專利名稱：應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種激素類小分子物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)檢測(cè)克倫特羅的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
克倫特羅(Clenbuterol，CL)是一種β _2腎上腺素受體激動(dòng)劑，臨床上作為支氣管解痙藥物，最初用于治療哮喘病。當(dāng)其應(yīng)用劑量達(dá)到治療量的5 10倍時(shí)，克倫特羅可增強(qiáng)肌肉發(fā)育、降低脂肪含量，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其被大量應(yīng)用于畜牧業(yè)以提高瘦肉產(chǎn)率，俗名瘦肉精。人食用該類動(dòng)物食品會(huì)引發(fā)一系列的副作用，臨床表現(xiàn)為心跳加速、四肢顫抖、腹痛頭暈，同時(shí)伴有惡心嘔吐、呼吸困難等癥狀；長(zhǎng)期食用可致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤，因此目前已被國(guó)際上大部分國(guó)家禁用。但近年來(lái)常有因食用含有克倫特羅豬肉、牛肉的中毒事件發(fā)生，嚴(yán)重危害了人民的身體健康。因此，準(zhǔn)確快速檢測(cè)克倫特羅對(duì)于食品安全具有非常重要的意義。當(dāng)前檢測(cè)克倫特羅的主要方法有高效液相色譜法(HPLC)、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC-MS，HPLC-MS)、酶聯(lián)免疫(ELISA)等，高效液相色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于操作繁瑣、 成本高、分析速度慢等缺點(diǎn)無(wú)法得到普遍推廣。而目前市售的酶聯(lián)免疫試劑盒雖然選擇性好、操作方便，但價(jià)格昂貴、貯藏條件苛刻，假陽(yáng)性比較高，并且檢測(cè)限一般只能達(dá)到0. Ing/ mL,滿足不了快速準(zhǔn)確的檢測(cè)要求。表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering, SERS)標(biāo)記技術(shù)是一種新穎的光譜標(biāo)記方法，它利用金或銀等納米粒子來(lái)增強(qiáng)吸附在其表面標(biāo)記分子的拉曼信號(hào)，并將其作為標(biāo)記示蹤信號(hào)。SERS標(biāo)記技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)①拉曼光譜具有高度的分子特征性，且譜峰窄，能避免不同分子間的譜峰重疊；②拉曼散射幾乎不受水的影響，能夠廣泛應(yīng)用于水溶液的檢測(cè)；③SERS信號(hào)具有高強(qiáng)度、低背景的特點(diǎn)，很少受光漂白的影響，為了獲得較好的信號(hào)可在一定程度上延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間；④SERS信號(hào)不易發(fā)生淬滅現(xiàn)象。SERS技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在分析化學(xué)與生命科學(xué)領(lǐng)域日益受到重視。早前關(guān)于SERS的研究主要集中在蛋白質(zhì)、DNA、微生物檢測(cè)等方面。韓曉霞《基于表面增強(qiáng)拉曼散 射的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法研究》一文利用蛋白質(zhì)和金屬納米粒子的相互作用形成SERS基底用于蛋白質(zhì)的測(cè)定；此外還結(jié)合SERS和ELISA的基本理論，設(shè)計(jì)了一種基于表面增強(qiáng)共振拉曼散身寸(Surface-enhancedresonant Raman spectroscopy, SERRS)禾丨J用焚光分子代替酶促反應(yīng)、以SERS檢測(cè)取代吸光度的免疫吸附試驗(yàn)。郭紅燕《SERS標(biāo)記的金納米探針用于免疫檢測(cè)》一文以對(duì)巰基苯甲酸為拉曼活性分子制備出SERS標(biāo)記的金納米棒探針和蛋白抗體結(jié)合形成SERS標(biāo)記抗體。通過(guò)SERS標(biāo)記抗體、待測(cè)抗原和俘獲抗體之間的免疫應(yīng)答反應(yīng)，將金納米棒探針組裝到固體基底上。這種SERS標(biāo)記方法主要基于類似三明治結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，基底上的俘獲抗體和納米粒子上的標(biāo)記抗體通過(guò)與抗原的結(jié)合形成“俘獲抗體_抗原_標(biāo)記抗體”三明治夾心復(fù)合物，通過(guò)對(duì)標(biāo)記分子SERS信號(hào)的檢測(cè)進(jìn)行免疫分析。蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)一般具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，能夠很好地適用于傳統(tǒng)的三明治結(jié)構(gòu)。 但克倫特羅作為一種典型的激素類小分子物質(zhì)，由于其缺少多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，目前還沒(méi)有專門的利用SERS對(duì)這類激素類小分子物質(zhì)，尤其是克倫特羅的檢測(cè)?