專利名稱：一種測定Graves病患者血液中可溶性CD28含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種測定Graves病病患者血液中可溶性⑶28含量的方法。
背景技術(shù)：
Graves病又稱彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(甲亢)或毒性彌漫性甲狀腺腫，是甲亢中最常見的類型。也是一種伴甲狀腺激素分泌增多的器官特異性自身免疫性疾病，其病因和發(fā)病機理尚不明確。目前認為其免疫致病機制是由于甲狀腺細胞表面促甲狀腺激素(TSH)受體作為抗原刺激機體所產(chǎn)生的抗體(TRAb)模擬TSH的作用，與TSH受體結(jié)合，使甲狀腺濾泡細胞持續(xù)性激發(fā)、形成和分泌過量的甲狀腺素而引起甲亢。近年來，人們越來越重視免疫致病機制在Graves病發(fā)病中的作用，希望能尋找免疫干預(yù)手段作為治療Graves病的新途徑。自身抗體TRAb是重要的效應(yīng)因子，是發(fā)病中較靠下游的環(huán)節(jié)，不是Graves病發(fā)病的啟動因子，為此，近年來研究者們把目光開始投向于開啟甲狀腺異常免疫應(yīng)答的上游環(huán)節(jié)一自身反應(yīng)性T細胞的活化及相關(guān)調(diào)節(jié)分子的研究。大量研究表明，多對共刺激分子的受體-配體分子在免疫病理應(yīng)答的不同階段以各自獨特的方式參與了類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡和實驗性自身腦脊髓膜炎等自身免疫性疾病的病理過程。Schmidt等首次報道了在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血中存在一群獨特的CD4+T細胞，其表面完全缺乏共刺激分子CD28的表達。近年來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在各種慢性炎癥狀態(tài)下，如多發(fā)性硬化癥、不穩(wěn)定性心絞痛、Wegener肉芽腫病和強直性脊柱炎等患者的外周血中均有異常⑶4+CD28_T細胞的高頻存在。此外，在年齡大于65歲的老年人的外周血中亦發(fā)現(xiàn)有該群特殊的CD4+CD28_T細胞存在。業(yè)已有研究證實，在類風濕性關(guān)節(jié)炎病人中，當患者出現(xiàn)類風濕結(jié)節(jié)和關(guān)節(jié)外全身癥狀時，⑶4+CD28_T細胞數(shù)量顯著增加；同樣，在冠脈綜合癥中，⑶4+CD28_T細胞的數(shù)量與患者發(fā)生急性冠脈事件的危險性呈明顯正相關(guān)，發(fā)生急性冠脈綜合癥患者體內(nèi)的炎癥性粥樣斑塊局部可見該群細胞呈克隆性擴增[12]。進一步研究證實，⑶4+CD28—T細胞本質(zhì)上是一群具有獨特生物學特性和功能的自身反應(yīng)性T細胞。國內(nèi)外研究業(yè)已證實，共刺激分子，不論受體還是配體，均以膜型和可溶性兩種形式存在，分別表達于細胞膜上和分泌于體液中，參與了共刺激信號的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)。有文獻報道，可溶性CD28分子主要來源于膜型CD28分子的脫落和mRNA水平剪接、翻譯后的直接分泌。但也有文獻經(jīng)RT-PCR證實，系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血液中的可溶性CD28分子為全長基因所編碼，也就是說，病人血液中的可溶性CD28分子為細胞膜CD28分子脫落所致。另有體外實驗結(jié)果表明，可溶性CD28分子與多發(fā)性硬化癥、硬皮病等自身免疫性疾病的嚴重程度密切相關(guān)，并具有抑制T細胞增殖的功能。但可溶性CD28分子在Graves病中的臨床診斷價值及其在體內(nèi)免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮何種作用，在腫瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中又有何意義，目前仍不清楚?；谝陨显?，發(fā)明一種有效的Graves病患者血液中可溶性⑶28含量的測定及、作用機制方法，已成為本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)丞待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種測定Graves病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，為探討Graves病的實驗室研究和尋找可溶性CD28分子參與該病發(fā)病機制，提供具有重要基礎(chǔ)研究價值和潛在的臨床應(yīng)用價值的生物學參數(shù)。本發(fā)明的一種測定Grave s病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，具體步驟如下步驟I)準備材料、試劑及血液標本牛血清；RPMI1640 或 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；CD28 單抗 2D5、2F5、3B6、3F8 和 8G8 ;親和層析柱Protein G免疫親和層析柱；rh⑶28/Fc重組蛋白；琥珀酰羥基生物素；二甲基亞砜；4%多聚賴氨酸；streptavidin-HRP ；avidin-PE ;酶標測定板；酶標測定儀；培養(yǎng)瓶；實驗儀器C02培養(yǎng)箱、離心機；倒置顯微鏡及熒光顯微鏡；流式細胞儀；TMB底物；人促甲狀腺激素(hTSH)試劑盒；淋巴細胞分離液；鼠抗人PE直接標記⑶3、⑶4、⑶8、⑶28、NF- k B單克隆抗體；血液標本選取多例初發(fā)Graves病患者的血液標本作為實驗組，準備健康人血液標本多份作為正常對照組；步驟2)單克隆抗體的生物素標記用碳酸鹽緩沖液將純化的2D5單抗的濃度調(diào)整為200 ii g/ml，取其I. Oml在50mlCBS中4°C透析過夜,移入Eppendof管,加入lmg/ml的生物素40 V- I,避光震蕩4h, 0. Olmol/L pH7. 2 PBS中4°C透析72h，分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?；步驟3)生物素標記單抗的鑒定將⑶28-T轉(zhuǎn)基因細胞用PBS洗滌后，以5X IO5/管的劑量分裝于小試管中，以20 iil/管的劑量加入生物素標記的單抗2D5，4°C反應(yīng)45min，充分洗滌后以IOyl/管的劑量加入avidin-PE，再于4°C反應(yīng)45min，充分洗滌后用流式細胞儀分析，同時設(shè)置陰性對昭.
