專利名稱：抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其制備方法，具體講是一種抗牙鲆(Parah^i及M ohVaaM)黏液免疫球蛋白的單克隆抗體及其制備方法，屬于魚類分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
覆蓋在魚體皮膚、鰓和胃腸道等表面的黏膜樣淋巴組織及其分泌的黏液，構(gòu)成了魚類的黏膜免疫系統(tǒng)，是機(jī)體抵抗病原入侵的第一道防線。魚類黏膜組織中分布有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和各類粒細(xì)胞，使其具有獨(dú)立完成局部免疫應(yīng)答的功能。黏液中除含有溶菌酶和補(bǔ)體等非特異性的免疫成分外，還含有特異性抗體，在免疫保護(hù)過程中起著極其重要的作用。關(guān)于魚類黏液免疫球蛋白與血清免疫球蛋白的關(guān)系目前還存在許多爭議。文獻(xiàn)表明，魚類經(jīng)抗原浸泡免疫后，可在皮膚黏液檢測到特異性抗體，而在血清中很少或檢測不到這些抗體，推測黏液免疫球蛋白并非由血清中的免疫球蛋白轉(zhuǎn)移而來，而是由黏膜自身的漿細(xì)胞所分泌的。制備抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體，可以為闡明黏液免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)、來源、功能以及與血清免疫球蛋白和淋巴細(xì)胞的關(guān)系等提供有力工具；另外，魚類感染某種病原或接種疫苗后，魚體會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該病原/疫苗的特異性抗體。因此，利用抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體，通過檢測牙鲆黏液中該特異性抗體的產(chǎn)生，可以進(jìn)行牙鲆疾病的早期診斷和疫苗使用效果的評(píng)價(jià)，對(duì)牙鲆疾病的預(yù)防及治療具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)其他養(yǎng)殖魚類疾病的防治具有參考價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細(xì)胞JF-mlg，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC C201127，保藏日期為2011年04月25日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態(tài)良好的該雜交瘤細(xì)胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、 折光性強(qiáng)、細(xì)胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細(xì)胞有無限分裂增生能力；長勢良好的該雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由桃紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，其中含有該雜交瘤細(xì)胞分泌的大量抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體?！N所述抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟將牙鲆黏液經(jīng)鹽析結(jié)合柱層析法純化得到牙鲆黏液免疫球蛋白；以純化的牙鲆黏液免疫球蛋白為抗原免疫Balb/C小鼠；融合被免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞；經(jīng)免疫學(xué)檢測篩選方法， 篩選出分泌抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞JF-mlg，其分泌的抗體即為抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體。所述的鹽析結(jié)合柱層析法，是將牙鲆黏液經(jīng)飽和硫酸銨分步鹽析后，依次經(jīng)Sephacryl S-300凝膠過濾層析及DEAE kpharose離子層析進(jìn)一步純化得到牙鲆黏液免疫球蛋白。所述的免疫學(xué)檢測篩選方法是間接酶聯(lián)免疫法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法；其中所述的間接酶聯(lián)免疫法是將細(xì)胞融合后所得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與純化的牙鲆黏液免疫球蛋白于96孔酶標(biāo)板中反應(yīng)；繼而加入辣根過氧化物酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體；405 nm工作波長測定各孔光吸收值，篩選抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體。