專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)臨床即時(shí)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條及其制 備方法，具體是涉及一種檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I的膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，全球每年有1700萬(wàn)人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗 死，我國(guó)急性心肌梗死發(fā)病率約為0. 02% 0. 06%，每年死于急性心肌梗死的人數(shù)超過(guò)了 100萬(wàn)，且發(fā)病人群出現(xiàn)“年輕化”趨勢(shì)，心腦血管疾病現(xiàn)已成為我國(guó)人口死亡的主要原因， 特別是由心肌梗死引起的缺血性心肌損傷的發(fā)病率逐年增加。因此早期對(duì)心肌損傷進(jìn)行診 斷和積極治療至關(guān)重要，專(zhuān)家指出，抓住胸痛發(fā)作后6小時(shí)的“黃金時(shí)間”是治療患者生命 的關(guān)鍵，cTnl因其出眾的靈敏度及特異性，目前已被作為心肌損傷診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，國(guó)內(nèi)外 將其廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死的診斷、溶栓再通的判斷、不穩(wěn)定型心絞痛危險(xiǎn)度分層及預(yù) 后判斷、急性心肌炎持續(xù)心肌損傷的臨床監(jiān)測(cè)等中。對(duì)心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)方法的很多，而免疫金標(biāo)法是九十后發(fā)展起來(lái)的，因其 快速，操作簡(jiǎn)便，試劑穩(wěn)定，可室溫儲(chǔ)運(yùn)，不易污染的特點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用。它是免疫親和技 術(shù)，印記技術(shù)，免疫標(biāo)記和層析技術(shù)的組合。將包被抗體，膠體金標(biāo)記抗體固相化，與樣本吸 附材料等組合在一起，制備出免疫層析診斷試條，使用時(shí)只需要將樣品溶液滴加在試紙條 上，10分鐘內(nèi)就可以判斷結(jié)果。由于膠體金存在靈敏度的問(wèn)題，目前還沒(méi)有進(jìn)一步提高膠體金靈敏度的方法。針 對(duì)于這種技術(shù)背景，我們?cè)诂F(xiàn)有的技術(shù)上開(kāi)發(fā)了雙放大系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙 條以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的靈敏度和特異性問(wèn)題。本發(fā)明的另一目的是提供該試紙條的制備方法。本發(fā)明的目的可采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條，包括試紙條底襯，以及試紙條底襯上順次相互 搭接粘貼的樣品墊、涂覆有金標(biāo)抗體的聚酯膜、包被膜及吸水紙，所述的包被膜中部平行設(shè) 有一條包被鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗體F(ab)2片段的檢測(cè)線(xiàn)和一條包被兔抗鼠IgG抗 體的控制線(xiàn)，所述的樣品墊中包被了待測(cè)抗原單克隆抗體F(ab)2片段-生物素，所述的金 標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記ftOteinA-待測(cè)抗原單克隆抗體。所述的鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗體的F (ab)2片段為鏈親和素與心肌肌鈣蛋 白I單克隆抗體的F(ab)2片段偶聯(lián)后的結(jié)合產(chǎn)物。所述的膠體金標(biāo)記ftOteinA-待測(cè)抗原單克隆抗體為膠體金標(biāo)記的ftOteinA-心 肌肌鈣蛋白I單克隆抗體。上述的膠體金試紙條的制備方法，包括如下步驟