>、、、 步驟4) s⑶28標準工作曲線的繪制用2F5mAb包被經(jīng)0. 01 %多聚賴氨酸預(yù)處理的酶聯(lián)檢測板，4°C過夜，含0. 01 %Tween-20的PBS洗滌后，以3% BSA封閉過夜，洗滌后加入0 16ng/ml的標準品rhCD28/Fe重組蛋白的梯度稀釋液，反應(yīng)2h，充分洗滌后，再分別加生物素標記單抗和HRP標記鏈霉親和素，37 V反應(yīng)Ih，洗滌后，加TMB底物室溫反應(yīng)15min，用上述方法測定A45tl,每個梯度做3個復(fù)孔，以s⑶28/Fc的濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，繪制s⑶28的標準工作曲線；步驟5) Graves病人血液中T細胞的分離和純化抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鮮外周血IOml,用pH7. 2的無Ca2+、Mg2+Hankj s液作I : 2稀釋后，輕懸于淋巴細胞分離液上，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心30min,棄上清；吸取界面云霧狀層細胞，加5倍體積的Hank’s液,混勻，2000rpm,離心IOmin,棄上清；以1400rpm的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)lOmin，重復(fù)洗滌一次，計數(shù)，用含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為3X 106/ml，置6孔塑料培養(yǎng)板于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2h以去除貼壁的單核細胞及B細胞等，收集非貼壁細胞懸液，經(jīng)E花環(huán)結(jié)合法富集T細胞，經(jīng)流式細胞儀分析，⑶3+T細胞達到90%以上，液氮凍存?zhèn)溆?；步驟6) Graves病人T細胞的表型分析液氮中復(fù)蘇凍存的患者和健康對照組的純化T細胞，用PBS洗滌2遍后，以5X IO5/管的劑量分裝于小試管中，分別加入⑶3、⑶4、⑶8、⑶28和ICOS分子的PE直標抗體IOyl及小鼠IgG-PE 10 u I作為陰性對照，于4°C避光反應(yīng)45min，經(jīng)含5%小牛血清的PBS洗滌后，加入0.5ml PBS后，用流式細胞儀分析T細胞表型，圖象處理運用EXPO v. 2 cytometersoftware分析軟件。步驟7) Graves病人血液中可溶性CD28含量的測定收集T細胞培養(yǎng)上清、Graves’病人血液中和對照組正常健康人血漿0. 5ml。取包被抗體2F5已經(jīng)預(yù)包被的檢測板，加入上述收集待測樣品100iU，37°C水浴反應(yīng)2h,充分洗滌后，加入生物素標記的單抗2D5，再于37°C水浴反應(yīng)Ih充分洗滌后，加入streptavidin-HRP,反應(yīng)洗滌后，加入臨時配制的底物TMB，室溫反應(yīng)15min后，用2mol/LH2SO4終止酶與底物的反應(yīng)，于酶標儀測定A45tl,每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔，同時用rh⑶28/Fc重組蛋白標準品制作線性標準曲線，以分析Graves病人血漿中可溶性⑶28含量；步驟8)免疫印跡法分析患者血液中可溶性⑶28分別收集T細胞培養(yǎng)上清、經(jīng)PHA活化的T細胞培養(yǎng)上清、健康人血清和Graves’病人血清，在上述蛋白質(zhì)樣品中加入I X SDS凝膠加樣緩沖液,于沸水中煮沸3min使蛋白質(zhì)變性，配制8%的積層膠和5%的分離膠，恒壓100伏特進行SDS-PAGE電泳3h，電泳結(jié)束后， 剪取與凝膠塊相同大小的3M濾紙和硝酸纖維膜，并按照要求正確排列濾紙、硝酸纖維膜和凝膠塊，恒流IOOmA電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜2h，用含5%脫脂奶粉和0. 3% Tween-20的PBS封閉硝酸纖維膜，搖床過夜，次日TBS洗滌后加入稀釋的鼠抗人⑶28抗體8G8 (10 u g/ml)，封閉2h，TBS充分洗滌，加入羊抗鼠I gG 二抗(I 1000稀釋)，室溫孵育2h，TBS充分洗滌后加入顯色液BCIP顯色，用ECL檢測系統(tǒng)的化學發(fā)光方法觀察特異性蛋白條帶；步驟9)可溶性⑶28對樹突狀細胞分泌的細胞因子的影響無菌抽取正常人肝素抗凝外周血，常規(guī)Ficoll分離獲得單個核細胞，洗滌2遍后，用RPMI-16 40調(diào)整細胞密度至3X 106/ml，加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中，37°C培養(yǎng)2h，輕輕吸出懸浮細胞，_80°C凍存?zhèn)溆谩Ｈ缓笤谂囵B(yǎng)板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)U00IU/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉素的RPMI-1640，37°C培養(yǎng)，每3d換液一次。