檢測羊痘病毒膠體金試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測羊痘病毒膠體金試紙條及其制備方法，包括：樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和被襯；其中，樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘附于不吸水的支撐薄片上；所述金標結(jié)合墊是結(jié)合有金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜；在所述硝酸纖維素膜上各有一條由兔抗P32蛋白IgG以及由羊抗鼠多克隆抗體噴制成的檢測線和質(zhì)控線。本發(fā)明進一步對制備金標結(jié)合墊所用到的封閉液以及制備檢測檢測線和質(zhì)控線時所用到的包被緩沖液的組成進行了優(yōu)化。特異性和靈敏度試驗結(jié)果表明，本發(fā)明檢測羊痘病毒膠體試紙條特異性強、靈敏度高。
【專利說明】檢測羊痘病毒膠體金試紙條及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種膠體金試紙條，尤其涉及一種檢測羊痘病毒膠體金試紙條及其制 備方法，屬于羊痘病毒的檢測領域。

【背景技術】
[0002] 羊痘是由羊痘病毒屬的綿羊痘病毒或山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV)引起的 綿羊或山羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。主要表現(xiàn)為發(fā)熱，無毛或少毛部位的皮膚或 黏膜發(fā)生丘疹和皰疹。羊痘是所有動物痘病中最為嚴重的一種，病死率高，造成的經(jīng)濟損失 大，嚴重影響國際貿(mào)易和養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。此外，本病在公共衛(wèi)生方面也有重要意義，中國、蒙 古、瑞典、印度都有人類感染羊痘病毒的報道，受到世界各國的高度重視，世界各國都嚴格 限制從有本病存在的國家和地區(qū)進出口易感動物及其有關的產(chǎn)品。
[0003] 目前，羊痘的診斷方法主要有血清學診斷方法、分子生物學診斷方法以及病毒培 養(yǎng)和電鏡觀察方法。雖然以上方法的建立在羊痘的預防、診斷和監(jiān)測中發(fā)揮了重要作用，但 由于其操作復雜、耗時并且需要特殊的儀器設備而使其在現(xiàn)場檢驗檢疫中受到限制，所以 建立快速、敏感、特異并能用于羊痘現(xiàn)場直接檢疫的方法迫在眉睫。
[0004] 免疫膠體金技術在人類醫(yī)學上是一種常用的免疫標記技術，有其獨特的優(yōu)點，在 生物醫(yī)學各領域中得到了日益廣泛的應用。目前該技術在醫(yī)學檢驗中的應用主要是膠體金 快速免疫層析法和快速斑點免疫金滲濾法，用于檢測人類乙肝表面抗原、人絨毛膜促性腺 激素、艾滋病病毒等。近幾年隨著該技術的不斷發(fā)展，已在獸醫(yī)臨床上得到了廣泛應用。免 疫膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標志物，應用于抗原抗體反應中的一種新型免疫標 記技術。膠體金顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，也稱金溶膠。膠體金標記 就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理是膠體金顆粒表面的 負電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制 備各種不同粒徑，也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附 功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白 多肽等非共價結(jié)合，因而在基礎研究和檢驗檢疫中成為非常有用的工具。免疫膠體金顆粒 具有高電子高密度的特性，在顯微鏡下金標蛋白結(jié)合處，可見黑褐色顆粒，當這些標記物在 相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而可用于定性或半定量的快速 免疫檢測。
[0005] 膠體金免疫層析技術具有簡單、快速、靈敏、可現(xiàn)場操作等優(yōu)點，本研究擬應用膠 體金免疫層析技術，建立羊痘病毒快速檢測試紙條，為羊痘病毒的檢測提供特異性強、靈敏 度高、方便快捷的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測羊痘病毒膠體金試紙條；
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供一種制備檢測羊痘病毒膠體金試紙條的方法。