所述的轉(zhuǎn)印免疫印跡法是將雜交瘤細(xì)胞JF-mlg分泌的抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜的牙鲆黏液免疫球蛋白反應(yīng)，確定該單抗的抗原決定簇位于分子量為72 kDa的牙鲆黏液免疫球蛋白的重鏈上。所述的雜交瘤細(xì)胞JF-mlg分泌的單克隆抗體可以經(jīng)流式免疫熒光法或免疫電鏡法驗(yàn)證其特性。所述的流式免疫熒光法是雜交瘤細(xì)胞JF-mlg分泌的單克隆抗體與牙鲆外周血淋巴細(xì)胞懸液于培養(yǎng)板孔中反應(yīng)；繼而加入異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠抗體；用流式細(xì)胞儀檢測抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體可以與外周血淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合。所述的免疫電鏡法是將雜交瘤細(xì)胞JF-mlg分泌的單克隆抗體與牙鲆外周血淋巴細(xì)胞超薄切片反應(yīng)；繼而加入膠體金標(biāo)記的羊抗鼠抗體；用電鏡檢測單克隆抗體可以特異性結(jié)合淋巴細(xì)胞膜表面的抗原決定簇。本發(fā)明的制備技術(shù)路線設(shè)計(jì)新穎，其通過飽和硫酸銨分步鹽析
S-300凝膠過濾層析及DEAE Sepharose離子層析純化得到高純度的牙鲆黏液免疫球蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠；經(jīng)細(xì)胞融合、間接免疫熒光法篩選、克隆、篩選得到抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體；所得的單克隆抗體再經(jīng)流式免疫熒光法及免疫電鏡驗(yàn)證其特性。這樣的制備技術(shù)路線嚴(yán)密合理且可行，充分發(fā)揮了現(xiàn)有免疫學(xué)檢測篩選方法的作用和效果。由雜交瘤細(xì)胞JF-mlg分泌的抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體能與牙鲆黏液免疫球蛋白特異性結(jié)合。長勢良好的該雜交瘤細(xì)胞具有大小均一，外觀飽滿，渾圓透亮，分裂旺盛，能無限分泌單一、純凈抗體的特點(diǎn)。該雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)基中即含有了大量靈敏度高，效價(jià)好，特異性抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體。抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制得為研究黏液免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)、來源、功能及與淋巴細(xì)胞關(guān)系中的應(yīng)用提供了重要工具；同時(shí)該單抗可用于某病原或水產(chǎn)疫苗特異性抗體的檢測，從而進(jìn)行疾病的早期診斷和疫苗使用效果的評(píng)價(jià)，為牙鲆疾病的預(yù)防及治療提供了重要的技術(shù)手段，為其他養(yǎng)殖魚類疾病的防治提供參考。


圖1為本發(fā)明的單抗的轉(zhuǎn)印免疫印跡結(jié)果圖。圖2為本發(fā)明的單抗的流式免疫熒光檢測結(jié)果圖。圖3為本發(fā)明的單克隆抗體電鏡檢測結(jié)果圖。參見圖1-圖3。圖1所示1是標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；2表示總的牙鲆黏液蛋白考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；3表示提純的牙鲆黏液免疫球蛋白考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；4表示本發(fā)明的單抗與變性后的牙鲆黏液免疫球蛋白反應(yīng)，識(shí)別的蛋白為牙鲆黏液免疫球蛋白的重鏈，分子量為72 kDa。圖2所示A為牙鲆外周血淋巴細(xì)胞懸液流式檢測的散點(diǎn)圖；a為A圖對(duì)應(yīng)的流式直方圖；B為牙鲆脾淋巴細(xì)胞懸液流式檢測的散點(diǎn)圖；b為B圖對(duì)應(yīng)的流式直方圖；其中Ll 為陰性對(duì)照；L2為陽性細(xì)胞。圖3所示A為牙鲆外周血淋巴細(xì)胞免疫電鏡檢測結(jié)果；A-I和A-2為A圖局部膠體金放大圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1 抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體的制備。一、抗原的制備
(1)牙鲆黏液的收集
取10尾牙鲆用潔凈的玻片輕輕刮取魚體表面皮膚，將所取黏液混合，加入等量0. 01 mol/L PBS (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KC1,8. 09 mmol/L Na2HPO4,1. 47 mmol/L KH2PO4, pH 7. 4),15 000 g、4 °C離心 30 min，取上清，-80 °C凍存?zhèn)溆谩?2)牙鲆黏液免疫球蛋白的純化