在培養(yǎng)的第6d，選用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)其成熟，然后加入⑶28重組蛋白，兩天后，收集細胞培養(yǎng)上清，測定細胞因子IL-2和IL-6濃度，同時設(shè)置陰性對照組；步驟10)可溶性⑶28對樹突狀細胞NF- k B核轉(zhuǎn)位的影響收集成熟的樹突狀細胞并調(diào)整細胞濃度為lXlOVml，分裝0. 5ml于無菌的Eppendoff管中，加入CD28融合蛋白分別培養(yǎng)30min、60min和120min，然后用PBS洗滌三次，然后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細胞20min，PBS室溫洗滌三次后，0. I % Triton處理lOmin，PBS室溫洗滌三次后，Blocking buffer室溫封閉lh，以2 y g/管的劑量加入NF-k B單抗，室溫反應(yīng)2h，PBS室溫洗滌三次后，加入cy5標記的兔抗鼠二抗室溫繼續(xù)反應(yīng)lh，PBS洗滌后，以100 iil/管的劑量加入核染色劑PI和以IOiU/管的劑量加入RNase酶，37°C培養(yǎng)染色30min，PBS室溫洗滌三遍后，熒光封片劑封片，然后通過共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，對照組為人IgG抗體的Fe段，另外，收集LPS刺激的樹突狀細胞，通過流式細胞儀檢測細胞CD83、CD86和CD80的陽性百分率，分析樹突狀細胞的成熟程度；步驟11)統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均用^表示，數(shù)據(jù)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗,非參數(shù)統(tǒng)計分析視樣本類型不同分別米用Mann-Whitney、Kruskal_Wallis和Wilcoxon ranking檢驗,相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，部分指標采用樣本均數(shù)比較用t檢驗，采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。有益效果經(jīng)測定Graves病病患者血液中可溶性⑶28含量的方法，能得到，Graves病患者外周血中可溶性⑶28含量異常增高，并伴有T細胞上膜型⑶28分子的丟失，可溶性CD28分子還可以促進抗原遞呈細胞樹突狀細胞的NF-k B分子核轉(zhuǎn)位和細胞因子IL-6的分泌等性征,對進一步探討聯(lián)合其他可溶性共刺激分子建立體外檢測的優(yōu)化方案，和在自身免疫性疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后評估中的促進意義，為尋找新的免疫干預(yù)手段提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
具體實施例方式實施例II.主要材料和試劑牛血清(Hyclone，美國);全培養(yǎng)基每升RPMI1640或DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco，美國)中，添加胎?；蛐∨Ｑ?00ml、L-谷氨酰胺0. 15g、NaHC032. Og、丙酮酸鈉0. llg、葡萄糖 3. 6g、HEPES 4. 766g、2-巰基乙醇 10. Oml (5 X l(T3mol/L) ；CD28 單抗 2D5、2F5、3B6、3F8和8G8(本科室自行研制)；親和層析柱Protein G免疫親和層析柱(Pharmacia，瑞典)；rh⑶28/Fc重組蛋白(R&D，美國)；琥珀酰羥基生物素(Sigma，美國)；二甲基亞砜(Sigma,美國)；4*% 多聚賴氨酸(Sigma,美國)；streptavidin_HRP(Roche,瑞士)；avidin-PE(Immunotech,法國)；酶標測定板(8X12孔，Costar,美國)；酶標測定儀(Bio-Rad，美國)；培養(yǎng)瓶50ml、500ml塑料培養(yǎng)瓶(Nunc，丹麥)；實驗儀器C02培養(yǎng)箱、離心機(Jouan,法國)；倒置顯微鏡及突光顯微鏡(Olympus,日本)；流式細胞儀(Beckman-Coulter，美國)；TMB底物(KPL公司，英國)。人促甲狀腺激素(hTSH)試劑盒(Biological公司，美國)，淋巴細胞分離液(FicolI，上海試劑二廠)，鼠抗人PE直接標記CD3、CD4、CD8、CD28、NF-kB 單克隆抗體(ebioscience 公司，美國)標本來源選取59例自2004年5月至2006年12月在蘇州市第二人民醫(yī)院住院和門診確診的初發(fā)Graves病患者(男17名，女42名，年齡43. 7 ± 15. 8歲)作為實驗組。符合Graves病患者診斷標準(高代謝癥候群，觸診和B超檢查證實有彌漫性甲狀腺腫，伴或不伴突眼，高甲狀腺素血癥，促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)陽性或核素掃描顯示甲狀腺吸碘率彌漫性增強)。蘇州市中心血站提供健康人血液標本55份(男23名，女32名，年齡21 48歲)作為正常對照組。所有研究對象均無合并其他自身免疫性疾病、肺部疾患、腫瘤和感染性疾病等，亦無使用影響免疫功能的藥物，均常規(guī)測定甲狀腺功能(自動化學發(fā)光系統(tǒng)檢測試劑盒，Bayer公司，德國)和TRAb酶聯(lián)檢測試劑盒(Diagnostika公司，美國)。⑶組甲狀腺功能FT3 29. 4±15. 2pmol/L(正常值 3. 5-5. 5pmol/L)、FT477. 8±44. 9pmol/L(正常值 11. 5-22. 7pmol/L)和 sTSH 0. 13±0. IU/mL(正常值 0. 335-5. 5 u IU/mL)。TRAb 測定值GD 組為 26. 2±1. 2U/L，正常對照組為 4. 6 ±3. 2U/L(P < 0. 01)。、