[0008] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明首先提供了一種檢測羊痘病毒膠體金試紙條，包括：樣品墊、金標結(jié)合墊、 硝酸纖維素膜、吸收墊和被襯；其中，樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘附 于不吸水的支撐薄片上；所述金標結(jié)合墊是結(jié)合有金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體 的玻璃纖維膜；在硝酸纖維素膜上各有一條由兔抗P32蛋白IgG噴制成的檢測線以及由羊 抗鼠多克隆抗體噴制成的質(zhì)控線，其中檢測線靠近金標結(jié)合墊，質(zhì)控線靠近吸收墊。
[0010] 硝酸纖維素膜的種類對于檢測結(jié)果的特異性、靈敏度、顯色帶寬度及背景顏色等 方面有顯著的影響，為了提升檢測的特異性、靈敏度并便于觀察，本發(fā)明分別考察了不同種 類的硝酸纖維素膜對于檢測結(jié)果的影響，最終發(fā)現(xiàn)，Millipore HF135膜在流速、特異性、 靈敏度、顯色帶寬度及背景顏色等方面都比較適合，尤為重要的是其在層析反應中性能良 好；因此，本發(fā)明優(yōu)選Mi 11 ipore的Mi I i ipore HFl35膜作為本發(fā)明檢測羊痘病毒膠體金試 紙條的硝酸纖維素膜。
[0011] 檢測線和質(zhì)控線的間隔優(yōu)選為3. 0-10. Omm,優(yōu)選為5. 0_。
[0012] 所述的背襯可以是PVC板、木板、金屬板等各種不吸水的具有支撐作用的薄片。
[0013] 本發(fā)明的另外一個目的是提供一種制備所述檢測羊痘病毒膠體金試紙條的方法， 該方法包括：
[0014] ( 1)制備金標結(jié)合墊：將玻璃纖維膜用封閉液封閉；將金標記抗羊痘病毒P32蛋白 單克隆抗體稀釋后涂覆于用封閉液封閉的玻璃纖維膜上，干燥后備用；
[0015] (2)制備含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素：將兔抗P32蛋白IgG以及羊抗鼠多 克隆抗體分別用包被緩沖液稀釋后噴印在硝酸纖維素膜上形成檢測線和質(zhì)控線，干燥后備 用；
[0016] (3)制備樣品墊：將玻璃纖維膜用封閉液封閉后，干燥即得；
[0017] (4)將樣品墊、金標結(jié)合墊、含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素和吸收墊依次粘帖 在被襯上。
[0018] 封閉液在膠體金快速檢測方法的建立過程中非常重要，封閉液中往往添加一些高 分子物質(zhì)或者表面活性劑。封閉液的組成及用量直接影響著檢測的特異性和靈敏度。本 發(fā)明考查了不同組成及用量的封閉液對試紙條反應速度、膜的背景顏色、金標水化均勻度、 特異性和靈敏度等方面的影響，以從中選擇出最佳的封閉液組成；本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，金 標水化均勻度主要和吐溫-20的添加量有關，吐溫-20的添加濃度大，則均勻度好，反之均 勻度變差；而隨著PEG20000的添加，反應的靈敏度也增加，但是同時也會對特異性產(chǎn)生負 面的影響；而PVP K30在封閉液中主要起到提高反應的特異性的作用，但是高濃度的PVP K30卻會引起反應速度減慢、膜的背景顏色加深和反應靈敏度降低等。通過綜合分析比 較，本發(fā)明最終發(fā)現(xiàn)，采用下述成分作為本發(fā)明的封閉液具有最佳的檢測效果：10mM pH7. 4 PBS+2%BSA+0. 5%PVP K30+1. 0%Tween-20+0. 02%NaN3。
[0019] 包被緩沖液的種類及用量對于檢測的特異性和靈敏度均有非常顯著的影響，為了 篩選獲得合適的包被液，本發(fā)明使用含有〇. 5%TWeen-20的兩種包被緩沖液（IOmM pH7. 2 PBS+0. 5%Tween-20, IOmM pH7. 2 PBS+3%Methanol+0. 5% Tween-20)包被兔抗羊痘病毒 IgG 時，檢測帶均不顯色；使用另外幾種包被液（IOmM PH7.2 PBS+3%Methanol+l% BSA、10mM pH7. 2 PBS+3%Methanol+l%SueroseU0mM pH7. 2 PBS+l%sucroseUOmM pH7. 2 PBS+1%BSA) 時，可以在一定程度上提高檢測的特異性，但是同時降低了靈敏度，使檢測帶顯色變淺，不 利于結(jié)果的判斷；使用IOmM PH7. 2 PBS作為包被液時，檢測帶顏色深，但是帶太寬且邊緣 粗糙，也不利于試紙條的制作；而使用IOmM pH7. 2 PBS+3%Methanol作為包被液時，檢測 帶顏色深、均勻清晰、靈敏度高且寬度適中，所以經(jīng)綜合比較，本發(fā)明優(yōu)選采用IOmM PH7. 2 PBS+3%Methanol作為最佳的包被緩沖液。
