專利名稱：快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是食源性微生物檢測(cè)領(lǐng)域，公開了一種以核磁共振方法檢測(cè)生物功能化超順磁納米粒子免疫識(shí)別目標(biāo)微生物，實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法。
背景技術(shù)：
許多食源性疾病大多都是由食源性致病菌引起的。食源性致病菌快速檢測(cè)一直是研究關(guān)注的焦點(diǎn)。食源性致病菌快速檢測(cè)是采用微生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物物理、免疫學(xué)的方法對(duì)食品及其加工、貯藏等環(huán)境中的致病菌進(jìn)行分離、檢測(cè)、鑒定和計(jì)數(shù)。阪崎腸桿菌是乳制品中新發(fā)現(xiàn)的一種病原菌，已被世界衛(wèi)生組織和許多國(guó)家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌。阪崎腸桿菌(又稱阪崎氏腸桿菌)是腸桿菌科的一種，1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌。該菌引起的食源性疾病可導(dǎo)致嬰兒(尤其是新生」L )的腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥，報(bào)告病例的死亡率達(dá)20 % 50 %，幸存者常遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來對(duì)食品(奶粉、巧克力、谷類食品、馬鈴薯、意大利面等)加工廠原料、生產(chǎn)環(huán)境及家庭中阪崎腸桿菌污染率的研究發(fā)現(xiàn)，阪崎腸桿菌在自然界中分布廣泛。在多起阪崎腸桿菌的暴發(fā)事件中發(fā)現(xiàn)，新生兒阪崎腸桿菌感染與嬰兒配方粉(powdered infant formula, PIF)密切相關(guān)。2004年2月FA0PWH0在日內(nèi)瓦召開的嬰兒配方粉中阪崎腸桿菌專家研討會(huì)上提出，嬰兒配方粉中微量的阪崎腸桿菌污染(<3CFUP100g)也能導(dǎo)致感染的發(fā)生。即使是嬰兒配方粉中大腸菌群污染水平符合相應(yīng)的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，也可能存在阪崎腸桿菌的污染。PIF中阪崎腸桿菌的污染已經(jīng)引起國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。2002年國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICMSF)把阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危害特定人群，危害生命或慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥或長(zhǎng)期影響”的一種致病菌。從2005年開始我國(guó)陸續(xù)出臺(tái)了阪崎腸桿菌檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。雖然標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性和靈敏度較高，但存在操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)等缺陷。分子技術(shù)比如 PCR技術(shù)應(yīng)用于阪崎腸桿菌的檢測(cè)，用PCR技術(shù)檢測(cè)有害微生物具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，但是PCR反應(yīng)受樣品情況的影響比較大，特別在食源性有害微生物檢查中，食品中的成分(糖類、酸類，油脂等物質(zhì))會(huì)干擾反應(yīng)的正常進(jìn)行。而檢測(cè)的環(huán)境， 中間處理環(huán)節(jié)也會(huì)帶來一些PCR反應(yīng)抑制劑。從而使PCR反應(yīng)呈現(xiàn)較高的假陽(yáng)性和假陰性率。近年來，隨著科技的發(fā)展，納米技術(shù)和核磁共振技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)與前景越來越廣泛，應(yīng)用范圍也趨于多樣化。在靜磁場(chǎng)中，具有磁性的原子核存在不同能級(jí)。用一特定頻率的電磁波(射頻場(chǎng))照射樣品，當(dāng)電磁波能量等于能級(jí)差時(shí)，原子核吸收電磁波發(fā)生能級(jí)躍遷，產(chǎn)生共振吸收信號(hào)，此即核磁共振。核磁共振(NMR)技術(shù)就是利用高磁場(chǎng)中原子核對(duì)射頻輻射的吸收光譜來鑒定化合物結(jié)構(gòu)的分析技術(shù)。