2.實驗方法步驟I)單克隆抗體的生物素(Biotin)標記用碳酸鹽緩沖液(0. OlM CBS, PH9. 3)將純化的2D5單抗的濃度調(diào)整為200 U g/ml,取其I. Oml在50ml CBS中4 °C透析過夜。移入Eppendof管，加入lmg/ml生物素(Biotin) 40 iil，避光震蕩 4h，0. Olmol/L pH7. 2PBS 中 4°C 透析 72h (第一天換液 4 次，以后每24h換液2 3次)，分裝后于_20°C保存?zhèn)溆谩２襟E2)生物素標記單抗的鑒定將⑶28-T轉(zhuǎn)基因細胞用PBS洗滌后，分裝于小試管中(5 X IO5/管)，加入生物素標記的單抗2D5 (20 iil/管)，4 0C反應(yīng)45min，充分洗滌后加入avidin-PE (10 yl/管)，再于4V反應(yīng)45min，充分洗滌后用流式細胞儀分析。同時設(shè)置陰性對照。 步驟3) s⑶28標準工作曲線的繪制用2F5mAb包被(2 y g/ml、100 yl/孔)經(jīng)0. 01 %多聚賴氨酸預(yù)處理的酶聯(lián)檢測板，4°C過夜。PBS (含0.01% Tween-20)洗滌后，3 % BSA封閉過夜。洗滌后加入標準品rh⑶28/Fc重組蛋白的梯度稀釋液(0 16ng/ml)，反應(yīng)2h，充分洗滌后，再分別加生物素標記單抗和HRP標記鏈霉親和素，37°C反應(yīng)lh，洗滌后，加TMB底物室溫反應(yīng)15min，用上述方法測定A45(i。每個梯度做3個復(fù)孔。以s⑶28/Fc的濃度為橫坐標，A45tl值為縱坐標，繪制s⑶28的標準工作曲線。步驟4) Graves病人血液中T細胞的分離和純化抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鮮外周血IOml,用pH7. 2的無Ca2+、Mg2+Hank’s液作I : 2稀釋后,輕懸于淋巴細胞分離液(Ficoll)上，1400rpm,離心30min,棄上清；吸取界面云霧狀層細胞，加5倍體積的Hank’ s液,混勻，2000rpm,離心IOmin,棄上清；1400rpm, IOmin重復(fù)洗滌一次，計數(shù)，用含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為3X106/ml，置6孔塑料培養(yǎng)板于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2h以去除貼壁的單核細胞及B細胞等。收集非貼壁細胞懸液，經(jīng)E花環(huán)結(jié)合法富集T細胞。經(jīng)流式細胞儀分析，CD3+T細胞達到90 %以上，液氮凍存?zhèn)溆谩２襟E5) Graves病人T細胞的表型分析液氮中復(fù)蘇凍存的患者和健康對照組的純化T細胞，用PBS洗滌2遍后，分裝于小試管中(5 X IO5/管)，分別加入CD3、CD4、CD8、CD28和ICOS分子的PE直標抗體10 及小鼠IgG-PE 10 u I作為陰性對照，于4°C避光反應(yīng)45min，經(jīng)含5%小牛血清的PBS充分洗滌后(1400r/min，5min)，加入0.5ml PBS后，用流式細胞儀分析T細胞表型。圖象處理運用EXPO V. 2 cytometer software 分析軟件。步驟6) Graves病人血液中可溶性CD28含量的測定收集T細胞培養(yǎng)上清、Graves’病人血液中和對照組正常健康人血漿0. 5ml。取包被抗體2F5已經(jīng)預(yù)包被的檢測板，加入上述收集待測樣品100iU，37°C水浴反應(yīng)2h,充分洗滌后，加入生物素標記的單抗2D5，再于37°C水浴反應(yīng)Ih充分洗滌后，加入streptavidin-HRP,反應(yīng)洗滌后，加入臨時配制的底物TMB，室溫反應(yīng)15min后，用2mol/LH2SO4終止酶與底物的反應(yīng)，于酶標儀測定A45tlt5每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔，同時用rh⑶28/Fc重組蛋白標準品制作線性標準曲線，以分析Graves病人血漿中可溶性⑶28含量。步驟7)免疫印跡法分析患者血液中可溶性⑶28
分別收集T細胞培養(yǎng)上清、經(jīng)PHA活化的T細胞培養(yǎng)上清、健康人血清和Graves’病人血清，在上述蛋白質(zhì)樣品中加入I X SDS凝膠加樣緩沖液,于沸水中煮沸3min使蛋白質(zhì)變性，配制8%的積層膠和5%的分離膠，恒壓100伏特進行SDS-PAGE電泳3h。電泳結(jié)束后，剪取與凝膠塊相同大小的3M濾紙和硝酸纖維膜，并按照要求正確排列濾紙、硝酸纖維膜和凝膠塊，恒流IOOmA電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜2h。用含5%脫脂奶粉和0. 3% Tween-20的PBS封閉硝酸纖維膜，搖床過夜，次日TBS洗滌后加入稀釋的鼠抗人⑶28抗體8G8 (10 u g/ml)，封閉2h，TBS充分洗滌，加入羊抗鼠IgG 二抗(I 1000稀釋)，室溫孵育2h，TBS充分洗滌后加入顯色液BCIP顯色，用ECL檢測系統(tǒng)的化學發(fā)光方法觀察特異性蛋白條帶。