①飽和硫酸銨分步鹽析取上述黏液樣品，緩慢加入PH 7.0的飽和硫酸銨溶液，使其終濃度達(dá)30%，4 °C靜置過夜，15 000 g離心30 min，取上清繼續(xù)加飽和硫酸銨溶液至最終飽和度為50%，同上處理，次日離心收集沉淀，沉淀溶解于0. 02 mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)，再用相同的緩沖液透析M h，每4 h換液一次，獲得的黏膜抗體粗提物于-80。C 保存。②S印hacryl - S300柱層析將上述提取物通過kphacryl S-300凝膠層析柱進(jìn)一步純化，以 0.02 mol/L pH 8.0 iTris-HCl 洗脫，流速 0. 5 mL/min，收集第一峰，-80 "C
保存?zhèn)溆?。③DEAE離子交換柱層析凝膠層析的第一個(gè)蛋白峰合并濃縮后再經(jīng)DEAE kpharose 柱層析，以濃度分別為 0. 05 mol/L,0. 1 mol/L,0. 15 mol/L,0. 2 mol/L,0. 4 mol/L和1 mol/L的NaCl溶液分步洗脫，收集0. 1 mol/L NaCl的洗脫峰，透析，凍干濃縮， 重懸于0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)中，調(diào)整蛋白含量為lmg/ml，-80 °C保存?zhèn)溆?。二、免疫小?br> 用提純的牙鲆黏液免疫球蛋白作為抗原。每次的免疫劑量為0.1 ml，免疫共分4次進(jìn)行，前2次免疫間隔為2周，腹腔注射；后3次免疫間隔為1周，尾靜脈注射。(1)基礎(chǔ)免疫提純的牙鲆黏液免疫球蛋白與福氏完全佐劑等量(V/V)混勻作為抗原；
(2)加強(qiáng)免疫提純的牙鲆黏液免疫球蛋白與福氏不完全佐劑等量(V/V)混勻作為抗
原；
(3)二次加強(qiáng)免疫提純的牙鲆黏液免疫球蛋白作為抗原；
(4)融合前三天的擴(kuò)增免疫提純的牙鲆黏液免疫球蛋白作為抗原。三、細(xì)胞融合(1)脫頸椎處死免疫小鼠，無菌取出脾臟和胸腺后，分別過100目網(wǎng)篩，用RPMI-1640溶液吹打形成單細(xì)胞懸液；
(2)分別將脾細(xì)胞懸液和胸腺細(xì)胞懸液1000rpm離心3 min，棄去上清液，脾細(xì)胞沉淀用RPMI-1640溶液重懸，胸腺細(xì)胞沉淀用含有1%HAT的RPMI-1640 (含10%胎牛血清)選
擇性細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。(3)取3X107個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的P3-X63-Ag8Ul骨髓瘤細(xì)胞，1000 rpm離心3 min，去上清液后，用RPMI-1640溶液重懸；
(4)將脾細(xì)胞懸液與瘤細(xì)胞懸液混合均勻后，1000rpm離心3 min，完全吸去上清液，輕彈離心管底，使兩種細(xì)胞沉淀充分混勻成糊狀；用吸管吸取預(yù)溫到37 ！的聚乙二醇溶液 lml，滴加到離心管內(nèi)，在1 min內(nèi)加完；然后在37 °〇水浴靜置5 min；
(5)繼續(xù)滴加已經(jīng)預(yù)溫到37！的RPMI-1640溶液15 ml，使PEG稀釋而失去作用；
(6)補(bǔ)加RPMI-1640溶液至40ml，經(jīng)1000 rpm離心3 min，棄去上清液；
(7)將沉淀的細(xì)胞用3ml37 V的RPMI-1640 (含10%胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，凍存 2ml ；
(8)將剩下的1ml細(xì)胞懸液加入( 制成的胸腺細(xì)胞懸液，混合均勻后滴加到96孔培養(yǎng)板中；
(9)將培養(yǎng)板放入37V，CO2濃度為4. 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，大約兩周后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測。四、篩選和克隆
(1)篩選融合后，待雜交瘤細(xì)胞群長到96孔培養(yǎng)板的孔底面積1/3時(shí)開始檢測， 采用間接酶聯(lián)免疫技術(shù)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。①包被抗原將提純的牙鲆黏液免疫球蛋白用碳酸鹽包被液(pH 9.6) 1:10稀釋，加入96孔酶標(biāo)板中(50 μ /孔)，4 °C包被過夜;
②吸出包被液，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，每次5 min,洗三
次；
③每孔加入200μ13%的牛血清白蛋白(PBS配)，37 °C封閉1 h;
④同②法洗滌三次；
⑤將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50μ 加入至酶標(biāo)板，37 ！溫箱孵育
1 h；