[0020] 本發(fā)明檢測羊痘病毒膠體金試紙條的判定標準：當試紙條的質(zhì)控線和檢測線同時 出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色條帶，結(jié)果判為陽性，記為若僅在質(zhì)控線出現(xiàn)而檢測線不出現(xiàn) 紫紅色條帶，結(jié)果判為陰性，記為兩條線均不出則判為檢測試紙條失效。
[0021] 本發(fā)明檢測羊痘病毒膠體金試紙條特異性和靈敏度試驗結(jié)果表明，本發(fā)明試紙條 特異性強、靈敏度高。

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1為本發(fā)明的檢測羊痘病毒膠體金試紙條的示意圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0023] 預備實施例1兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的制備
[0024] 1材料和方法
[0025] 1.1載體、菌株
[0026] 表達載體pET_21a質(zhì)粒以及表達菌株Rosetta(DE3)購自上?；羯镉邢薰?。
[0027] 1. 2主要試劑
[0028] 異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG)、Ex Taq酶、T4DNA連接酶及BamH I和XholI 限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒購自Takara公司。 His-tag Column親和純化柱購自Sigma公司。LB培養(yǎng)基購自北京陸橋公司。葡聚糖凝膠 (SePhadex G200)層析柱和PEG-20000購自上?；瘜W試劑廠。弗氏完全佐劑（CAF)和弗氏 不完全佐劑（IAF)購自GIBCO公司。硫酸銨購自中國金山化工廠。
[0029] 1. 3溶液的配制
[0030] 磷酸鹽緩沖液（PBS):取 0? 2mol/L 的 Na2HPO4 溶液 40. 5mL 與 9. 5mL0. 2mol/L 的 似&?04溶液混和，加入8. 2g NaCl，用雙蒸水定容至IOOOmL即為0? 01mol/L pH7. 4的PBS。
[0031] 飽和硫酸銨溶液：取雙蒸水500. OmL，加熱至80°C，稱取400. Og (NH4) 2S04緩慢加入 水中并不斷攪拌，直到（NH4)2SO4完全溶解且溶液變澄清透明后，置4°C過夜至結(jié)晶析出，用 前取上清，用氨水將pH調(diào)至7. 0。
[0032] 氯化鋇溶液（2%):取0. 2g BaCl2溶于10. OmL雙蒸水。
[0033] 磺基水楊酸（20%) :2. Og磺基水楊酸溶于10. OmL雙蒸水。
[0034] 1. 4開放閱讀框的選擇與引物設計合成
[0035] 根據(jù)GeneBank發(fā)布的山羊痘病毒P32基因序列（登陸號為AY881707. 1)，選取其 中67-543部分序列，上游加限制性內(nèi)切酶BamH I酶切位點，下游加 XholI限制性內(nèi)切酶 酶切位點，序列全長477bp (SEQ ID No. 1)，利用Oligo 6. O軟件設計了擴增此片段的一 對引物，上游引物為 5 ' - GGCGG/17'C'C TTAAAAAGTGGCAATGATAT-3 '，下游引物為5'_ TGTTTTGziG ATATCCCCCTGTGTACGAAT-3'，（斜體字為酶切位點和保護堿基)。
[0036] 1. 5表達載體的構(gòu)建及鑒定
[0037] 提取山羊痘病毒DNA，PCR擴增后經(jīng)BamH I/XholI雙酶切后回收純化，將其定向連 接到經(jīng)BamH I/Xholl雙酶切的pET-21a表達載體中并轉(zhuǎn)化到表達菌株Rosetta(DE3)細胞 中，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和序列測定后，將重組質(zhì)粒命名為pET-2la-P32。
[0038] PCR 反應體系為：Ex Taq (5U/ii L) 0? 5 ii LUOXEx Taq Buffer 5 ii L、dNTP (2. 5mmol/L) L、上下游引物（25nmol/ii L)各 liil、模板 L，加水至 50ii L ;PCR 反應 條件為：94°C Imin ;94°C 45s，54°C 30s，72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C 5min。酶切鑒定反應體 系為：10XBuffer for EcoR 12 ii L, EcoR I 和 XholI 酶各 0? 5 ii L，BSAO. 5 ii L，質(zhì)粒 7 ii L， 加水至20 u L。
[0039] I. 6pET-21a_P32重組蛋白的誘導表達和親和純化