步驟8)可溶性⑶28對樹突狀細胞分泌的細胞因子的影響無菌抽取正常人肝素抗凝外周血，常規(guī)Ficoll分離獲得單個核細胞，洗滌2遍后，用RPMI-1640調(diào)整細胞密度至3 X 106/ml，加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中，37°C培養(yǎng)2h，輕輕吸出懸浮細胞，_80°C凍存?zhèn)溆?。然后在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ ml)U00IU/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉素的RPMI-1640，37°C培養(yǎng)，每3d換液一次。在培養(yǎng)的第6d，選用脂多糖誘導(dǎo)其成熟，然后加入CD28重組蛋白，兩天后，收集細胞培養(yǎng)上清，測定細胞因子IL-2和IL-6濃度。同時設(shè)置陰性對照組。步驟9)可溶性⑶28對樹突狀細胞NF- k B核轉(zhuǎn)位的影響收集成熟的樹突狀細胞并調(diào)整細胞濃度為lXlOVml，分裝0. 5ml于無菌的Eppendoff管中，加入CD28融合蛋白(R&D公司，美國)分別培養(yǎng)30min、60min和120min,然后用PBS洗滌三次(1400rpmX5min，下同)，然后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細胞20min，PBS室溫洗滌三次后，0. 1% Triton處理10min，PBS室溫洗滌三次后，Blocking buffer室溫封閉lh，加入NF-k B單抗(2ii g/管)室溫反應(yīng)2h，PBS室溫洗滌三次后，加入cy5標記的兔抗鼠二抗室溫繼續(xù)反應(yīng)lh，PBS洗滌后，加入核染色劑PI (100 iil/管)和RNase酶(IOiU/管)37°C培養(yǎng)染色30min，PBS室溫洗滌三遍后，熒光封片劑封片，然后通過共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。對照組為人IgG抗體的Fe段。另外，收集LPS刺激的樹突狀細胞，通過流式細胞儀檢測細胞CD83、CD86和CD80的陽性百分率，分析樹突狀細胞的成熟程度。步驟10)統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均用"Jzt S表示，數(shù)據(jù)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗,非參數(shù)統(tǒng)計分析視樣本類型不同分別米用Mann-Whitney、Kruskal_Wallis和Wilcoxon ranking檢驗,相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，部分指標采用樣本均數(shù)比較用t檢驗，采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。3.測定結(jié)果分析DGraves病人血液中可溶性⑶28含量顯著升高用上述建立的雙單抗夾心可溶性⑶28檢測方法，分析Graves病人血液中可溶性CD28濃度，測定結(jié)果表明，Graves病人血液中可溶性CD28含量(2. 16±1. 15ng/ml)明顯高于健康對照組(0. 83±1. 35ng/ml) (P < 0. 01)，并發(fā)現(xiàn)具有甲狀腺腫大、眼球突出等伴隨癥狀的個別病人體內(nèi)可溶性⑶28濃度超過5ng/ml。結(jié)果提示，可溶性⑶28在Graves病人體內(nèi)明顯增高，可能參與了 Graves病的發(fā)生發(fā)展等病理過程。2)可溶性⑶28表達與T細胞活化狀態(tài)呈正相關(guān)PHA活化的T細胞培養(yǎng)上清中檢測可溶性⑶28含量明顯高于對照組(0. 67±0. 15VS 0. 34±0. llng/ml, P < 0. 05)，提示可溶性⑶28的產(chǎn)生可能與T細胞活化狀態(tài)有關(guān)。繼而經(jīng)免疫印跡實驗(Western blotting)進一步證實,在活化T細胞的濃縮培養(yǎng)上清和Graves病人血衆(zhòng)印染的硝酸纖維膜上出現(xiàn)了特異性染色的可溶性CD28蛋白分子條帶,而在靜止T細胞培養(yǎng)上清和健康人對照組血清中并未出現(xiàn)特異性的染色條帶。由此可見，可溶性CD28的產(chǎn)生與T細胞的活化狀態(tài)有一定的相關(guān)性。3)Graves病人外周血T細胞上⑶28陽性表達率顯著降低采用免疫熒光標記技術(shù)和流式細胞儀分析了 Graves病人及對照組健康人外周血⑶3+、⑶8+、⑶4+、⑶28+、⑶8+CD28+、⑶4+CD28+T細胞的百分率。結(jié)果顯示，Graves病人外周血T細胞上共刺激分子⑶28的陽性表達率顯著下降，不但⑶4+T細胞亞群上⑶28分子有所丟失，而且⑶8+T細胞亞群上⑶28分子的陽性表達率也顯著低于健康對照組(分別為9. 46±8. 58%和17. 55±5. 28%, P < 0. 01)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Graves患者外周、血⑶4+CD28—T細胞亞群數(shù)量顯著高于正常對照組(分別為10. 2±8. 6%和2. 3±1.9%，P