⑥同②法洗滌三次；
⑦堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50 μ 加入至酶標(biāo)板，37 ！溫箱孵育1 h;
⑧同②法洗滌三次；然后每孔加入100μ 4-硝基酚磷酸鹽(ρΝΡΡ)應(yīng)用液，暗處反應(yīng) 5-20 min，每孔加入50 μ 2Μ的NaOHjIlS 3 — 5 min即可用405 nm工作波長測定OD值。測波長為405 nm時(shí)各孔光吸收值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔與陰性對(duì)照光吸收值之比(P/ N)，當(dāng)P/N彡2. 1時(shí)該孔為陽性。(2)克隆采用有限稀釋法對(duì)檢測出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，步驟如下 ①脫頸椎處死小鼠，無菌取出胸腺，在100目網(wǎng)篩上研磨，用RPMI-1640溶液吹打形成單細(xì)胞懸液；
②把胸腺細(xì)胞懸液1000rpm離心3 min，棄去上清液，胸腺細(xì)胞沉淀用10 ml RPMI-1640 (含10%胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸；
③把要克隆的陽性細(xì)胞孔中的細(xì)胞用血球記數(shù)板記數(shù)，然后用培養(yǎng)液以10倍梯度稀釋，取出100個(gè)雜交瘤細(xì)胞，放入胸腺細(xì)胞懸液中；
④細(xì)胞懸液用滴管吹打均勻，滴加到96孔培養(yǎng)板中，每孔100μ ，平均每個(gè)孔含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞；
⑤放入(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑥兩周后通過間接酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測各孔雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，把所得陽性克隆孔的雜交瘤細(xì)胞按上述方法再克隆一次，以保證形成單克隆。五、凍存
取生長旺盛，形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，200 g離心5 min，去上清，加凍存液(9份RPMI-1640培養(yǎng)基+ 1份二甲亞砜)，使最終細(xì)胞密度為5X IO6個(gè)/ml，將1 ml細(xì)胞懸液裝于2 ml凍存管中，擰緊螺蓋，然后將凍存管裝入盛有棉花的小盒內(nèi)，放于-80°C超低溫冰箱內(nèi)過夜(8-12 h)后，再浸入液氮內(nèi)長期保存。本發(fā)明獲得了外觀飽滿，渾圓透亮， 分裂旺盛的雜交瘤細(xì)胞，其名稱為雜交瘤細(xì)胞JF-mlg，保藏號(hào)為CCTCC C201127，保藏日期為2011年04月25日。實(shí)施例2 本發(fā)明單克隆抗體的間接酶聯(lián)免疫法鑒定。(1)包被抗原將提純的牙鲆黏液免疫球蛋白用碳酸鹽包被液(pH 9.6) 1:10稀釋，加入96孔酶標(biāo)板中(50 μ /孔)，4 °C包被過夜;
(2)吸出包被液，用PBST洗滌，每次5min，洗3次；
(3)每孔加入200μ 3%的牛血清白蛋白(PBS配)37 °C封閉1 h;
(4)同②法洗滌3次；
(5)將上述篩選和克隆出的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50μ 加入至酶標(biāo)板，37 ！溫箱孵育1 h;
(6)同②法洗滌3次；
(7)堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50 μ 加入至酶標(biāo)板，37 ！溫箱孵育1 h ；
(8)同②法洗滌3次；然后每孔加入100μ ρΝΡΡ應(yīng)用液，暗處反應(yīng)5-20 min，每孔加入50 μ 2Μ的NaOH，穩(wěn)定3_5 min即可用405 nm工作波長測定OD值。用包被PBS作為陰性對(duì)照，測波長為405 nm時(shí)各孔光吸收值，計(jì)算陽性血清與PBS 光吸收值之比(P/N)，當(dāng)P/N彡2. 1時(shí)為陽性。結(jié)果陽性0. 462 ；陰性對(duì)照0. 092。該結(jié)果證實(shí)本發(fā)明單抗能與牙鲆黏液免疫球蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。實(shí)施例3:本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)印免疫印跡法鑒定。(1)十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳
①將提取的牙鲆黏液免疫球蛋白加入等比例含十二烷基磺酸鈉的樣品緩沖液，在沸水中煮3-5 min ；
②將①處理過的樣品加入上樣孔中，每孔內(nèi)加樣品10μ ，在恒流條件下，起始時(shí)用低電流(30-40 mA)，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，加大電流(50-70 mA)，電泳至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳，取出凝膠；