[0040] 用陽性重組質(zhì)粒pET-21a_P32轉(zhuǎn)化表達菌株Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞，挑取單 菌落，加入到IOmL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜進行增菌。取3mL細 菌培養(yǎng)物接種到50mL含氨芐青霉素的LB中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)至0D600為0. 6?I. 0時加誘 導劑IPTG至終濃度為0. 5mmol/L。37°C繼續(xù)培養(yǎng)，于4h后取菌液離心收集細菌沉淀，按照 His-tag Column親和純化柱的操作說明書進行。
[0041] 1. 7兔抗羊痘病毒P32蛋白多克隆抗體的制備
[0042] 將表達P32蛋白用His-tag Column親和純化后，取500 iig純化蛋白溶于2mL弗 氏完全佐劑中，使之充分乳化，皮下多點注射新西蘭家兔。加強免疫時用弗氏不完全佐劑， 抗原劑量為首次的1/4。每2周?3周加強免疫1次。在第1次加強免疫之后2周，從耳 緣靜脈取血2mL?3mL，分離血清，間接ELISA法檢測抗體效價，至抗體效價達到1:10000 以上。2周后取血約50mL，室溫凝固后，4°C冷藏4h，離心分離血清，分裝小份后于-80°C冷 東保存。
[0043] 1. 8兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的提取及純化
[0044] I. 8. 1兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的提取
[0045] 20. OmL血清與等量生理鹽水混合后，持續(xù)攪拌下逐滴加入飽和（NH4)2SO4溶液 40. OmL，使成50%飽和度的（NH4)2S04溶液；4°C放置30min后取出，4°C下3000r/min離心 30min，棄上清；沉淀用40. OmL生理鹽水溶解后，緩慢加入20. OmL飽和（NH4) 2S04溶液，使成 33%飽和度的（NH4)2SO4溶液；4°C放置30min后取出，4°C下3000r/min離心30min，棄上清； 沉淀重復進行上述操作后，將沉淀溶于2. OmL生理鹽水（原血清量的1/10)，裝入透析袋內(nèi) 對生理鹽水透析除鹽，用29^&(：12溶液檢測（NH4) 2SO4是否已被透析完全；透析完全后，蛋白 溶液用PEG-20000濃縮至適當體積，4°C下12000r/min離心IOmin,收集上清，核酸蛋白測定 儀測定其蛋白含量，即得到粗提的IgG。
[0046] 1. 8. 2兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的純化
[0047] 對粗提后的兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG分別用葡聚糖凝膠（SePhadex G200)層析 柱過濾純化。根據(jù)樣品容積及柱管的比差,按如下公式計算確定柱床的體積。
[0048] Vt= TI r2h
[0049] (Vt-柱床的體積；TI _圓周率；r-半徑；h-柱床高）
[0050] 純化的具體過程如下：
[0051] 稱取2. 5g S印hadex G200倒入數(shù)倍體積的蒸餾水混合均勻，置室溫浸泡3天，其 間每天換水2次，每次換水時慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾 水，浸泡好后置4°C冰箱保存。
[0052] 將清潔層析柱垂直固定于實驗架上，在橡膠塞上加與之大小相當?shù)亩繛V紙片， 加少量洗脫液（0.01 mol/L，pH7.4 PBS)，檢查出液管暢通后，關閉下口。從4°C冰箱取出溶 脹好的S印hadex G200,平衡到室溫后灌裝層析柱，在凝膠的上方留出lcm-2cm高的液層， 以備加樣。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與管內(nèi)徑相等的圓形定量濾紙片并用0. Olmol/ L pH7. 4的PBS洗脫過夜。
[0053] 次日將柱中的蓄液放出，待液面與濾紙片持平時，立即關閉下口，用吸管吸取樣 品，在接近濾紙?zhí)幯毓鼙诹飨?，取少許生理鹽水沖洗樣品瓶，將洗瓶液加入，最后用洗脫液 沖洗管壁上樣品流經(jīng)的路線。隨即打開下口，當樣品全部進入柱床剛露出濾紙時，立即加入 洗脫液，使柱床上部形成5cm?IOcm厚的液層。樣品上柱后，不時以20%磺基水楊酸液測 試，發(fā)現(xiàn)有輕微乳濁狀反應時，用事先編號的I. 5mL EP管收集流液，每管10滴，直到用20% 磺基水楊酸檢測不出現(xiàn)渾濁為止。用核酸蛋白測定儀測定每管蛋白質(zhì)含量，以管編號為橫 坐標，蛋白質(zhì)含量為縱坐標繪制曲線圖，將蛋白質(zhì)含量在曲線峰值的瓶內(nèi)溶液合并在一起， 裝入透析袋，用PEG-20000濃縮至適當體積。4°C下12000r/min離心IOmin,收集上清，用核 酸蛋白測定儀測定含量，作好標記，置-20°C凍存。