核磁共振技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用的有細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、支原體等多種微生物的代謝研究；酒類樣品的質(zhì)量鑒定；肉類樣品的質(zhì)量檢驗(yàn)；食品中污染物的分析；核磁共振磷譜31P NMR與HPLC聯(lián)用篩選高效有機(jī)磷降解細(xì)菌；食品中農(nóng)藥殘留物的分析測(cè)定等。核磁共振技術(shù)具有與其他方法相比較的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)(1)對(duì)樣品沒有損傷性，它并不破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，無(wú)輻射損傷；(2)只需簡(jiǎn)單預(yù)處理(不必進(jìn)行提取分離)就可以同時(shí)測(cè)定多種成分；(3)定量測(cè)定不需標(biāo)定(4)分析速度與精密度接近于高效液相色譜法；(5)實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣。所以核磁共振技術(shù)在食品中的應(yīng)用和發(fā)展也越來越趨于廣泛。為了食品安全，為了尋求更簡(jiǎn)便、快速、靈敏的食源性致病菌的檢測(cè)方法，為了替可能出現(xiàn)的食品安全問題提供應(yīng)對(duì)方法，需要對(duì)現(xiàn)有的檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法。這種快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，包括如下步驟(1)向待測(cè)的樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠和穩(wěn)定劑，30 40°C孵育45 60分鐘；(2)將步驟(1)混合物加入核磁管中，測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間，以不含菌的樣品為空白對(duì)照，計(jì)算八1~2值；所述的穩(wěn)定劑為牛奶，在混合體系中質(zhì)量含量為1 3% ；所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內(nèi)核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯(lián)抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。優(yōu)選的，抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為80 120nm，用量為0. 5 0. lmg/ml。所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟(1)包被二氧化硅和表面氨基化將粒徑10 70nm的四氧化三鐵納米磁核的環(huán)己烷溶液與正硅酸四乙酯和氨水混合，加入過硫酸銨，攪拌反應(yīng)48 96小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮，過濾洗滌；四氧化三鐵納米磁核、正硅酸四乙酯和過硫酸銨的質(zhì)量比為1 0.018 0. 02 0. 003 0. 004 ；(2)連接抗體特異性抗體活化后分散在pH 7. 3 7. 6磷酸緩沖液中，加入步驟 (1)所得表面氨基化的納米磁珠，2 8°C反應(yīng)8 12小時(shí)；表面氨基化的納米磁珠與特異性抗體重量比為1 0. 1 0.2 ；所述抗阪崎腸桿菌多克隆抗體用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺)活化。用核磁共振分析儀測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間，核磁管直徑為3cm時(shí)參數(shù)設(shè)定 Dl(Us) 100 ；D2(us) :200 ；D0(ms) :100 ；TD :20000 ；Sff (kHz) :75.0 ；DFff (kHz) :30.0 ；RG 2 ； Ns 8 ；Cl 2000 ；Ds :3。本方法首先制備四氧化三鐵超順磁性納米磁珠，納米磁珠表面包被上二氧化硅， 使磁珠有更好的分散性和對(duì)生物大分子有更好的相容性。表面修飾以氨基，使其能與抗體結(jié)合，加入特異性抗體，制成免疫化的超順磁性納米磁珠。然后將免疫化超順磁性納米磁珠加入到樣品中，加入穩(wěn)定劑，30 40°C孵育45 60min，磁珠特異性結(jié)合和富集到樣品中被檢微生物食源性致病菌阪崎腸桿菌上。本方法中制備的磁珠粒徑較小，容易發(fā)生團(tuán)聚成簇的現(xiàn)象，所以加入穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑能使帶磁珠的菌體懸浮在溶液中，并且使各個(gè)菌體之間保持一定的距離，這樣可以避免磁珠過于聚集或者沉降。優(yōu)化穩(wěn)定劑得到最優(yōu)的穩(wěn)定劑為牛奶。處理好的樣品加到核磁管中，設(shè)定參數(shù)，進(jìn)行核磁共振檢測(cè)。