③剪取一塊與電泳凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(孔徑0.22Mm)以電轉(zhuǎn)移緩沖液 (電轉(zhuǎn)移緩沖液25 mmol/L Tris-Base, 192 mmol/L甘氨酸，20%甲醇，pH 8. 3)潤濕，放在電泳后的凝膠上。在硝酸纖維素膜上剪掉一個(gè)角，以標(biāo)志樣品順序的起始端。用潤濕的濾紙支持，將第二塊潤濕的濾紙貼在凝膠片的另一面；按上述放置順序，使膠塊與硝酸纖維素膜及濾紙形成一套夾心的〃三明治〃；
④將“凝膠三明治“置入盛有電轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽內(nèi)，將硝酸纖維素膜面向陽極； 電泳恒流200 mA，通電5小時(shí)；
⑤轉(zhuǎn)移完畢，取出硝酸纖維素膜。(2)免疫印跡
①將硝酸纖維素膜用PBS洗10min，然后置3%的牛血清白蛋白溶液(PBS配)中封閉 Ih, 37 "C ；
②用PBST洗3次，每次5min ；
③將硝酸纖維素膜置于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中，37 ！緩慢搖動(dòng)1 h;
④同②法洗滌3次；
⑤將硝酸纖維素膜加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ig抗體(1:4000稀釋)中，37°C 緩慢搖動(dòng)1小時(shí)；
⑥同②法洗滌3次；
⑦把硝酸纖維素膜放入堿性磷酸酶發(fā)色液(NBT-BCIP發(fā)色液)中發(fā)色，直到顏色清晰為止；
⑧用去離子水洗滌，以終止反應(yīng)。將硝酸纖維素膜夾在濾紙間，干燥。置暗處保存。結(jié)果本發(fā)明單抗與分子量為72 kDa的牙鲆黏液免疫球蛋白的重鏈發(fā)生特異性反應(yīng)，顯示紫褐色條帶，而陰性對(duì)照無條帶顯示。實(shí)施例4 本發(fā)明單克隆抗體的流式免疫熒光法檢測。(1)牙鲆外周血淋巴細(xì)胞懸液的制備
注射器中預(yù)先放置適量的單細(xì)胞懸浮介質(zhì)eRPMI (65% RPMI-1640雙蒸水稀釋，含20 IU πιΓ1 heparin, 0. 1% (w/v) NaN3 和 1% (w/v)的牛血清白蛋白，pH 7. 4,240 mOsm kg-1)， 采集健康牙鲆血液，采集的血液4 °C放置1 h，然后4 1下100 g離心10 min，去沉淀，上清用于制備外周血單細(xì)胞懸液； (2)流式細(xì)胞術(shù)
①粗提的白細(xì)胞約IXIO7個(gè)用500 μ 雜交瘤培養(yǎng)上清重懸，4 °C孵育1 h ；
②PBS680 g，4 ！離心洗滌3次，每次5 min ；
③加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠Ig(1:500稀釋)，4 °C孵育1 h;
④PBS680 g，4 ！離心洗滌3次，每次5 min ；
⑤PBS重懸，細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩絹網(wǎng)過濾后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果如圖3所示外周血淋巴細(xì)胞懸液在陰性對(duì)照中，熒光值較低；而經(jīng)抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體反應(yīng)后，熒光值顯著增加，陽性率高達(dá)38. 64%，表明本發(fā)明單克隆抗體可以與外周血淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合。
實(shí)施例5 本發(fā)明單克隆抗體的免疫電鏡檢測。(1)牙鲆外周血淋巴細(xì)胞懸液的制備
按照實(shí)施例4中的方法，制備牙鲆外周血淋巴細(xì)胞懸液，680 g，4 °C離心，收集細(xì)胞沉淀。(2)免疫電鏡檢測
①超薄切片后，金網(wǎng)撈片；
②1% 200 ul處理30 min后，雙蒸水清洗；
③加入3%BSA 200 ul (溶解于 PBS)，37 °C封閉 45 min ；
④用PBST洗滌，每次5min，洗3次；
⑤加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為第一抗體200ul，37°C孵育45 min；
⑥同②法洗滌3次；
⑦加入15-nm的膠體金標(biāo)記羊抗小鼠IgG150ul (1 100)作為第二抗體，37 °C孵育 45 min ；
⑧雙蒸水浸洗3次，晾干，然后21的磷鎢酸負(fù)染色1min ；