<0. 01)，而且患者體內(nèi)⑶3T細胞的陽性百分率也明顯低于健康對照組(51. 43±7. 54%和69. 37±9. 21%, P < 0. 05),細胞計數(shù)也提示,患者血液中T細胞的相對數(shù)降低。但是患者外周血T細胞卻異常上調(diào)表達ICOS分子(11. 2 ±9. 46% )，共刺激分子ICOS在健康對照組幾乎不表達(1.32±0.6%)。在給患者藥物治療后，再次分析患者T細胞表型顯示，與治療前相比較，藥物治療后的患者體內(nèi)⑶28的陽性百分率有明顯上調(diào)(分別為26. 83±7. 35%和49. 54±7. 81%，P < 0. 01)，不論是⑶4+T細胞亞群，還是⑶8+T細胞亞群表面的⑶28分子都明顯呈現(xiàn)恢復(fù)性上調(diào)，由此提示患者T細胞表面⑶28分子的表達百分率與病情有密切的關(guān)系，CD28分子可能參與了該病的發(fā)生發(fā)展等病理過程。4)可溶性CD28含量與Graves病臨床檢測指標相關(guān)疾病患者體內(nèi)可溶性CD28濃度與疾病診斷的重要臨床實驗室指標的相關(guān)性分析表明，患者體內(nèi)可溶性⑶28水平與FT3、FT4和TRAb均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)、分別為0. 663、0.624和0. 728，可溶性⑶28濃度與血清TSH呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)、為-0. 726，提示可溶性⑶28的濃度是Graves病的重要生物學參數(shù)。5)可溶性⑶28濃度與臨床體征呈正相關(guān)為了進一步了解外周血可溶性CD28與病情的相關(guān)性，患者按其甲狀腺腫大的程度和突眼癥存在與否進行分組，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗進行組間比較，結(jié)果提示，外周血液中可溶性⑶28與Graves病患者的兩大主要體征，甲狀腺的腫大程度(P
<0. 05)和突眼癥(P < 0. 01)均具有顯著的正相關(guān)，提示可溶性⑶28與疾病的嚴重程度呈明顯正相關(guān)。6)可溶性CD28促進樹突狀細胞分泌IL-6通過對可溶性CD28融合蛋白與樹突狀細胞相互作用的培養(yǎng)上清中細胞因子的ELI SA檢測證實，可溶性CD28可以明顯促進IL-6的分泌(870. 52±73. 61pg/mlvs
4.25±2. 83pg/ml),而與正常對照組相比，IL-2的濃度無顯著性差異；但對Graves病人血清中IL-6含量進行測定后發(fā)現(xiàn)，患者血液中IL-6濃度也明顯高于正常人群健康對照組(73.46±9. 18pg/ml vs 8. 27±3. 24pg/ml)，而患者體內(nèi)IL-2含量則顯著減少(11. 54± I. 72pg/ml vs 15. 36± I. 48pg/ml),提示 IL-6 可能參與了 Graves’病的病理發(fā)病過程。
7)可溶性⑶28促進樹突狀細胞NF- k B的核轉(zhuǎn)位為了探討可溶性CD28對單核來源的樹突狀細胞表達目的分子的影響，采用共聚焦顯微鏡觀察到，可溶性CD28分子作用于體外誘導(dǎo)的單核來源的樹突狀細胞30min后，NF-kB已經(jīng)開始核轉(zhuǎn)位，60min后大部分NF-k B分子已經(jīng)從胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，120min后幾乎所有的NF- K B轉(zhuǎn)移到了細胞核內(nèi)部，上述結(jié)果表明，可溶性CD28分子與樹突狀細胞表達的目的分子相互作用后，通過逆向信號介導(dǎo)樹突狀細胞信號分子NF-k B核轉(zhuǎn)位，提示可溶性CD28具有調(diào)節(jié)樹突狀細胞功能的作用。4 結(jié)論本測定方法初步證實，Graves病患者外周血中可溶性⑶28含量異常增高，并伴有T細胞上膜型CD28分子的丟失，體外實驗證實，可溶性CD28分子還可以促進抗原遞呈細胞 樹突狀細胞的NF-k B分子核轉(zhuǎn)位和細胞因子IL-6的分泌，進一步探討聯(lián)合其他可溶性共刺激分子建立體外檢測的優(yōu)化方案，和在自身免疫性疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后評估中的意義，將為尋找新的免疫干預(yù)手段提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。上述實施例只是為了說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的是在于讓本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡是根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容的實質(zhì)所作出的等效的變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法,其特征在于,具體步驟為 步驟I)準備材料、試劑及血液標本 牛血清；RPMI1640或DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；CD28單抗2D5、2F5、3B6、3F8和8G8 ;親和層析柱Protein G免疫親和層析柱；rh⑶28/Fc重組蛋白；琥珀酰羥基生物素；二甲基亞砜；4%多聚賴氨酸；streptavidin-HRP ；avidin-PE ;酶標測定板；酶標測定儀；培養(yǎng)瓶；實驗儀器=CO2培養(yǎng)箱、離心機；倒置顯微鏡及熒光顯微鏡；流式細胞儀；TMB底物；人促甲狀腺激素試劑盒；淋巴細胞分離液；鼠抗人PE直接標記⑶3、⑶4、⑶8、⑶28、NF-K B單克隆抗體； 血液標本選取多例初發(fā)Graves病患者的血液標本作為實驗組，準備健康人血液標本多份作為正常對照組； 步驟2)單克隆抗體的生物素標記 用碳酸鹽緩沖液將純化的2D5單抗的濃度調(diào)整為200 u g/ml，取其I. Oml在50ml CBS中4°C透析過夜,移入Eppendof管，加入lmg/ml的生物素40 V- I,避光震蕩4h, 0. 