磁珠從分散狀態(tài)到聚集狀態(tài)的改變，伴隨著溶液水質(zhì)子的自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)的改變，核磁共振儀檢測(cè)出 T2值的改變以此判定樣品中是否存在被檢微生物食源性致病菌阪崎腸桿菌。樣品中被檢菌越少，有效的結(jié)合富集到被檢菌表面的磁珠的比例就會(huì)增大，導(dǎo)致自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2) 有很大的改變，當(dāng)樣品中被檢菌數(shù)目增多，被檢菌更多的抗原決定簇就會(huì)去競(jìng)爭(zhēng)有效的磁珠，導(dǎo)致結(jié)合到菌表面的磁珠呈現(xiàn)一種貌似分散的狀態(tài)，自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)就會(huì)有很小的改變。本方法對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)具有高度特異性和靈敏性，而且快速，尤其適用于檢測(cè)低濃度的阪崎腸桿菌，尤其是乳制品中的阪崎腸桿菌。本方法能高靈敏度地檢測(cè)出樣品中的目標(biāo)菌，尤其在低濃度的目標(biāo)菌情況下極為靈敏。阪崎腸桿菌在乳制品中含量極少，本方法對(duì)樣品處理簡(jiǎn)單，而且只需要少量的樣品。整個(gè)檢測(cè)過程僅需1. 5小時(shí)，操作方便、簡(jiǎn)單，可靠性好，對(duì)配套設(shè)備要求低。


圖1為實(shí)施例2不同濃阪崎腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果。圖2為實(shí)施例3檢測(cè)阪崎腸桿菌、大腸桿菌等其他對(duì)照菌和5種混合菌的檢測(cè)結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明實(shí)施例1免疫化(生物功能化)超順磁性納米磁珠的制備1、四氧化三鐵(Fe3O4)的合成以及包被和氨基功能化①、20mM(3. 25g)的三氯化鐵、120mM(12. ;3mL)的乙酰丙酮、20mL的蒸餾水混合攪拌15min，加入6mL三乙胺，過濾，得紅色粉末，溶于30mL無(wú)水乙醇和蒸餾水(V V 7 3)， 加熱至80°C，冷卻至室溫重結(jié)晶，得乙酰丙酮合鐵。1. 06g乙酰丙酮合鐵加入到15mL苯醚、15mL油胺的體系中，磁力攪拌，不斷升溫至 115°C (溫度范圍可以在110 120°C)，維持30分鐘，抽真空，繼續(xù)升溫至180°C (溫度范圍可以在175 185°C )，維持30分鐘，繼續(xù)升溫至300°C (溫度范圍可以在300 305°C )， 維持1小時(shí)，冷卻至室溫(其間一直用氮?dú)獗Ｗo(hù))。產(chǎn)品磁核狗304用無(wú)水乙醇洗4次，溶解于正己烷中，4°C保存。②、由于磁核!^e3O4的分散性不好，粒徑也不均勻，且易于和其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以必須對(duì)磁核進(jìn)行包裹，來得到化學(xué)性能穩(wěn)定、分散性好的核殼型磁珠。將2. Og IGEPAL C0-520與35mL環(huán)己烷混合均勻，加入IOmgFe3O4，分散均勻；混合液室溫移至三口燒瓶中， 連續(xù)攪拌，加入0. 35mL質(zhì)量濃度25 0Z0 沘％氨水，0. 2mL正硅酸四乙酯(TE0S，0. 186 0. 188mg)，攪拌2個(gè)小時(shí)后，加入35uLAPS (過硫酸銨，0. 033mg)，繼續(xù)攪拌3天。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，立即加入丙酮，過濾，用無(wú)水乙醇洗3次。制得表面氨基化包被上二氧化硅的磁珠。2、氨基功能化磁珠和抗體的連接兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體200uL (濃度6. 82mg/ml)，用200mgEDC. HCL (1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和250mgNHS(N-羥基丁二酰亞胺)活化，4°C孵育一夜，分散到Wi 7. 5的PBS中。加入IOmg氨基功能化的磁珠，4°C輕搖過夜。磁性分離后， 將得到的粒子重新分散于緩沖溶液中，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2將實(shí)施例1制得的免疫化的超順磁性納米磁珠分散在磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L, PH = 7. 2)中，濃度為0. 8mg/mL (實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過的數(shù)據(jù))。取225uL的上述磁珠加入到75uL已經(jīng)孵育池的含不同濃度阪崎腸桿菌的(lcfu/ ml、10cfu/ml、25cfu/ml、50cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml)乳制品樣品中，加入 2. 7mL的穩(wěn)定劑2%的牛奶，37°C孵育45min 60min (實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的數(shù)據(jù))。