 22 mg氨基化P-環(huán)糊精β -⑶，5mL超純水?dāng)嚢柽^夜；磁分離,加入5.8^6.2 mg 二茂鐵甲酸Fe混合,加入10mL、體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇水溶液混合，得到混合液；超聲10 min，磁力攪拌6 h，磁分離后將所得產(chǎn)物進(jìn)行真空干燥，制得氨基化盧-CDOFe3O4IgS12-Fc ；
(2)氨基化盧-CDOFe3O4OSi02-Fc/Ab2制備
將3.5?4.5mg氨基化β -CDOFe3O4IgS12-Fc分散于ImL的ρΗ7.0的PBS溶液中，超聲，得到氨基化β -CDOFe3O4IgS12-Fc懸浮液，加入1mg的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和1mg的N-羥基丁二酰亞胺NHS，室溫震蕩15 min,加入0.5 mL、8(Tl20μ g ?mL—1的檢測抗體Ab2溶液，4°C下，振蕩孵化12?24 h，離心棄去上層液，用pH=7.0的PBS溶液洗滌分離，加入200μ? PBS溶液，置于4 °C冰箱中備用。
[0006]3.禽白血病病毒抗原檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器為工作電極，在10 mL>40^60 mmol/L的pH6.0 ^ 8.0磷酸鹽緩沖溶液中測定其電流變化；
(2)根據(jù)所得電流差值與禽白血病病毒抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線.(3 )依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中禽白血病病毒抗原的檢測，檢測結(jié)果從工作曲線中查得。
[0007]本發(fā)明具備的優(yōu)勢
(1)本發(fā)明快速、準(zhǔn)確，不需前處理，可用于禽血清樣品中的禽白血病病毒的檢測；
(2)本發(fā)明采用環(huán)糊精功能化的氨基化Fe3O4OS12，通過交聯(lián)劑戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，由于氧化鐵納米材料超順磁性的特點(diǎn)，產(chǎn)品易于分離；利用環(huán)糊精具有超分子識別特性的特點(diǎn)，可以通過與二茂鐵甲酸的主客體作用在其疏水性內(nèi)腔的捕獲大量二茂鐵甲酸，具有良好的生物相容性、水溶性以及穩(wěn)定性，從而有利于抗體檢測量的提高；
(3)環(huán)糊精的外腔表面具有親水性的特點(diǎn)，利用環(huán)糊精功能化的多壁碳納米管，使其更易分散在水中，同時利用多壁碳納米管高比表面積的特點(diǎn)，通過環(huán)糊精內(nèi)腔主客體作用捕獲大量金剛烷甲酸功能化的抗體，提高了本發(fā)明傳感器的靈敏度，使檢測限可低至0.33pg/mL ； (4)本發(fā)明印刷電極制備簡單、成本低、便于攜帶、試劑消耗少，且對環(huán)境無污染，符合當(dāng)今提倡環(huán)保的趨勢，易于微型化和集成化，可應(yīng)用在眾多領(lǐng)域。

【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1核殼納米材料氨基-β -⑶OFe3O4OS12-Fc的制備
將2.5g的Fe3O4.7H20與4.0g的Fe2 (SO4) 3溶解于裝有200mL超純水的500mL燒瓶中，加入50mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %的氨水調(diào)節(jié)pH為10，恒溫45 °C條件下攪拌I h，冷卻至室溫；加入8 mL的四乙基原硅酸鹽TE0S，攪拌16 h，離心分離，50°C真空干燥12h，制得Fe3O4O
S12；
取0.08g Fe3O4OS12與0.1 mL氨丙基三乙氧基硅烷APTES及1mL甲苯相混合，110 V回流1.5 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離，得到的產(chǎn)物依次用甲醇和乙醇洗滌3次，真空干燥12h，制得氨基化Fe3O4OS12 ；
將40 mg的氨基化Fe3O4OS12分散至ImL無水乙醇中，加入250?350 μ?、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛，室溫下攪拌6 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離；加入18 mg氨基化P-環(huán)糊精P-⑶，5mL超純水?dāng)嚢柽^夜；磁分離，加入5.8 mg 二茂鐵甲酸Fe混合，加入10mL、體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇水溶液混合，得到混合液；超聲10 min，磁力攪拌6 h，磁分離后將所得產(chǎn)物進(jìn)行真空干燥，制得氨基化A-CD@Fe304@Si02-Fc。