01mol/LpH7. 2PBS中4°C透析72h，分裝后于_20°C保存?zhèn)溆茫? 步驟3)生物素標記單抗的鑒定 將⑶28-T轉(zhuǎn)基因細胞用PBS洗滌后，以5 X IO5/管的劑量分裝于小試管中，以20 iil/管的劑量加入生物素標記的單抗2D5,4°C反應(yīng)45min,充分洗漆后以IOy I/管的劑量加入avidin-PE，再于4V反應(yīng)45min，充分洗滌后用流式細胞儀分析，同時設(shè)置陰性對照； 步驟4) sCD28標準工作曲線的繪制 用2F5mAb包被經(jīng)0.01 %多聚賴氨酸預(yù)處理的酶聯(lián)檢測板，4 °C過夜，含0. 01 %Tween-20的PBS洗滌后，以3% BSA封閉過夜，洗滌后加入0 16ng/ml的標準品rhCD28/Fe重組蛋白的梯度稀釋液，反應(yīng)2h，充分洗滌后，再分別加生物素標記單抗和HRP標記鏈霉親和素，37 V反應(yīng)Ih，洗滌后，加TMB底物室溫反應(yīng)15min，用上述方法測定A45tl,每個梯度做3個復(fù)孔，以s⑶28/Fc的濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，繪制s⑶28的標準工作曲線； 步驟5) Graves病人血液中T細胞的分離和純化 抽取肝素抗凝的Graves病患者或健康人新鮮外周血IOml,用pH7. 2的無Ca2+、Mg2+Hank’ s液作I : 2稀釋后,輕懸于淋巴細胞分離液上，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心30min,棄上清；吸取界面云霧狀層細胞，加5倍體積的Hank’ s液,混勻，2000rpm,離心IOmin,棄上清；以1400rpm的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)lOmin，重復(fù)洗滌一次，計數(shù)，用含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為3X 106/ml，置6孔塑料培養(yǎng)板于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2h以去除貼壁的單核細胞及B細胞等，收集非貼壁細胞懸液，經(jīng)E花環(huán)結(jié)合法富集T細胞，經(jīng)流式細胞儀分析，⑶3+T細胞達到90%以上，液氮凍存?zhèn)溆茫? 步驟6) Graves病人T細胞的表型分析 液氮中復(fù)蘇凍存的患者和健康對照組的純化T細胞，用PBS洗滌2遍后，以5X IO5/管的劑量分裝于小試管中，分別加入⑶3、⑶4、⑶8、⑶28和ICOS分子的PE直標抗體10 U I及小鼠IgG-PE 10 u I作為陰性對照，于4°C避光反應(yīng)45min，經(jīng)含5%小牛血清的PBS洗滌后，加入0.5ml PBS后，用流式細胞儀分析T細胞表型，圖象處理運用EXPO v. 2 cytometersoftware分析軟件。
步驟7) Graves病人血液中可溶性⑶28含量的測定收集T細胞培養(yǎng)上清、Graves’病人血液中和對照組正常健康人血漿0. 5ml。取包被抗體2F5已經(jīng)預(yù)包被的檢測板，加入上述收集待測樣品100iU，37°C水浴反應(yīng)2h，充分洗滌后，加入生物素標記的單抗2D5，再于37 °C水浴反應(yīng)Ih充分洗滌后，加入streptavidin-HRP,反應(yīng)洗滌后，加入臨時配制的底物TMB，室溫反應(yīng)15min后，用2mol/LH2SO4終止酶與底物的反應(yīng)，于酶標儀測定A45tl,每個樣本設(shè)置三個復(fù)孔，同時用rh⑶28/Fc重組蛋白標準品制作線性標準曲線，以分析Graves病人血漿中可溶性⑶28含量； 步驟8)免疫印跡法分析患者血液中可溶性⑶28 分別收集T細胞培養(yǎng)上清、經(jīng)PHA活化的T細胞培養(yǎng)上清、健康人血清和Graves’病人血清，在上述蛋白質(zhì)樣品中加入I X SDS凝膠加樣緩沖液,于沸水中煮沸3min使蛋白質(zhì)變性，配制8%的積層膠和5%的分離膠，恒壓100伏特進行SDS-PAGE電泳3h，電泳結(jié)束后，剪取與凝膠塊相同大小的3M濾紙和硝酸纖維膜，并按照要求正確排列濾紙、硝酸纖維膜和 凝膠塊，恒流IOOmA電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜2h，用含5%脫脂奶粉和0. 