[0054] 預備實施例2抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體的制備
[0055] 1材料和方法
[0056] I. 1 材料
[0057] I. I. 1 抗原
[0058] 山羊痘病毒P32表達蛋白制備及純化方法見預備實施例1。
[0059] I. 1. 2細胞、實驗動物
[0060] BALB/c小鼠、鼠源單抗亞類鑒定試劑盒和SP2/0骨髓瘤細胞購自上海吉爾生化有 限公司。
[0061] 1.1. 3試劑和培養(yǎng)基
[0062] RPMI-1640、新生小牛血清（超級）、HAT鹽（100X)、HT鹽（100X)、羊抗鼠 IgG-HRP、青、鏈霉素購自GIBCOL公司；融合劑50%PEG、淋巴細胞分離液、秋水仙素、弗氏完 全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。
[0063] I. 1. 4主要溶液的配制
[0064] 1640基礎培養(yǎng)基：RPMI-1640粉劑一袋，補加2. Og碳酸氫鈉（NaHCO3)，于IOOOmL 容量瓶內(nèi)用三蒸水溶解，在即將定容前搖勻并用l.Omol/L HCL調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2后定容 至IOOOmL,過濾除菌。
[0065] 完全培養(yǎng)基：1640基礎培養(yǎng)基補加20%新生牛血清和1. 0%雙抗。
[0066] 雙抗貯存液（100X):將青、鏈霉素分別用無菌水溶解配制成含10000U/mL青霉素 和lOOOOU/mL鏈霉素的貯存液，于-20°C保存。
[0067] HAT選擇培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基補加1. 0%商品化HAT。
[0068] HT選擇培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)液補加 I. 0%商品化HT。
[0069] 50倍8-雜氮鳥嘌呤溶液：8-雜氮鳥嘌呤10mg，I. Omo 1/L NaOH 2mL，用無菌三蒸 水定容至10mL。
[0070] 8-雜氮鳥嘌呤篩選培養(yǎng)液：50倍8-雜氮鳥嘌呤溶液2mL，用完全培養(yǎng)液加至 10OmT, 〇
[0071] 細胞凍存液：新生牛血清和二甲亞礬（DMSO)按9:1混合。
[0072] 1. 2 方法
[0073] I. 2. 1動物免疫
[0074] 分別取適量經(jīng)His-tag Column親和純化的P32表達蛋白與等體積的弗氏完全佐 劑乳化，小鼠背部皮下多點注射，以后每間隔14d加強1次，換用弗氏不完全佐劑乳化。最 后于融合前3d(72h)腹腔強化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。
[0075] I. 2. 2SP2/0骨髓瘤細胞的活化
[0076] 將細胞瓶中培養(yǎng)的SP2/0細胞，離心后用0. 5mL 1640基礎液懸?。?. 5X106? IXlO6個細胞）注射BALB/c小鼠背部皮下。待腫瘤生長后，根據(jù)腫瘤大小選擇制備瘤細 胞的時間。
[0077] 1. 2. 3單克隆抗體的制備
[0078] I. 2. 3. 1飼養(yǎng)細胞的制備
[0079] 取1只未免疫的BALB/c小鼠，眼眶放血處死，收集陰性血清，在75%酒精中浸 泡5min消毒。將消毒好的老鼠固定于解剖板上，用鑷子夾住下腹部皮膚，剪一小口，撕開 皮膚露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹膜上剪一小口（在腹部中央），然后用吸管吸取 3. 0mL1640液注入小鼠腹腔，輕輕吹吸幾次，再將液體轉(zhuǎn)入一無菌50. OmL離心管中，重復一 次，此為腹腔巨噬細胞。將小鼠后肢交叉（左后肢在上固定，換1套鑷子和剪刀，剪開腹膜， 暴露出脾臟，再換一套器械，用鑷子夾住脾臟，用剪刀去掉粘連在脾臟上的脂肪組織，剪破 脾臟外膜，放入滅菌的勻漿器中。加適量1640基礎液于勻漿器中研磨，擠壓出脾細胞，取出 勻漿棒，補加適量1640基礎液，靜置2min，吸取上層細胞懸液放入腹腔巨噬細胞離心管中， 重復2次。1200r/min離心IOmin去上清，細胞重懸備用。
[0080] 1. 2. 3. 2骨髓瘤細胞制備
[0081] 將背部生長骨髓瘤細胞的小鼠頸椎脫臼法處死。浸泡在75%乙醇內(nèi)2min?5min 消毒皮毛。小鼠背向固定，無菌條件下取出瘤組織，勻漿，用基礎培養(yǎng)液20mL懸起。將懸液 緩慢加入己有20mL淋巴細胞分離液的離心管內(nèi)。1，800r/min離心lOmin，吸取培養(yǎng)液和分 離液中間致密的白色細胞層。用基礎培養(yǎng)液洗滌細胞兩次，用IOmL基礎培養(yǎng)液重懸細胞， 計數(shù)備用。
