專利名稱：山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
山羊痘是由山羊痘病毒屬山羊痘病毒(goat poxvirus，GTPV)引起的一種呈地方流行的高度接觸性傳染病。一年四季均可發(fā)生，春秋常見，不分性別、年齡、品種。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將山羊痘列為A類重大傳染病，1999年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第96號(hào)公告將山羊痘列為國(guó)家一類動(dòng)物疫病。近年來，我國(guó)二十多個(gè)省市相繼報(bào)導(dǎo)山羊痘發(fā)生流行，給我國(guó)蓬勃興起的山羊養(yǎng)殖業(yè)造成了極大經(jīng)濟(jì)損失，帶來了嚴(yán)峻的威脅。以往常用的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)方法，具有敏感性低、檢測(cè)速度慢、特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)ο為此，需要建立一種敏感、快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法來檢測(cè)山羊痘病毒抗原，以用于山羊痘快速檢測(cè)、診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，提供一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法及檢測(cè)方法，該山羊痘反向間接血凝診斷試劑能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)山羊痘抗原，反向間接血凝試驗(yàn)敏感性更高、檢測(cè)速度更快，用于獸醫(yī)臨床上山羊痘病毒抗原快速檢測(cè)，為山羊痘的臨床診斷與預(yù)防控制提供參考依據(jù)，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的敏感性低、檢測(cè)速度慢、特異性不強(qiáng)等不足。本發(fā)明的山羊痘反向間接血凝診斷試劑，其制備方法包括以下步驟
第一，無菌采集健康綿羊靜脈血，加10倍量PBS，2 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，洗5遍， 以0. IM pH 7. 4 7. 8的磷酸緩沖液配成2. 5%的紅細(xì)胞懸液；
第二，將步驟一制得的紅細(xì)胞懸液與1%戊二醛以9:1體積比混合，于室溫下緩慢攪拌 Ih, 2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，重新制成2. 5%的醛化紅細(xì)胞懸浮液； 第三，將步驟二制得的醛化紅細(xì)胞懸浮液與等量1/200 000新鮮鞣酸溶液混合，置于 37°C的水浴鍋中1小時(shí)后取出，用磷酸緩沖液洗滌3次，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，制成醛化、鞣化的沉淀紅細(xì)胞；
第四，將步驟三制得的沉淀紅細(xì)胞加入10倍量0. IM pH 3 4的醋酸鹽緩沖液中，再與等量純化山羊痘IgG稀釋液混合，置于37°C 2h，其間每隔15min吹吸混勻1次，制得0. 8% 致敏紅細(xì)胞懸液；所使用的純化山羊痘IgG含量控制在1. 5 1. 55mg/mL ； 第五，將步驟四制得的致敏紅細(xì)胞2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取沉淀紅細(xì)胞用含0. 1% NaN3、l%新生小牛血清的磷酸緩沖液洗滌5次，最后配成濃度0. 8% 致敏紅細(xì)胞懸液診斷試劑；
第六，分析檢測(cè)合格即得反向間接血凝診斷試劑。山羊痘反向間接血凝診斷試劑檢測(cè)山羊痘病毒抗原的方法，如上述所述的山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法制備的山羊痘反向間接血凝診斷試劑，檢測(cè)步驟按常規(guī)反向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行，其步驟為在96孔V形板中進(jìn)行，每個(gè)樣品為一組，每組1 12孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待檢樣品50 μ L，用移液槍逐孔稀釋至第11孔，棄 50μ L，第12孔為PBS空白對(duì)照。最后每孔加入山羊痘反向間接血凝診斷試劑50μ L，振蕩混合后，置室溫作用50min，判定結(jié)果。凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈1個(gè)圓點(diǎn)的為不凝集； 如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以出現(xiàn) 50%以上凝集現(xiàn)象(++)的血清最高稀釋度為檢測(cè)抗體的效價(jià)。所述試劑的檢測(cè)反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。本發(fā)明有益效果本發(fā)明的診斷試劑及制備方法可用于獸醫(yī)臨床上山羊痘抗原的快速、大量檢測(cè)，為山羊痘的臨床診斷提供依據(jù)。與常用的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相比，反向間接血凝試驗(yàn)具有敏感性更高、檢測(cè)速度更快、特異性更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明的山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備流程圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的山羊痘反向間接血凝診斷試劑的各組分為磷酸緩沖液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 4)、醋酸鹽緩沖液(0. ΙΜ,ρΗ 3 4)、戊二醛、鞣酸、綿羊紅細(xì)胞、純化山羊痘IgG、新生犢牛血清、NaN3。如圖1所示意，本發(fā)明的山羊痘反向間接血凝診斷試劑的的制備方法，包括以下步驟
第一，無菌采集健康綿羊靜脈血，加10倍量PBS，2 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，洗5遍， 以磷酸緩沖液(0. 1M，pH 7.4)配成2. 5%的紅細(xì)胞懸液；
第二，將步驟一制得的紅細(xì)胞懸液與1%戊二醛以9:1體積比混合，于室溫下緩慢攪拌 Ih, 2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，重新制成2. 5%的懸浮液；