3% Tween-20的PBS封閉硝酸纖維膜，搖床過夜，次日TBS洗滌后加入稀釋的鼠抗人⑶28抗體8G8 (10 u g/ml)，封閉2h，TBS充分洗滌，加入羊抗鼠IgG 二抗(I 1000稀釋)，室溫孵育2h，TBS充分洗滌后加入顯色液BCIP顯色，用ECL檢測系統(tǒng)的化學發(fā)光方法觀察特異性蛋白條帶； 步驟9)可溶性CD28對樹突狀細胞分泌的細胞因子的影響 無菌抽取正常人肝素抗凝外周血，常規(guī)Ficoll分離獲得單個核細胞，洗滌2遍后，用RPMI-1640調(diào)整細胞密度至3X106/ml，加入6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中，37°C培養(yǎng)2h，輕輕吸出懸浮細胞，_80°C凍存?zhèn)溆?。然后在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF (100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)、100IU/ml青霉素、IOOii g/ml鏈霉素的RPMI-1640，37°C培養(yǎng)，每3d換液一次。在培養(yǎng)的第6d，選用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)其成熟，然后加入⑶28重組蛋白，兩天后，收集細胞培養(yǎng)上清，測定細胞因子IL-2和IL-6濃度，同時設(shè)置陰性對照組； 步驟10)可溶性CD28對樹突狀細胞NF- K B核轉(zhuǎn)位的影響 收集成熟的樹突狀細胞并調(diào)整細胞濃度為I X 107/ml，分裝0. 5ml于無菌的EppendofT管中，加入⑶28融合蛋白分別培養(yǎng)30min、60min和120min，然后用PBS洗滌三次，然后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細胞20min，PBS室溫洗滌三次后，0. 1% Triton處理lOmin，PBS室溫洗滌三次后，Blocking buffer室溫封閉lh，以2 y g/管的劑量加入NF- k B單抗，室溫反應(yīng)2h，PBS室溫洗滌三次后，加入cy5標記的兔抗鼠二抗室溫繼續(xù)反應(yīng)lh，PBS洗滌后，以100 iil/管的劑量加入核染色劑PI和以IOiU/管的劑量加入RNase酶，37°C培養(yǎng)染色30min，PBS室溫洗滌三遍后，熒光封片劑封片，然后通過共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，對照組為人IgG抗體的Fe段，另外，收集LPS刺激的樹突狀細胞，通過流式細胞儀檢測細胞CD83、CD86和CD80的陽性百分率，分析樹突狀細胞的成熟程度； 步驟11)統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均用S表示，數(shù)據(jù)采用Kolmogorov-Smirnov檢驗,非參數(shù)統(tǒng)計分析視樣本類型不同分別米用Mann-Whitney、Kruskal_Wallis和Wilcoxon ranking檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，部分指標采用樣本均數(shù)比較用t檢驗，采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟I)中，在每升RPMI1640或DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加胎?；蛐∨Ｑ?00ml、L-谷氨酰胺 0. 15g、NaHC032. 0g、丙酮酸鈉 0. llg、葡萄糖 3. 6g、HEPES 4. 766g、濃度為 5X l(T3mol/L 的 2-巰基乙醇 10. 0ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟2)中的透析的72h第一天換液4次，以后每24h換液2 3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟6)的經(jīng)含5%小牛血清的PBS的洗漆為以1400r/min的轉(zhuǎn)速離心轉(zhuǎn)5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，其特征在于，所述步驟10)中PBS的洗漆為以1400r/min的速度離心轉(zhuǎn)5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，準備好材料、試劑及血液標本后，依次進行單克隆抗體的生物素標記，生物素標記單抗的鑒定，sCD28標準工作曲線的繪制，Graves病人血液中T細胞的分離和純化，Graves病人T細胞的表型分析，Graves病人血液中可溶性CD28含量的測定，免疫印跡法分析患者血液中可溶性CD28，可溶性CD28對樹突狀細胞分泌的細胞因子的影響，可溶性CD28對樹突狀細胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響等測定步驟并進行統(tǒng)計學分析。本測定Graves病病患者血液中可溶性CD28含量的方法，對進一步探討聯(lián)合其他可溶性共刺激分子建立體外檢測的優(yōu)化方案，和在自身免疫性疾病的臨床診斷、治療及預(yù)后評估中的促進意義，為尋找新的免疫干預(yù)手段提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/577GK102735841SQ201110091520
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者孫中文 申請人:蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院