[0082] 1. 2. 3. 3免疫脾細胞的制備
[0083] 取1只免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集陽性血清后。按1. 2. 3. 1中脾細胞的制 備方法，摘取脾臟，研磨，制備免疫脾細胞懸液。將制備好的脾細胞懸液放入另一支無菌離 心管中備用。
[0084] L 2. 3. 4免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合
[0085] 先將飼養(yǎng)細胞lOOOr/min離心5min，去掉上清，用適量HAT培養(yǎng)基懸浮，于37°C 放置備用。將I X IO7?2 X IO7個SP2/0骨髓瘤細胞與IO8個免疫脾細胞（1:10?1:5)于 50. OmL離心管中混勻，1500r/min離心lOmin。棄上清，倒扣在滅菌的濾紙上使管中液體盡 量吸干。輕輕敲擊管底，使細胞沉淀略加松動，將離心管放于37°C水浴中。然后在Imin內(nèi) 慢慢滴入預溫至37°C的50%PEG0. 8mL，邊加邊輕輕用吸尖攪拌。繼續(xù)攪拌lmin，然后慢慢 加入37°C預溫的1640基礎液10. OmL。具體方法為：第Imin逐滴滴入I. OmL,第2min加 I. OmL,第3min?4min加3. OmL,第5min加其余的5. OmL,每次加時需緩慢加入，并不斷輕 輕地攪拌，最后慢慢加入30. OmL 1640液。1000r/min離心5min，去上清。同上用1640基 礎液清洗一次后，用HAT培養(yǎng)基懸浮混合的細胞，加入HAT培養(yǎng)基懸浮的飼養(yǎng)脾細胞，根據(jù) 需要補加適量的HAT培養(yǎng)基，混合均勻，分種于96孔培養(yǎng)板中，約250 ii L/孔。將細胞融合 后培養(yǎng)板置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5d后用HAT選擇培養(yǎng)液置孔內(nèi)1/2培養(yǎng) 液。此后用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)，并逐漸減少HT含量。7?IOd后細胞集落在2mm大小時計算融 合率（雜交細胞生長孔數(shù)/培養(yǎng)孔總數(shù)X 100%)，準備檢測。
[0086] I. 2. 3. 5 P32雜交瘤細胞上清的檢測
[0087] 采用間接ELISA方法進行檢測：用His_P32和His間隔包被酶聯(lián)板，用洗滌液洗 3次，37°C封閉液封閉lh，洗滌三次，然后加入雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，于37°C溫育45min， 洗滌液洗3次后，加入1:20倍稀釋的羊抗鼠 IgG-HRP，37°C反應30min。洗滌3次，加入底 物TMB顯色，用硫酸終止反應之后，在450nm的波長下測OD值，同時設小鼠陰性和陽性血清 對照。OD45tl大于陰性對照2倍為陽性判定標準，HiS-P32反應陽性而His反應為陰性的孔 判為陽性孔，計算陽性率（檢到陽性孔數(shù)/雜交細胞生長孔數(shù)X 100%)。
[0088] 1. 2. 3. 6雜交瘤細胞的克隆化
[0089] 對細胞上清檢測為陽性的雜交瘤細胞采用有限稀釋法進行克隆，具體如下：克隆 前參照1.2.3. 1方法制備小鼠飼養(yǎng)細胞，平鋪于細胞培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中備用。用剪斷 尖端的200 ii L槍頭在待克隆孔內(nèi)吹打數(shù)次使細胞重懸，用血球計數(shù)板對細胞計數(shù)，將細 胞用完全培養(yǎng)基稀釋到5、50個/mL。將濃度約為5個/mL的細胞加到鋪好飼養(yǎng)細胞96孔 培養(yǎng)板的前8列，并將濃度約為50個/mL的細胞加到同一塊96孔培養(yǎng)板的后4列，每孔 100 U L，加完置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)第4d換液一次，第5d?6d仔細觀察各孔內(nèi)細胞的 生長情況，作好標記。待克隆后第7d?9d細胞克隆長滿1/4?1/3個視野時，即可檢測， 計算雜交瘤細胞陽性孔比率（陽性孔數(shù)/雜交細胞生長孔數(shù)X 100%)。如檢出細胞生長孔 有特異性抗體，可選擇抗體效價高，呈單個克隆生長，形態(tài)良好的細胞孔，繼續(xù)用同樣方法 再克隆或擴大培養(yǎng)。陽性孔細胞可移至24孔培養(yǎng)板，并在原孔中補加另一批培養(yǎng)基，以防 二者同時污染或細胞死亡。待24孔板中的細胞生長良好時，可轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)， 并凍存2支以上的細胞。