用不含菌的乳制品樣品作為對(duì)照。將處理好的樣品加入到直徑3cm的核磁管中，將核磁管放入核磁共振分析儀內(nèi)， 調(diào)整參數(shù)，Dl(Us) 100 ；D2(us) :200 ；DO (ms) 100 ；TD 20000 ；Sff (kHz) 75. 0 ；DFff (kHz) 30. 0 ；RG 2 ；Ns 8 ；Cl :2000 ；Ds :3，核磁共振分析儀NM120-Analyst,測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)，計(jì)算Δ T2值。結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例3將實(shí)施例1制得的免疫化的超順磁性納米磁珠分散在磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L, PH = 7. 2)中，濃度為0. 8mg/mL (實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過的數(shù)據(jù))。取225uL的上述磁珠加入到75uL已經(jīng)孵育池的乳制品樣品中(阪崎腸桿菌濃度 102cfu/ml)，加入2. 7mL的穩(wěn)定劑2%的牛奶，37°C孵育45min 60min (實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的數(shù)據(jù))。 用不含菌的乳制品樣品作為對(duì)照。將處理好的樣品加入到直徑3cm的核磁管中，將核磁管放入核磁共振分析儀內(nèi)， 調(diào)整參數(shù)，Dl(Us) 100 ；D2(us) :200 ；DO (ms) 100 ；TD 20000 ；Sff (kHz) 75. 0 ；DFff (kHz) 30. 0 ；RG 2 ；Ns 8 ；Cl :2000 ；Ds :3，核磁共振分析儀NM120-Analyst,測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)，計(jì)算Δ T2值。并且用同樣條件檢測(cè)相同濃度(102CfU/ml)的大腸桿菌0157、志賀氏菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌以及混合菌(上述5種菌的混合物與阪崎腸桿菌混合而成，阪崎腸桿菌在總菌數(shù)中的比例為50%，混合菌的總濃度102CfU/ml)，用不含菌的樣品為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示，說明本方法對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)具有高度特異性。免疫化超順磁性納米磁珠磁珠從分散狀態(tài)到聚集狀態(tài)的改變，伴隨著溶液水質(zhì)子的自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)的改變，核磁共振儀檢測(cè)出T2值的改變以此判定樣品中是否存在被檢微生物食源性致病菌阪崎腸桿菌。樣品中被檢菌越少，有效的結(jié)合富集到被檢菌表面的磁珠的比例就會(huì)增大，導(dǎo)致自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)有很大的改變，當(dāng)樣品中被檢菌數(shù)目增多，被檢菌更多的抗原決定簇就會(huì)去競(jìng)爭(zhēng)有效的磁珠，導(dǎo)致結(jié)合到菌表面的磁珠呈現(xiàn)一種貌似分散的狀態(tài)，自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)就會(huì)有很小的改變。因此，本發(fā)明的方法對(duì)于阪崎腸桿菌有很高的靈敏性，尤其適用于檢測(cè)低濃度的阪崎腸桿菌。根據(jù)實(shí)施例2和3特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果、目標(biāo)微生物梯度稀釋以及檢測(cè)其它的對(duì)照菌，核磁共振測(cè)得的自旋-自旋弛豫時(shí)間改變?chǔ)う?值大于或等于20時(shí)為陽(yáng)性結(jié)果，可以確定有阪崎腸桿菌存在，應(yīng)按依照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)陽(yáng)性結(jié)果及可疑陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行培養(yǎng)法檢查，并根據(jù)培養(yǎng)法檢查結(jié)果做報(bào)告。 Δ T2值小于20時(shí)有兩種可能(1)目標(biāo)微生物(阪崎腸桿菌)數(shù)大于IOOOcfu/ ml ；或，(2)空白對(duì)照(沒有阪崎腸桿菌存在)中由于磁珠偶聯(lián)抗體的自行聚合，造成AT2 值變化小，此時(shí)需要進(jìn)一步培養(yǎng)或用其他方法鑒定。
權(quán)利要求