；赟ERS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)， 因此，發(fā)展一種利用SERS簡(jiǎn)單快速檢測(cè)克倫特羅的方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種靈敏度高、檢測(cè)區(qū)間寬、特異性強(qiáng)的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法。在本發(fā)明中，利用 SERS免疫標(biāo)記方法并結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)吸附法成功地對(duì)克倫特羅進(jìn)行了檢測(cè)。本發(fā)明的另一目的在于提供所述應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，將克倫特羅和結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針依次滴在固定好抗原偶聯(lián)物的基底表面，克倫特羅與抗原偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合SERS納米探針表面的抗體；反應(yīng)完成后，然后使用拉曼儀對(duì)結(jié)合在基底上的SERS納米探針進(jìn)行信號(hào)采集，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)檢測(cè)信號(hào)的高低對(duì)克倫特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。其具體步驟如下(1)將待測(cè)樣品和結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針依次滴在固定抗原偶聯(lián)物的基底的表面，室溫反應(yīng)，用超純水清洗基底；同時(shí)用不同濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針依次滴在固定好抗原偶聯(lián)物的基底表面，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)用拉曼儀對(duì)基底表面上結(jié)合的SERS納米探針進(jìn)行信號(hào)采集，數(shù)據(jù)處理；根據(jù)待測(cè)樣品的百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出克倫特羅的濃度，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品中克倫特羅的實(shí)際濃度。步驟(1)中所述的結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針包括金納米粒子、拉曼標(biāo)記分子和克倫特羅抗體；所述的金納米粒子的平均直徑優(yōu)選為30nm，可參考文獻(xiàn)《表面增強(qiáng)拉曼光譜研究以4，4'-聯(lián)吡啶為標(biāo)記分子的免疫檢測(cè)》(蔣蕓等)制備得到；所述的拉曼標(biāo)記分子優(yōu)選為4，4'-聯(lián)吡啶，它是一種雙功能團(tuán)拉曼標(biāo)記分子，其一端與金納米粒子相結(jié)合，另一端連接克倫特羅抗體；所述的結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針優(yōu)選通過(guò)如下方法制備得到將平均直徑為30nm的金納米粒子與4，4'-聯(lián)吡啶在室溫下標(biāo)記反應(yīng)，離心，去上清，沉淀用硼酸緩沖液分散，得到分散的金膠；然后在分散的金膠中加入克倫特羅抗體，反應(yīng)，離心，去上清，沉淀用硼酸緩沖液分散，得到分散體系；最后，加入牛血清蛋白進(jìn)行封閉反應(yīng)，牛血清白蛋白的作用是封閉前述分散體系的剩余部位，離心，去上清，用磷酸緩沖液分散，即制得結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針，2 6°C下保存待用；所述的4，4'-聯(lián)吡啶的用量為過(guò)量，其分子數(shù)優(yōu)選為金納米粒子個(gè)數(shù)的300倍；所述的室溫優(yōu)選為25 30°C ；所述的標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為5 30min ；所述離心的條件優(yōu)選為12000rpm離心5min ；所述反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為1 3h ；所述的硼酸緩沖液優(yōu)選為pH 8. 2、2mM的硼酸緩沖液；所述的克倫特羅抗體的用量?jī)?yōu)選為每6. 02X IO11個(gè)金納米粒子使用2. 5 μ g克倫特羅抗體；所述封閉反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為0. 5 2 h ；所述的磷酸緩沖液優(yōu)選為pH 7. 4、IOmM的磷酸緩沖液；所述分散體系的剩余部位是指分散體系中克倫特羅抗體與4，4'-聯(lián)吡啶結(jié)合不完全，還有一些剩余的4，4'-聯(lián)吡啶未結(jié)合；步驟(1)中所述的抗原偶聯(lián)物為克倫特羅與載體蛋白偶聯(lián)的物質(zhì)，優(yōu)選克倫特羅與牛血清白蛋白偶聯(lián)的物質(zhì)；步驟(1)中所述的基底優(yōu)選為常用于細(xì)胞觀察的普通載玻片；步驟(1)中所述的固定抗原偶聯(lián)物的基底優(yōu)選，通過(guò)如下步驟制備得到將載玻片依次經(jīng)過(guò)超聲波清洗處理、水虎魚溶液的浸泡處理、硅烷化處理以及戊二醛處理，得到能夠有效連接蛋白質(zhì)的載玻片，載玻片每經(jīng)過(guò)一個(gè)處理都要用超純水沖洗和惰性氣體吹干； 接著在吹干的載玻片上滴加抗原偶聯(lián)物溶液，常溫下固定后用超純水沖洗，惰性氣體吹干， 再用牛血清蛋白中封閉硅烷化的載玻片的空白部位，取出后再次用超純水沖洗，惰性氣體吹干，得到固定抗原偶聯(lián)物的基底；所述的超純水為電阻彡18ΜΩ的水；所述的惰性氣體優(yōu)選為氮?dú)?