1)制備包被膜，用包被緩沖液稀釋鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗體的F (ab)2片段 以及兔抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的二種抗體分別平行地噴于包被膜的中部，二種抗體滲 入包被膜后分別形成待測(cè)抗原檢測(cè)線(xiàn)和兔抗鼠IgG抗體的控制線(xiàn)；2)制備涂覆金標(biāo)抗體的聚酯膜由金顆粒標(biāo)記ftOteinA，通過(guò)ftOteinA與待測(cè)抗 原的單克隆抗體的Fc片段非特異性結(jié)合，將待測(cè)抗原的單克隆抗體間接結(jié)合在金顆粒上；3)制備待測(cè)抗原單克隆抗體F (ab)2片段-生物素包被的樣品墊；4)試紙條組裝。所述的鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗體的F (ab)2片段為鏈親和素與心肌肌鈣蛋 白I單克隆抗體的F(ab)2片段偶聯(lián)后的結(jié)合產(chǎn)物。步驟2)所述的金標(biāo)抗體為由膠體金顆粒標(biāo)記ftOteinA，通過(guò)ftOteinA與心肌肌 鈣蛋白I單克隆抗體的Fc段非特異性結(jié)合，將心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體放大的間接結(jié)合 在膠體金顆粒上。有益效果及其原理本發(fā)明的膠體金試紙條利用膠體金免疫層析技術(shù)，當(dāng)待測(cè)抗 原流經(jīng)樣品墊時(shí)，被樣品墊中的待測(cè)抗原單克隆抗體的F(ab)2片段-生物素的中的F(ab)2 片段捕獲，被F(ab)2片段捕獲的待測(cè)抗原流經(jīng)到聚酯膜上，待測(cè)抗原的另一個(gè)位點(diǎn)被聚酯 膜上涂覆的金標(biāo)抗體所捕獲，形成抗體-抗原-抗體的復(fù)合物。由于ftOteinA與待測(cè)抗原 的單克隆抗體的Fc段具有強(qiáng)烈的結(jié)合能力，本發(fā)明先利用膠體金標(biāo)記ftOteinA，然后再通 過(guò)ftOteinA與待測(cè)抗原的單克隆抗體的Fc段結(jié)合從而使待測(cè)抗原的單克隆抗體間接放大 結(jié)合在金顆粒上，這種結(jié)合方式能增強(qiáng)膠體金與待測(cè)抗原的單克隆抗體的結(jié)合力，克服常 規(guī)方法中因膠體金直接標(biāo)記待測(cè)抗原的單克隆抗體而引起的膠體金與待測(cè)抗原單克隆抗 體結(jié)合能力不強(qiáng)，以及單克隆抗體與待測(cè)抗原結(jié)合的位點(diǎn)容易被膠體金占據(jù)，造成特異性 性下降的缺陷。本發(fā)明金標(biāo)抗體的改進(jìn)，一方面可以大大提高靈敏度，另一方面可以提高特 異性，這是第一次放大?？贵w-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物在毛細(xì)效應(yīng)下向上層析，隨后生物素 會(huì)在與檢測(cè)線(xiàn)6中的鏈親合素結(jié)合，由于鏈親合素4個(gè)亞基能結(jié)合4個(gè)分子的生物素，因此 形成第二次放大。由于鏈親合素不易固定在硝酸纖維素包被膜上，而抗體片段可以很容易 固定在包被膜上。所以檢測(cè)線(xiàn)6中的待測(cè)抗原單克隆抗體的F(ab)2片段起到將鏈親合素 間接固定在包被膜上的作用。多余的金標(biāo)抗體繼續(xù)層析到控制線(xiàn)位置，由于鼠源心肌肌鈣 單克隆抗體和兔抗鼠IgG抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而使控制線(xiàn)因橋連膠體金而顯色，因此不 論樣品中是否含有待測(cè)抗原，只要試紙條能正常使用，控制線(xiàn)都會(huì)顯色。兩次放大能夠大大 提高靈敏度和特異性，為待測(cè)抗原的檢測(cè)和預(yù)見(jiàn)提供了更準(zhǔn)確的結(jié)果。該試紙條具有特異 性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，且不需使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡(jiǎn)單，能廣泛應(yīng) 用于待測(cè)抗原的檢測(cè)，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)和預(yù)見(jiàn)疾病，有效的進(jìn)行檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。


圖1本發(fā)明的膠體金試紙條的橫斷面結(jié)構(gòu)示意圖；其中1.底襯；2.樣品墊；3.聚酯膜；4.包被膜；5.吸水紙；6.檢測(cè)線(xiàn)；7.