第三，將步驟二制得紅細(xì)胞懸浮液與等量1 / 200 000新鮮鞣酸溶液混合，置于37°C 的水浴鍋中1小時(shí)后取出，用磷酸緩沖液洗滌3次，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘；
第四，將步驟三制得的沉淀紅細(xì)胞加入10倍量醋酸鹽緩沖液(0. 1M, pH 3 4)中，再與等量純化IgG稀釋液混合，置于37°C池，其間每隔15min吹吸混勻1次；所使用的純化山羊痘IgG含量為1. 549mg/mL ；
第五，將步驟四制得的致敏紅細(xì)胞2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取沉淀紅細(xì)胞用含0. 1% NaN3、1 %新生小牛血清的磷酸緩沖液洗滌5次，最后配成0. 8% 1. 0%致敏紅細(xì)胞懸液診斷試劑；
第六，分析檢測(cè)合格即制得反向間接血凝診斷試劑；
山羊痘反向間接血凝診斷試劑檢測(cè)山羊痘病毒抗原的方法，檢測(cè)步驟按常規(guī)反向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行，其步驟為在96孔V形板中進(jìn)行，每個(gè)樣品為一組，每組1 12孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待檢樣品50 μ L，用移液槍逐孔稀釋至第11孔，棄50 μ L， 第12孔為PBS空白對(duì)照。最后每孔加入山羊痘反向間接血凝診斷試劑50 μ L，振蕩混合后， 置室溫作用50min，判定結(jié)果。凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈1個(gè)圓點(diǎn)的為不凝集；如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以出現(xiàn)50%以上
凝集現(xiàn)象(++)的血清最高稀釋度為檢測(cè)抗體的效價(jià)。 所述試劑的檢測(cè)反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。
權(quán)利要求
1.一種山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟第一，無菌采集健康綿羊靜脈血，加10倍量PBS，2 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，洗5遍， 以0. ΙΜ—ρΗ 7. 4 7. 8的磷酸緩沖液配成2. 5%的紅細(xì)胞懸液；第二，將步驟一制得的紅細(xì)胞懸液與1%戊二醛以9:1體積比混合，于室溫下緩慢攪拌 Ih, 2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，重新制成2. 5%的醛化紅細(xì)胞懸浮液； 第三，將步驟二制得的醛化紅細(xì)胞懸浮液與等量1 / 200 000新鮮鞣酸溶液混合，置于37°C的水浴鍋中1小時(shí)后取出，用磷酸緩沖液洗滌3次，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，制成醛化、鞣化的沉淀紅細(xì)胞；第四，將步驟三制得的沉淀紅細(xì)胞加入10倍量0. IM- pH 3 4的醋酸鹽緩沖液中， 再與等量純化山羊痘IgG稀釋液混合，置于37°C 2h，其間每隔15min吹吸混勻1次，制得 0. 8% 致敏紅細(xì)胞懸液；所使用的純化山羊痘IgG含量控制在1. 5 1. 55mg/mL ；第五，將步驟四制得的致敏紅細(xì)胞2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取沉淀紅細(xì)胞用含0. 1% NaN3、l%新生小牛血清的磷酸緩沖液洗滌5次，最后配成濃度0. 8% 致敏紅細(xì)胞懸液診斷試劑；第六，分析檢測(cè)合格即得反向間接血凝診斷試劑。
2.—種山羊痘反向間接血凝診斷試劑檢測(cè)山羊痘病毒抗原的方法，其特征在于如權(quán)利要求1所述的山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法制備的山羊痘反向間接血凝診斷試劑，檢測(cè)步驟按常規(guī)反向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行，其步驟為在96孔V形板中進(jìn)行，每個(gè)樣品為一組，每組1 12孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待檢樣品50 μ L，用移液槍逐孔稀釋至第11孔，棄50yL，第12孔為PBS空白對(duì)照；最后每孔加入山羊痘反向間接血凝診斷試劑50 μ L，振蕩混合后，置室溫作用50min，判定結(jié)果；凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈1個(gè)圓點(diǎn)的為不凝集；如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周圍；根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以出現(xiàn)50%以上凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為檢測(cè)抗體的效價(jià)；所述試劑的檢測(cè)反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠檢測(cè)山羊痘抗原的山羊痘反向間接血凝診斷試劑的制備方法及檢測(cè)方法。制備方法為以戊二醛和綿羊紅細(xì)胞混合制備紅細(xì)胞懸液，與等量的純化山羊痘IgG混合，經(jīng)攪拌、離心、洗滌，用含1%新生犢牛血清的PBS配成1%致敏紅細(xì)胞，此即為山羊痘反向間接血凝診斷試劑。經(jīng)優(yōu)化的制備條件是采用戊二醛單醛化法固定紅細(xì)胞，致敏紅細(xì)胞濃度0.8%～1.0%，IgG含量控制在1.5～1.55mg.ml-1，可以達(dá)到較好的標(biāo)記效果；該試劑用于檢測(cè)山羊痘病毒抗原按常規(guī)反向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行，反應(yīng)溫度20～25℃，反應(yīng)時(shí)間50min。該方法具有較好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，可用于獸醫(yī)臨床上山羊痘抗原快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102288756SQ20111018892
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者劉忠偉, 周碧君, 岳筠, 嵇辛勤, 文明, 汪德生, 王開功, 程振濤 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)