；所述的水虎魚溶液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)30%的過(guò)氧化氫與質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%以上的硫酸按體積比13配制得到溶液；所述的超聲波清洗處理的條件優(yōu)選為20 50KHz處理20 40min ；更優(yōu)選為 40KHz 處理 30min ；所述的水虎魚溶液的浸泡處理的條件優(yōu)選為在沸騰的水虎魚溶液浸泡20 40min ；更優(yōu)選為在沸騰的水虎魚溶液浸泡30min ；所述的硅烷化處理優(yōu)選為在體積百分比5 10%的3-氨基-三甲氧基硅烷 (APTMS)甲醇溶液中浸泡12 36h ；更優(yōu)選為在體積百分比8%的3-氨基-三甲氧基硅烷甲醇溶液中浸泡24h ；所述的戊二醛處理優(yōu)選為在體積百分比1 3%的戊二醛溶液中浸泡3 5h ；更優(yōu)選為在體積百分比2. 5%的戊二醛溶液中浸泡4h ；步驟(1)中所述的室溫反應(yīng)的條件優(yōu)選為25 30°C反應(yīng)1 3h ；步驟(1)中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備過(guò)程中，反應(yīng)條件和待測(cè)樣品的檢測(cè)過(guò)程相同，區(qū)別僅在于用克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液取代待測(cè)樣品；步驟(1)中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述的百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值(B/BJ是指不同濃度待測(cè)樣品的SERS信號(hào)強(qiáng)度值的平均值(B)除以對(duì)照實(shí)驗(yàn)(標(biāo)準(zhǔn)克倫特羅濃度為Opg/mL)的SERS信號(hào)強(qiáng)度值(Btl)再乘以100%得到的值；步驟(2)中所述的拉曼儀的操作條件優(yōu)選為激發(fā)光源波長(zhǎng)為632. Snm的He-Ne激光器，到達(dá)樣品的激光功率為lmW，信號(hào)收集時(shí)間為10 60s，更優(yōu)選為30s ；所述的數(shù)據(jù)處理是指利用Origin軟件進(jìn)行基線處理，從而得到清晰直觀的SERS 光譜圖，根據(jù)SERS光譜圖，以拉曼標(biāo)記分子的振動(dòng)特征譜峰為參考，選擇合適的拉曼位移；上述方法應(yīng)用于檢測(cè)克倫特羅，特別適用于微量或痕量的克倫特羅的檢測(cè)，可應(yīng)用于食品的安全檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明的原理在于在固定好抗原偶聯(lián)物的基底表面依次滴加待測(cè)樣品或克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和SERS納米探針，待測(cè)樣品或克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液與抗原偶聯(lián)物可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合SERS納米探針表面的抗體。與待測(cè)樣品或克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)生了偶聯(lián)的SERS納米探針在沖洗時(shí)可被清除，從而減少了結(jié)合在基底上的SERS納米探針，基底上標(biāo)記分子的 SERS信號(hào)將變?nèi)酢Ｒ虼嘶咨蠘?biāo)記分子的SERS信號(hào)與待測(cè)樣品濃度或克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度成反比關(guān)系即克倫特羅的濃度越高，可檢測(cè)到的標(biāo)記分子的SERS信號(hào)越低。基于上述原理，可在一定濃度區(qū)間內(nèi)定量檢測(cè)樣品中的克倫特羅與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明與目前常用的酶聯(lián)免疫方法相比，得到了一個(gè)更寬的檢測(cè)區(qū)間(0. 1 100pg/mL)和更高的靈敏度(0. lpg/mL)。(2)本發(fā)明在豬尿中表現(xiàn)了很好的回收率以及特異性，實(shí)用性強(qiáng)。(3)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，SERS納米探針制備與抗原偶聯(lián)物的固定都可以提前準(zhǔn)備， 操作時(shí)只需將待測(cè)樣品與SERS納米探針依次滴加至基底表面反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后可以馬上進(jìn)行檢測(cè)，這對(duì)于提高其應(yīng)用性具有廣泛的意義。