控制線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1如圖1所示，一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條，包括試紙條底襯1，以及試紙條底 襯1上順次相互搭接粘貼的樣品墊2、涂覆有金標(biāo)抗體的聚酯膜3、包被膜4及吸水紙5，包 被膜4上包被有檢測(cè)線(xiàn)6和控制線(xiàn)7，包被膜4中部平行設(shè)有一條包被鏈親和素-心肌肌鈣 蛋白I單克隆抗體4C2的F(ab)2片段的檢測(cè)線(xiàn)6和一條包被兔抗鼠IgG抗體的控制線(xiàn)7， 樣品墊2中包被了鼠源性心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體4C2的F(ab)2片段-生物素，金標(biāo)抗 體為由金顆粒標(biāo)記ftOteinA，通過(guò)ftOteinA與心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體M155的Fc段非 特異性結(jié)合，將心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體M155放大的間接結(jié)合在金顆粒上。以上鏈親和 素，4C2單克隆抗體，M155單克隆抗體，兔抗鼠IgG抗體均購(gòu)自Fitzgerald公司。膠體金試紙條的具體制備方法如下包被膜的制備包被緩沖液的制備將0. 025M，pH7. 4的PBS，用0. 22u膜過(guò)濾，置于4°C備用，有效
期7天。封閉液的制備將含1 % BSA, 1 %蔗糖，0. 025M, ρΗ7· 5的PBS,用0. 22U膜過(guò)濾，置
于4°C備用，有效期為3天。心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體4C2的F(ab)2片段的制備單克隆抗體4C2經(jīng)胰蛋白 酶酶切，過(guò)SPA-S印har0SeCL-4B凝膠層析柱除去Fc片段，收集F(ab)2片段。鏈親和素_F(ab)2片段的制備將鏈親和素和單克隆抗體4C2的F(ab)2片段通過(guò) 戊二醛化學(xué)偶聯(lián)，然后利用親和層析柱進(jìn)行純化得到。鏈親和素-F (ab) 2片段檢測(cè)線(xiàn)6的制備將抗體F (ab) 2片段按％ig/ml的濃度，蠕 動(dòng)泵授液量0. ^il/min，劃線(xiàn)速度50m/20min，在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí)?？刂凭€(xiàn)7的制備將兔抗鼠IgG抗體按8mg/ml的濃度，蠕動(dòng)泵授液量0. 4ml/min, 劃線(xiàn)速度50m/20min，在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí)。包被膜4制備用上述封閉液將含有檢測(cè)線(xiàn)6和控制線(xiàn)7的硝酸纖維素膜于37°C 封閉60分鐘，取出后置37°C下烘干處理兩個(gè)小時(shí)，封袋備用。涂覆金標(biāo)抗體的聚酯膜3的制備氯金酸水溶液的配制將IOg氯金酸IOOOml的三蒸水溶解，配成1 %的水溶液，置 于4°C備用，有效期3個(gè)月。檸檬酸三鈉的配制用三蒸水溶解檸檬酸三鈉，配成的水溶液，用0. 22U膜濾 過(guò)，置于4°C備用，有效期7天。1 %碳酸鉀水溶液的配制將Ig碳酸鉀用IOOml用三蒸水溶解，用0. 22U膜濾過(guò)， 置于4°C備用，有效期為7天。金標(biāo)抗體保存液的配制將15g的蔗糖，20ul的疊氮鈉，在IOOml的pH = 7. 4的 1 % BSA溶解，用0. 22U膜濾過(guò)，置于4°C備用，有效期為7天。膠體金的顆粒的制備用三蒸水將氯金酸稀釋成0. 01%，置于95°C反應(yīng)10分 鐘，加入Iml檸檬酸三鈉，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘，待膠體金溶液顏色由藍(lán)經(jīng)紫變紅后，冷卻后加 入aiill1^碳酸鉀溶液備用。外觀(guān)應(yīng)純凈，透亮，無(wú)沉淀和漂浮物。金標(biāo)抗體的制備用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至7. 5，按20微克ftOteinA/ ml的膠體金加入ftOteinA，混勻后反應(yīng)15分鐘，以IOOOOrpm離心10分鐘，去上清液，沉淀用BSA封閉洗滌兩次，最后一次去上清液，將沉淀用十分之一的pH = 7. 4的BSA溶 解，然后按5ug抗體/ml膠體金加入心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體，混勻反應(yīng)15分鐘，用標(biāo) 記洗滌液洗滌兩次，再用金標(biāo)抗體保存液溶解。置于4°C備用，有效期為7天。將標(biāo)記好的膠體金均勻的鋪在聚酯膜上，噴量為0. 9ul/cm*3道，干燥，封袋，備用。樣品墊的處理將樣品墊用IOOmMPBS緩沖液浸泡數(shù)小時(shí)，取出干燥后，按20ug_鼠 源性心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體4C2的F(ab)2片段-生物素/每根樣品墊O2mm*300mm) 的量噴涂鼠源性心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體4C2的F(ab)2片段-生物素。