[0090] 克隆一般需進行2次以上，直到細胞集落生長孔的陽性率達到100%，則可以認為 己得到能分泌單一抗體的單克隆雜交瘤細胞系。
[0091] L 2. 3. 7雜交瘤細胞染色體計數(shù)
[0092] 細胞傳代培養(yǎng)48h加入秋水仙素，使其終濃度達0. 04 ii g/mL。繼續(xù)培養(yǎng)4h，貼壁 細胞吹下移入離心管，1200r/min離心IOmin,棄上清。沉淀細胞用37°C預溫的0. 075mol/ L的KCl低滲溶液5mL重懸，置37°C水浴20min。加入新鮮配制的固定液（甲醇：冰醋酸 =3:1) ImL混勻，1200r/min離心IOmin,棄上清。加入固定液5mL輕輕混勻，靜置30min， 1200r/min離心IOmin,棄上清。再次加入固定液5mL，輕輕混勻，靜置30min，1200r/min離心 lOmin，棄上清。再加入固定液5mL，輕輕混勻，封閉管口，4°C靜置過夜。上清液約留0.5mL， 其余吸去棄掉，混勻細胞懸浮。滴管吸取細胞懸液，滴在己用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立 即吹散，火焰固定，自然干燥。10%Giemsa染色液染色lOmin，洗去染液，自然干燥。于顯微 鏡下觀察計數(shù)。每株細胞計數(shù)IO個細胞染色體數(shù)，算出平均值。
[0093] 1. 2. 3. 8雜交瘤細胞的凍存與復蘇
[0094] 將待凍存細胞液計數(shù)，1200r/min離心lOmin。沉淀細胞按IX IO6個/mL用細胞凍 存液懸浮，移入細胞凍存管（I. 6mL/管）。凍存管放入小布袋置液氮罐上層氣相30min，移入 下層氣相過夜，再移入液氮。一周及六個月后，凍存管從液氮中取出。立即放入37°C?40°C 水浴，迅速融化。凍存管內(nèi)細胞液移入離心管，加入基礎培養(yǎng)液，1200r/min離心lOmin，棄 上清，再加入基礎培養(yǎng)液，1200r/min離心lOmin，棄上清。用完全培養(yǎng)液懸浮，移入細胞培 養(yǎng)瓶，置37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0095] 1. 2. 3. 9單克隆抗體的生產(chǎn)與效價測定
[0096] 取8?10周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌的液體石蠟0. 5mL/只，7d?IOd后 將對數(shù)生長期雜交瘤細胞用基礎培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度約IO7個/mL。腹腔注射雜交瘤細胞 0. 5mL/只，7d?IOd后小鼠腹腔膨大，抽取小鼠腹水，離心取上清，按照1. 2. 3. 5的方法進 行效價測定并凍存。
[0097] L 2. 4單克隆抗體的純化
[0098] 采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化：取小鼠腹水10. OmL，加入等體積的巴 比妥緩沖液，適量的二氧化硅混合，室溫振蕩30min。室溫靜置15min后，取上清于潔凈離 心管中，4°C，1800r/min離心20min ;取上清液18. OmL,加入36. OmLO. 06mol/L醋酸鈉緩沖 液，用HCL調(diào)pH值至4. 5,充分攪拌下在30min內(nèi)緩慢加入辛酸297 ii L ;繼續(xù)攪拌lOmin， 然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱靜置2h，4°C，1500r/min離心30min，上清液經(jīng)0. 45 ii m濾膜過濾后體積 為50mL ;加入5. OmLO. lmol/L的磷酸緩沖液，用NaOH調(diào)pH值至7. 6,攪拌下緩緩加入硫酸 銨至終濃度為0. 277g/mL ;4°C冰箱靜置2h后，4°C，1500r/min離心30min，棄上清；沉淀用 5. OmLO. lmol/L的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，對5000mL0. Olmol/L pH7. 2 PBS緩沖液充 分透析后，再對2000mL蒸饋水透析，最后對3000mL三蒸去離子水透析；然后4°C，1200r/ min離心30min，棄沉淀，收集上清液，測蛋白濃度。作SDS - PAGE電泳，鑒定單克隆抗體的 純度。
[0099] 預備實施例3金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體的制備
[0100] 1膠體金的制備