圖1是本發(fā)明所述應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法的流程示意圖。圖2是實(shí)施例1中使用不同濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的檢測(cè)圖；其中，a為 SERS光譜圖；b為強(qiáng)度柱形圖。圖3是克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值與百分信號(hào)強(qiáng)度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4是實(shí)施例2得到的特異性檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1 豬尿中克倫特羅的SERS檢測(cè)，豬尿中克倫特羅的SERS檢測(cè)，其步驟如下所示(圖1)(1)制備結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針制備金溶膠(蔣蕓，崔顏，顧仁敖等.表面增強(qiáng)拉曼光譜研究以4，4'-聯(lián)吡啶為標(biāo)記分子的免疫檢測(cè)[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2006，64(3) :240 244)用水配制100mL、摩爾濃度為ImM的氯金酸溶液(HAuC14)，置于三頸圓底燒瓶中加熱至沸騰。然后加入6mL、摩爾濃度為38. SmM的檸檬酸鈉溶液(用水配制)。此時(shí)金膠的顏色變化是淡黃-無(wú)色-黑色-紫色_深紅色，到達(dá)深紅色后繼續(xù)加熱回流15 20min，即制得平均直徑為30nm的金納米粒子。然后取ImL新鮮制得的金納米粒子(約6. 02X IO11個(gè))與30 μ L、摩爾濃度為0. OlmM 的4，4'-聯(lián)吡啶(購(gòu)自Sigma試劑公司)，常溫(25 30°C )下標(biāo)記IOmin后12000rpm離心5min，去上清，沉淀用ImL pH 8. 2、2mM的硼酸緩沖液分散，得到分散的金膠；接著在ImL 分散的金膠中加入5 μ L、質(zhì)量濃度為0. 5mg/mL的克倫特羅抗體(購(gòu)自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)，反應(yīng)2h后再次12000rpm離心5min，去上清，沉淀用ImL pH 8. 2、2mM的硼酸緩沖液分散，得到分散體系；最后用20 μ L、質(zhì)量濃度為2. 5%的牛血清蛋白(購(gòu)自Sigma 試劑公司)封閉上述分散體系的剩余部位lh，12000rpm離心5min，去上清，沉淀用pH 7. 4、 IOmM的磷酸緩沖液分散，即制得結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針，4°C下保存待用。(2)固定抗原偶聯(lián)物的基底的制備可參考文獻(xiàn)《SERS標(biāo)記納米粒子用于免疫識(shí)別》(徐抒平等)進(jìn)行制備。首先將尺寸為25mmX76mmXlmm的載玻片(購(gòu)自江蘇鹽城市信泰醫(yī)療器械廠)經(jīng)過(guò)40KHz的超聲波清洗30min，取出后用超純水(由ELGA LabWater公司的PURELAB Option-R純水系統(tǒng)制備，電阻彡18ΜΩ)沖洗，氮?dú)?購(gòu)自廣州普魯克氣體公司，純度為99.99%)吹干；然后將吹干的載玻片浸泡在沸騰的水虎魚溶液(30wt%過(guò)氧化氫與98wt%硫酸體積比為1 3) 中30min，取出后用大量超純水沖洗，氮?dú)獯蹈?；接著將吹干的載玻片放入體積濃度為8% 的3-氨基-三甲氧基硅烷(APTMS)(購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰?甲醇溶液中浸泡24h， 取出后先用甲醇溶液(分析純)徹底清洗，再用超純水淋洗，氮?dú)獯蹈?，即為硅烷化的載玻片；再接著把硅烷化的載玻片浸于體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液中浸泡4h后用超純水沖洗，氮?dú)獯蹈桑蛔詈笤谏鲜鎏幚砗玫妮d玻片上滴加ΙΟΟμ L、50y g/mL抗原偶聯(lián)物溶液(克倫特羅-BSA，購(gòu)自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)，常溫下固定2h后用超純水沖洗，氮?dú)獯蹈?，置于牛血清蛋白中封閉剩余部位lh，取出后再次用超純水沖洗，氮?dú)獯蹈桑瑐溆?。此時(shí)抗原偶聯(lián)物已經(jīng)成功固定于載玻片表面。

(3)待測(cè)樣品或克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液與抗原偶聯(lián)物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)①選擇5個(gè)濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液(購(gòu)自廣州分析測(cè)試中心科力技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)，分別為0、0. UlUO和100pg/mL，其中Opg/mL為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液 (50 μ L)和結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針(50 μ L)依次滴在固定好抗原偶聯(lián)物的載玻片表面。克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液與固定在載玻片表面的抗原偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合SERS納米探針表面的抗體，在室溫(25 30°C )下反應(yīng)2h后用超純水沖洗載玻片。