底襯1，樣品墊2和吸水紙5是本領(lǐng)域通用的部件。將上述樣品墊2、涂覆有金標(biāo) 抗體的聚酯膜3、包被膜4及吸水紙5順次相互搭接粘貼得到試紙板，最后將試紙板切割成 不同寬度的試紙條即可。上述的膠體金試紙條在檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I的應(yīng)用。本試紙條可以用來(lái)檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I的液體樣品，操作時(shí)，將全血、血漿或血清 滴加在本試紙條的樣品墊2上，當(dāng)出現(xiàn)的結(jié)果是在試紙條的檢測(cè)線(xiàn)6和控制線(xiàn)7位置上各 出現(xiàn)一條紫紅色條帶時(shí)，為陽(yáng)性結(jié)果，表明樣品中含有心肌肌鈣蛋白I ；僅試紙條的控制線(xiàn) 7位置上出現(xiàn)一條紫紅色條帶時(shí)，為陰性結(jié)果，表明樣品中含有心肌肌鈣蛋白I或其中所含 心肌肌鈣蛋白I的濃度在本試紙條的檢測(cè)下限以下；在試紙條的控制性8位置上未出現(xiàn)紫 紅色條帶時(shí)為無(wú)效結(jié)果。實(shí)施例2采用常規(guī)方法的膠體金試紙條的具體制備方法如下心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體4C2和M155(配對(duì)抗體)，均購(gòu)自Fitzgerald。包被膜的制備1)包被緩沖液的制備將0. 025M, ρΗ7· 4的PBS，用0. 22u膜過(guò)濾，置于4°C備用，
有效期7天。2)封閉液的制備將含1% BSA，蔗糖，0. 025M，pH7. 5的PBS，用0. 22U膜過(guò)濾，
置于4°C備用，有效期為3天。3)單克隆抗體4C2的F(ab)2段的制備單克隆抗體經(jīng)胰蛋白酶酶切，過(guò) SPA-SepharoseCL-4B凝膠層析柱除去Fc片段，收集F(ab)2片段。4)F(ab)2段檢測(cè)線(xiàn)6的制備將抗體按％ig/ml的濃度，蠕動(dòng)泵授液量0. 4ml/min, 劃線(xiàn)速度50m/20min，在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí)。5)控制線(xiàn)7的制備將兔抗鼠IgG抗體按8mg/ml的濃度，蠕動(dòng)泵授液量0. 4ml/ min，劃線(xiàn)速度50m/20min，在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí)。6)包被膜4制備用上述封閉液將含有檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)的硝酸纖維素NC膜于 37°C封閉60分鐘，取出后置37°C下烘干處理兩個(gè)小時(shí)，封袋備用。涂覆金標(biāo)抗體的聚酯膜的制備1)氯金酸水溶液的配制將IOg氯金酸IOOOml的三蒸水溶解，配成1 %的水溶液，
置于4°C備用，有效期3個(gè)月。2)檸檬酸三鈉的配制用三蒸水溶解檸檬酸三鈉，配成的水溶液，用0. 22U膜 濾過(guò)，置于4°C備用，有效期7天。3)1%碳酸鉀水溶液的配制將Ig碳酸鉀用IOOml用三蒸水溶解，用0. 22U膜濾過(guò)，置于4°C備用，有效期為7天。4)金標(biāo)抗體保存液的配制將15g的蔗糖，20ul的疊氮鈉，在IOOml的pH = 7. 4 的BSA溶解，用0. 22U膜濾過(guò)，置于4°C備用，有效期為7天。5)膠體金的顆粒的制備用三蒸水將氯金酸稀釋成0. 01%，置于95°C反應(yīng)10 分鐘，加入Iml檸檬酸三鈉，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘，待膠體金溶液顏色由藍(lán)經(jīng)紫變紅后，冷卻后 加入aiill1^碳酸鉀溶液備用。外觀(guān)應(yīng)純凈，透亮，無(wú)沉淀和漂浮物。6)金標(biāo)抗體的制備用1 %碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至7. 5，按20微克單克隆 抗體M155/ml的膠體金加入，混勻后反應(yīng)15分鐘，以IOOOOrpm離心10分鐘，去上清液，沉 淀用BSA封閉洗滌兩次，用標(biāo)記洗滌液洗滌兩次，再用金標(biāo)抗體保存液溶解，置于4°C備 用，有效期為7天。7)將標(biāo)記好的膠體金均勻的鋪在聚酯膜上，噴量為0.9ul/cm*3道，干燥，封袋，備用。底襯1，樣品墊2和吸水紙5是本領(lǐng)域通用的部件。將上述樣品墊2、涂覆有金標(biāo) 抗體的聚酯膜3、包被膜4及吸水紙5順次相互搭接粘貼得到試紙板，最后將試紙板切割成 不同寬度的試紙條即可。兩種方法靈敏度和特異性比較
權(quán)利要求