[0009]實(shí)施例2核殼納米材料氨基-β -⑶OFe3O4OS12-Fc的制備
將3.5g的Fe3O4.7Η20與4.0g的Fe2 (SO4) 3溶解于裝有200mL超純水的500mL燒瓶中，加入50mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28 %的氨水調(diào)節(jié)pH為10，恒溫55 °C條件下攪拌I h，冷卻至室溫；加入12 mL的四乙基原硅酸鹽TE0S，攪拌20 h，離心分離，50°C真空干燥12h，制得Fe3O4O
S12；
取0.12g Fe3O4OS12與0.1 mL氨丙基三乙氧基硅烷APTES及1mL甲苯相混合，110 V回流1.5 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離，得到的產(chǎn)物依次用甲醇和乙醇洗滌4次，真空干燥12h，制得氨基化Fe3O4OS12 ；
將60 mg的氨基化Fe3O4OS12分散至ImL無水乙醇中，加入350 μ?、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛，室溫下攪拌6?10 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離；加入22 mg氨基化P-環(huán)糊精P-⑶，5mL超純水?dāng)嚢柽^夜；磁分離，加入6.2 mg 二茂鐵甲酸Fe混合，加入10mL、體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇水溶液混合，得到混合液；超聲10 min，磁力攪拌6 h，磁分離后將所得產(chǎn)物進(jìn)行真空干燥，制得氨基化A-CD@Fe304@Si02-Fc。
[0010]實(shí)施例3 氨基化 β -CDOFe3O4OSi02-Fc/Ab2 制備
將3.5mg氨基化β -CDOFe3O4IgS12-Fc分散于ImL的ρΗ7.0的PBS溶液中，超聲，得到氨基化β -CD@Fe304@Si02-Fc懸浮液，加入1mg的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和1mg的N-羥基丁二酰亞胺NHS，室溫震蕩15 min,加入0.5 mL、8(^g -πιΓ1的檢測抗體Ab2溶液，4°C下，振蕩孵化12 h，離心棄去上層液，用pH=7.0的PBS溶液洗滌分離，加入200μ? PBS溶液，置于4 °C冰箱中備用。
[0011 ]實(shí)施例 4 氨基化 β -CDOFe3O4OS12-FcAb2 制備
將4.5mg氨基化β -CDOFe3O4IgS12-Fc分散于ImL的ρΗ7.0的PBS溶液中，超聲，得到氨基化β -CDOFe3O4IgS12-Fc懸浮液，加入1mg的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和1mg的N-羥基丁二酰亞胺NHS，室溫震蕩15 min,加入0.5 mL、120 μδ ?πιΓ1的檢測抗體Ab2溶液，4°C下，振蕩孵化12?24 h，離心棄去上層液，用pH=7.0的PBS溶液洗滌分離，加入200μ? PBS溶液，置于4 °C冰箱中備用。
[0012]實(shí)施例5禽白血病病毒抗原的檢測方法
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器為工作電極，在10 mL、40 mmol/L的pH6.0磷酸鹽緩沖溶液中測定其電流變化；
(2)根據(jù)所得電流差值與禽白血病病毒抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線.(3 )依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中禽白血病病毒抗原的檢測，檢測結(jié)果從工作曲線中查得。
[0013]實(shí)施例6禽白血病病毒抗原的檢測方法
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器為工作電極，在10 mL>40^60 mmol/L的pH6.0 ^ 8.0磷酸鹽緩沖溶液中測定其電流變化；
(2)根據(jù)所得電流差值與禽白血病病毒抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線.(3 )依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中禽白血病病毒抗原的檢測，檢測結(jié)果從工作曲線中查得。
【權(quán)利要求】