用日本Nippon Optical System公司的顯微拉曼光譜儀，對(duì)載玻片表面上結(jié)合的 SERS納米探針進(jìn)行信號(hào)采集，激發(fā)光源是波長(zhǎng)為632. Snm的He-Ne激光器，到達(dá)樣品的激光功率為lmW，信號(hào)收集時(shí)間為10 60s。信號(hào)采集完畢后通過(guò)Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基線處理，得到清晰直觀的SERS光譜圖(如圖2a所示)及強(qiáng)度柱形圖(如圖2b所示)。根據(jù) SERS光譜圖，以4，4'-聯(lián)吡啶面內(nèi)環(huán)呼吸振動(dòng)特征譜峰為參考，選擇拉曼位移為1612CHT1。 從圖2a中可以明顯地看到，隨著克倫特羅濃度的提高，采集的SERS信號(hào)逐漸降低。從圖2b 可以看出，相比于0pg/mL處的信號(hào)強(qiáng)度，0. 1 100pg/mL的強(qiáng)度有一個(gè)明顯的降低趨勢(shì)，表明在這一區(qū)間內(nèi)能夠進(jìn)行有效的定量分析，同時(shí)看出該方法的檢測(cè)限低至0. lpg/mL,比常用檢測(cè)克倫特羅的ELISA法(檢測(cè)限一般為0. Ing/mL)的靈敏度高1000倍。以克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值(B/BJ為縱坐標(biāo)，得到克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線=Y = 63. 0-16. 31og10X，R2 = 0. 9980，如圖3所示。②用pH 7. 4、IOmM的磷酸緩沖液將陰性豬尿(由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供，不含克倫特羅)稀釋50倍，得到豬尿稀釋液。將克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到豬尿稀釋液中，克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)樣品在豬尿稀釋液的濃度分別為0. UlUO和100pg/mL，制成含克倫特羅的豬尿稀釋液。用含克倫特羅的豬尿稀釋液代替克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)實(shí)施步驟①，得到豬尿稀釋液的百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值(B/BO)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出豬尿稀釋液濃度，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為豬尿中克倫特羅的實(shí)際濃度。從表1可以看出，豬尿中克倫特羅的平均回收率為111. 9%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為10. 5%，說(shuō)明本發(fā)明具有很高的準(zhǔn)確性和靈敏度。由于克倫特羅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其在體內(nèi)不會(huì)被破 壞分解，大量以原形從尿液中排出(時(shí)瑾等，鹽酸克倫特羅的高靈敏時(shí)間分辨熒光免疫分析，衛(wèi)生研究，2006，35(6)， 798-801)。因此，可知本發(fā)明能有效地從尿液中檢測(cè)到克倫特羅的存在。表1競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)方法檢測(cè)豬尿中克倫特羅的回收率
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將待測(cè)樣品和結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針依次滴在固定抗原偶聯(lián)物的基底的表面，室溫反應(yīng)，用超純水清洗基底；同時(shí)用不同濃度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針依次滴在固定好抗原偶聯(lián)物的基底表面，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；抗原偶聯(lián)物為克倫特羅與載體蛋白偶聯(lián)的物質(zhì)；(2)用拉曼儀對(duì)基底表面上結(jié)合的SERS納米探針進(jìn)行信號(hào)采集，數(shù)據(jù)處理；根據(jù)待測(cè)樣品的百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出克倫特羅的濃度，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品中克倫特羅的實(shí)際濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于步驟(1)中所述的結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針包括金納米粒子、拉曼標(biāo)記分子和克倫特羅抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于所述的金納米粒子的平均直徑為30nm ； 