1.快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)向待測(cè)的樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠和穩(wěn)定劑，30 40°C孵育45 60 分鐘；(2)將步驟(1)混合物加入核磁管中，測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間，以不含菌的樣品為空白對(duì)照，計(jì)算八1~2值；所述的穩(wěn)定劑為牛奶，在混合體系中質(zhì)量含量為1 3% ；所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內(nèi)核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯(lián)抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。
2.權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，所述的抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。
3.權(quán)利要求1所述所述快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，所述免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為80 120nm，用量為0. 5 0. lmg/ml。
4.權(quán)利要求1所述所述快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟(1)包被二氧化硅和表面氨基化將粒徑10 70nm的四氧化三鐵納米磁核的環(huán)己烷溶液與正硅酸四乙酯和氨水混合，加入過硫酸銨，攪拌反應(yīng)48 96小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮，過濾洗滌；(2)連接抗體特異性抗體活化后分散在PH7. 3 7. 6磷酸緩沖液中，加入步驟(1)所得表面氨基化的納米磁珠，2 8V反應(yīng)8 12小時(shí)；所述抗阪崎腸桿菌多克隆抗體用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和 N-羥基丁二酰亞胺)活化。
5.權(quán)利要求4所述所述快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，步驟(1)所述四氧化三鐵納米磁核的制備方法為在氮?dú)獗Ｗo(hù)和真空條件下，乙酰丙酮鐵在油胺和苯醚體系中， 依次在Iio 120°C和175 185°C保溫20 60分鐘；再升溫至300 305°C保溫1 2 小時(shí)。
6.權(quán)利要求4所述所述快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，步驟(1)所述四氧化三鐵納米磁核、正硅酸四乙酯和過硫酸銨的質(zhì)量比為1 0.018 0.02 0.003 0.004。
7.權(quán)利要求4所述所述快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，步驟( 所述表面氨基化的納米磁珠與特異性抗體重量比為1 0. 1 0. 2。
8 權(quán)利要求1所述所述快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，其特征在于，用核磁共振分析儀測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間，核磁管直徑為3cm時(shí)參數(shù)設(shè)定Dl(Us) 100 ；D2(us) :200; DO (ms) 100 ；TD :20000 ；Sff (kHz) :75. 0 ；DFff (kHz) :30. 0 ；RG 2 ；Ns 8 ；Cl :2000 ；Ds :3。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，公開了一種快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法。將免疫化超順磁性納米磁珠加入到樣品中，加入穩(wěn)定劑，30～40℃孵育45～60min，磁珠特異性結(jié)合和富集到樣品中被檢微生物食源性致病菌阪崎腸桿菌上；測(cè)定自旋-自旋弛豫時(shí)間，以不含菌的樣品為空白對(duì)照，計(jì)算ΔT2值。本方法對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)具有高度特異性和靈敏性，而且快速，尤其適用于檢測(cè)低濃度的阪崎腸桿菌，尤其是乳制品中的阪崎腸桿菌；操作方便、簡(jiǎn)單，可靠性好，對(duì)配套設(shè)備要求低。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102323408SQ201110143730
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者趙渝, 郭魯申, 陳艷, 黃慧心 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)