1.一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol.Γ1鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于80 mV ； (2)將pH7.0,0.1 mo I/L的磷酸鹽緩沖溶液分散的β -⑶/MWCNTs修飾于玻碳電極表面，室溫干燥，所述β -CD/MWCNTs的濃度為0.5?2.5 mg.mL—1 ； (3)滴涂金剛烷甲酸/捕獲抗體Ab1于電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干； (4)滴涂3PL、100μg.mL—1的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下濕潤條件下晾干； (5)滴涂6PL、0.001?15 ng.mL 1的禽白血病病毒抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液于電極表面,4°C下濕潤條件下晾干； (6)滴涂6μ?的β-CDOFe3O4OSi02-Fc/Ab2溶液至電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，制得一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器的制備方法，所述β-CDOFe3O4OS12-FcAb2溶液的制備方法，步驟如下: (1)核殼納米材料氨基-β-CDOFe3O4IgS12-Fc的制備 將2.5?3.5g的Fe3O4.7H20與4.0g的Fe2 (SO4) 3溶解于裝有200mL超純水的500mL燒瓶中，加入50mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25?28 %的氨水調(diào)節(jié)pH為10，恒溫45?55 °C條件下攪拌I h，冷卻至室溫；加入8?12 mL的四乙基原硅酸鹽TE0S，攪拌16?20 h，離心分離，50°C真空干燥12h，制得 Fe3O4OS12 ； 取0.08?0.12g Fe3O4OS12與0.1 mL氨丙基三乙氧基硅烷APTES及1mL甲苯相混合，110 °C回流1.5 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離，得到的產(chǎn)物依次用甲醇和乙醇洗滌:Γ4次，真空干燥12 h，制得氨基化Fe3O4OS12 ； 將40?60 mg的氨基化Fe3O4OS12分散至ImL無水乙醇中，加入250?350 μ?、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛，室溫下攪拌6?10 h，用強(qiáng)力磁鐵進(jìn)行磁分離；加入If 22 mg氨基化P-環(huán)糊精β -⑶，5mL超純水?dāng)嚢柽^夜；磁分離,加入5.8^6.2 mg 二茂鐵甲酸Fe混合,加入10mL、體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇水溶液混合，得到混合液；超聲10 min，磁力攪拌6 h，磁分離后將所得產(chǎn)物進(jìn)行真空干燥，制得氨基化盧-CDOFe3O4IgS12-Fc ； (2)氨基化盧-CDOFe3O4OSi02-Fc/Ab2制備 將3.5?4.5mg氨基化β -CDOFe3O4IgS12-Fc分散于ImL的ρΗ7.0的PBS溶液中，超聲，得到氨基化β -CDOFe3O4IgS12-Fc懸浮液，加入1mg的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和1mg的N-羥基丁二酰亞胺NHS，室溫震蕩15 min,加入0.5 mL、8(Tl20Kg.mL—1的檢測抗體Ab2溶液，4°C下，振蕩孵化12?24 h，離心棄去上層液，用pH=7.0的PBS溶液洗滌分離，加入200μ? PBS溶液，置于4 °C冰箱中備用。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器，用于禽白血病病毒抗原檢測，其特征在于，包括如下步驟: (1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的一種禽白血病病毒抗原免疫傳感器為工作電極，在10 mL>40^60 mmol/L的pH6.0 ^ 8.0磷酸鹽緩沖溶液中測定其電流變化； (2)根據(jù)所得電流差值與禽白血病病毒抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線.(3)依據(jù)工作曲線的繪制方法進(jìn)行樣品中禽白血病病毒抗原的檢測，檢測結(jié)果從工作曲線中查得。
【文檔編號】G01N33/569GK104459123SQ201410726834
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】顏兆慶, 魏琴, 高健, 吳丹, 閆濤, 張鐵, 范大偉, 胡麗華 申請人:濟(jì)南大學(xué)