所述的拉曼標(biāo)記分子為4，4'-聯(lián)吡啶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于所述的結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針通過(guò)如下方法制備得到將平均直徑為 30nm的金納米粒子與4，4'-聯(lián)吡啶在室溫下標(biāo)記反應(yīng)，離心，去上清，沉淀用硼酸緩沖液分散，得到分散的金膠；然后在分散的金膠中加入克倫特羅抗體，反應(yīng)，離心，去上清，沉淀用硼酸緩沖液分散，得到分散體系；最后用牛血清蛋白進(jìn)行封閉反應(yīng)，離心，去上清，用磷酸緩沖液分散，即制得結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于所述的4，4'-聯(lián)吡啶的用量為其分子數(shù)是金納米粒子個(gè)數(shù)的300倍；所述的室溫溫度為25 30°C ；所述的標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間為5 30min ；所述的反應(yīng)的時(shí)間為1 3h ；所述的硼酸緩沖液為PH 8. 2、2mM的硼酸緩沖液；所述的克倫特羅抗體的用量為每6. 02X1011個(gè)金納米粒子使用2. 5 μ g克倫特羅抗體；所述的磷酸緩沖液為PH 7. 4、IOmM的磷酸緩沖液； 所述封閉反應(yīng)的時(shí)間為0. 5 2h ； 所述的離心的條件為12000rpm離心5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于步驟(1)中所述的固定抗原偶聯(lián)物的基底通過(guò)如下步驟制備得到將載玻片依次經(jīng)過(guò)超聲波清洗處理、水虎魚溶液的浸泡處理、硅烷化處理以及戊二醛處理，得到能夠有效連接蛋白質(zhì)的載玻片，載玻片每經(jīng)過(guò)一個(gè)處理都要用超純水沖洗和惰性氣體吹干；接著在吹干的載玻片上滴加抗原偶聯(lián)物溶液，常溫下固定后用超純水沖洗，惰性氣體吹干，再用牛血清蛋白中封閉硅烷化的載玻片的空白部位，取出后再次用超純水沖洗，惰性氣體吹干，得到固定抗原偶聯(lián)物的基底。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于所述的惰性氣體為氮?dú)?；所述的超聲波清洗處理的條件為20 50KHz處理20 40min ；所述的水虎魚溶液的浸泡處理的條件為在沸騰的水虎魚溶液浸泡20 40min ；所述的硅烷化處理為在體積百分比5 10%的3-氨基-三甲氧基硅烷甲醇溶液中浸泡12 36h ；所述的戊二醛處理為在體積百分比1 3%的戊二醛溶液中浸泡3 5h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法，其特征在于步驟(1)中所述的室溫反應(yīng)的條件為25 30°C反應(yīng)1 3h ；步驟(1)中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；百分SERS信號(hào)強(qiáng)度值是指不同濃度待測(cè)樣品的SERS信號(hào)強(qiáng)度值的平均值除以對(duì)照實(shí)驗(yàn)的SERS信號(hào)強(qiáng)度值再乘以100%得到的值；步驟(2)中所述的拉曼儀的操作條件為激發(fā)光源波長(zhǎng)為632. Snm的He-Ne激光器，到達(dá)樣品的激光功率為lmW，信號(hào)收集時(shí)間為10 60s ；所述的數(shù)據(jù)處理是指利用Origin軟件進(jìn)行基線處理。
9.權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)克倫特羅的方法的應(yīng)用，其特征在于所述的方法應(yīng)用于檢測(cè)微量或痕量的克倫特羅。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)檢測(cè)克倫特羅的方法及應(yīng)用，屬于激素類小分子物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該方法首先是將待測(cè)樣品和結(jié)合克倫特羅抗體的SERS納米探針依次滴在固定好抗原偶聯(lián)物的基底表面，待測(cè)樣品中的抗原和固定好抗原偶聯(lián)物的基底中的抗原與結(jié)合在SERS納米探針上的抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)拉曼儀對(duì)固定好抗原偶聯(lián)物的基底上標(biāo)記的SERS納米探針進(jìn)行信號(hào)采集，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)檢測(cè)信號(hào)的高低和標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而對(duì)克倫特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。本發(fā)明所述的方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)區(qū)間寬和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、興奮劑檢測(cè)以及環(huán)境分析等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/65GK102221542SQ20111007281
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者朱桂池, 胡勇軍, 鐘亮, 高姣 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)