⑨吸去殘留染液，電鏡觀察，拍照。結(jié)果如圖4所示視野背景清潔，無散在的金顆?；蚱渌廴疚?，膠體金顆粒集中結(jié)合在淋巴細(xì)胞膜周圍，在細(xì)胞外區(qū)域沒有的膠體金顆粒散布。該結(jié)果直接證明了本發(fā)明單抗可特異性結(jié)合淋巴細(xì)胞膜表面的抗原決定簇。流式免疫熒光和免疫電鏡檢測結(jié)果表明黏液免疫球蛋白與外周血淋巴細(xì)胞膜表面免疫球蛋白有相似的抗原特性，從而證實(shí)本發(fā)明單抗可以用作研究黏液免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)、來源及在黏膜免疫應(yīng)答中的功能的重要工具。另外，可以通過檢測牙鲆黏液中某病原或疫苗的特異性抗體，進(jìn)行牙鲆疾病的診斷及疫苗使用效果的評(píng)價(jià)，使得本發(fā)明單抗可用于制備牙鲆疾病早期診斷試劑盒或構(gòu)建疫苗使用效果評(píng)價(jià)體系，為牙鲆疾病的預(yù)防及治療提供工具與技術(shù)手段，為其他養(yǎng)殖魚類疾病的防治提供參考。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細(xì)胞JF-mlg，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC C201127，保藏日期為2011年04月25日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。
2.一種如權(quán)利要求1所述的抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟將牙鲆黏液經(jīng)鹽析結(jié)合柱層析法純化得到牙鲆黏液免疫球蛋白；以純化的牙鲆黏液免疫球蛋白為抗原免疫Balb/C小鼠；融合被免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞；經(jīng)免疫學(xué)檢測篩選方法，篩選出分泌抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞JF-mlg ；其分泌的抗體即為抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的鹽析結(jié)合柱層析法是將牙鲆黏液經(jīng)飽和硫酸銨分步鹽析后，依次經(jīng)kphacryl S-300凝膠過濾層析及DEAE Sepharose離子層析進(jìn)一步純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的免疫學(xué)檢測篩選方法是間接酶聯(lián)免疫法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的間接酶聯(lián)免疫法是將細(xì)胞融合后所得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與純化的牙鲆黏液免疫球蛋白于96孔酶標(biāo)板中反應(yīng)；繼而加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體；405 nm工作波長測定各孔光吸收值，篩選抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體，即雜交瘤細(xì)胞 JF-mlg分泌的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗牙鲆黏液免疫球蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)印免疫印跡法是將雜交瘤細(xì)胞JF-mlg分泌的單克隆抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜的牙鲆黏液免疫球蛋白反應(yīng)，確定該單抗的抗原決定簇位于分子量為72 kDa的牙鲆黏液免疫球蛋白的重鏈上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗牙鲆黏液免疫球蛋白的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為雜交瘤細(xì)胞JF-mIg，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201127，保藏日期為2011年04月25日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。本發(fā)明的單克隆抗體能與牙鲆黏液免疫球蛋白特異性結(jié)合，為研究黏液免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)、來源、功能及與淋巴細(xì)胞關(guān)系中的應(yīng)用提供了重要工具；同時(shí)該單抗可用于某病原或水產(chǎn)疫苗特異性抗體的檢測，從而進(jìn)行疾病的早期診斷和疫苗使用效果的評(píng)價(jià)，為牙鲆疾病的預(yù)防及治療提供了重要的技術(shù)手段，為其他養(yǎng)殖魚類疾病的防治提供參考。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102199212SQ20111011597
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 繩秀珍, 許國晶, 邢婧 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)