1.一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條，包括試紙條底襯，以及試紙條底襯上順次相互搭 接粘貼的樣品墊、涂覆有金標(biāo)抗體的聚酯膜、包被膜及吸水紙，其特征在于所述的包被膜中 部平行設(shè)有一條包被鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗體F(ab)2片段的檢測(cè)線(xiàn)和一條包被兔 抗鼠IgG抗體的控制線(xiàn)，所述的樣品墊中包被了待測(cè)抗原單克隆抗體？(油)2片段-生物素， 所述的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記ftOteinA-待測(cè)抗原單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條，其特征在于所述的鏈親和 素-待測(cè)抗原單克隆抗體的F (ab) 2片段為鏈親和素與心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的F (ab) 2 片段偶聯(lián)后的結(jié)合產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條，其特征在于所述的膠體金標(biāo)記 ftOteinA-待測(cè)抗原單克隆抗體為膠體金標(biāo)記的ftOteinA-心肌蛋白I單克隆抗體。
4.一種權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)制備包被膜，用包被緩沖液稀釋鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗體的F(ab) 2片段以及 兔抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的兩種抗體分別平行地噴于包被膜的中部，兩種抗體滲入包 被膜后分別形成待測(cè)抗原檢測(cè)線(xiàn)和兔抗鼠IgG抗體的控制線(xiàn)；2)制備涂覆金標(biāo)抗體的聚酯膜由金顆粒標(biāo)記ftOteinA，通過(guò)ftOteinA與待測(cè)抗原的 單克隆抗體的Fc片段非特異性結(jié)合，將待測(cè)抗原的單克隆抗體間接結(jié)合在金顆粒上；3)制備待測(cè)抗原單克隆抗體F(ab)2片段-生物素包被的樣品墊；4)試紙條組裝。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗 體的F(ab)2片段為鏈親和素與心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的F(ab)2片段偶聯(lián)后的結(jié)合產(chǎn) 物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟幻所述的金標(biāo)抗體為由膠體金顆 粒標(biāo)記ftOteinA，通過(guò)ftOteinA與心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的Fc段非特異性結(jié)合，將心 肌肌鈣蛋白I單克隆抗體放大的間接結(jié)合在膠體金顆粒上。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)臨床即時(shí)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條及其制備方法。一種雙放大系統(tǒng)的膠體金試紙條，包括試紙條底襯，以及試紙條底襯上順次相互搭接粘貼的樣品墊、涂覆有金標(biāo)抗體的聚酯膜、包被膜及吸水紙，所述的包被膜中部平行設(shè)有一條包被鏈親和素-待測(cè)抗原單克隆抗體F(ab)2片段的檢測(cè)線(xiàn)和一條包被兔抗鼠IgG抗體的控制線(xiàn)，所述的樣品墊中包被了待測(cè)抗原單克隆抗體F(ab)2片段-生物素，所述的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記ProteinA-待測(cè)抗原單克隆抗體。該試紙條具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，且不需使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡(jiǎn)單，能廣泛應(yīng)用于待測(cè)抗原的檢測(cè)，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)和預(yù)見(jiàn)疾病，有效的進(jìn)行檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102103145SQ201110044828
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者王勇, 王路海, 蘇恩本, 陳偉 申請(qǐng)人:南京基蛋生物科技有限公司