[0101] 采用檸檬酸三鈉還原法來制備膠體金，具體操作為：用容量瓶量取IOOmL的三蒸 去離子水，倒入規(guī)格為500. OmL的平底燒瓶中，將燒瓶放在磁力加熱攪拌器的加熱套內(nèi)，放 入磁力攪拌子，打開攪拌旋鈕至適當速度，打開加熱旋鈕，加熱至沸騰。加入I. 0mLl%HAuCL4溶液，繼續(xù)加熱2min，然后按表1所示體積一次性迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱。 淺黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸三鈉加入后2min內(nèi)逐漸由黃變灰再變黑最后變紅或橙紅 色。待溶液變?yōu)榱良t色或橙紅色后，再繼續(xù)加熱攪拌15min。關掉加熱旋扭，自然冷確至室 溫。
[0102] 2金標單抗復合物的制備與純化
[0103] 于50. OmL的小燒杯中加入20. OmL的膠體金，調(diào)pH至8. 0,在攪拌的狀態(tài)下緩慢 加入稀釋好的lmg/mL的抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體(預備實施例2制備)，攪拌30min ; 加入10%BSA至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30min ;4°C放置2h后，將上述膠體金標記物分裝于 7. OmL的離心管中，以2000r/min離心15min，吸出上清，棄沉淀；以8700r/min離心45min， 棄去上清液，加入標記洗漆液至原體積；再次以l〇〇〇〇r/min離心30min,棄去上清液,加入 標記洗漆液至原體積；以l〇〇〇〇r/min離心30min,棄去上清液，沉淀用LOmL標記洗漆液重 懸，置4°C冰箱備用。
[0104] 實施例1檢測羊痘病毒膠體金試紙條的制備及組裝
[0105] 首先將樣品墊（玻璃纖維）和金標結(jié)合墊（玻璃纖維）用封閉液（IOmM pH7. 4 PBS+2%BSA+0. 5%PVP K30+1. 0%Tween-20+0. 02%NaN3)封閉，于 37°C溫箱中干燥。用點膜儀 將制備好的金標抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體噴于玻璃纖維上，立即放入冷凍真空干燥 機中抽干，得到金標結(jié)合墊。兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗體(購自SIGM 公司）分別用包被緩沖液（IOmM PH7. 2 PBS+3%Methanol)稀釋后用點膜儀噴涂于NC膜上， 間隔5. 0_，作為檢測線和質(zhì)控線，37°C溫箱中干燥30min后取出得到含有檢測線和質(zhì)控線 的NC膜。
[0106] 最后將樣品塾、金標結(jié)合塾、NC月吳和吸水紙依次粘帖在塑料底板上。
[0107] 實驗例1檢測羊痘病毒膠體金試紙條制備中有關參數(shù)的優(yōu)化實驗 [0108] 1、試劑和材料
[0109] 氯金酸和羊抗鼠多克隆抗體購自SIGM公司；兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG(預備實 施例1制備)、抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體(預備實施例2制備)、金標記抗羊痘病毒P32 蛋白單克隆抗體(預備實施例3制備);硝酸纖維素膜、樣品墊、金標墊、吸收墊及背襯等層析 材料購自Millipore和S&S公司；
[0110] 2溶液的配制
[0111] 1%HAuCL4水溶液的配制：將LOg氯金酸溶解于三蒸去離子水中，待完全溶解后， 用100. OmL容量瓶定容，配成1%的水溶液。將配好的溶液倒在棕色試劑瓶中，于4°C冰箱內(nèi) 保存?zhèn)溆谩?br> [0112] 檸檬酸三鈉水溶液配制：準確稱取I. Og二水合檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7 *2H20)溶解 于三蒸去離子水中，待完全溶解后，用100. OmL容量瓶定容，配成1%的水溶液，再用0. 22_ 濾膜濾器過濾。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0113] 0? I mol/L K2CO3的配制：用三蒸去離子水配制，0? 22mm膜濾過，置4°C備用，有 效期三個月。100. OmLO. I mol/L K2CO3溶液配方：1. 38g碳酸鉀，三蒸去離子水定容至 IOO-OmL0
[0114] 10%BSA的配制：用三蒸去離子水配制，0.22mm膜濾過，置-20°C備用，有效期三 個月。100. 0mL10%BSA溶液配方：10. Og BSA，0.05g疊氮鈉（NaN3)，三蒸去離子水定容至 100. OmT,〇
[0115] 標記洗滌液的配制：含0? 1%聚乙二醇20000 (PEG-20000)及0? 02%疊氮鈉（NaN3) 的0.002mol/L pH9.0硼酸緩沖液，0.22mm膜濾過，置4°C備用，有效期三個月。lOOO.OmL 標記洗滌液配方：I. 〇g PEG-20000,0. 2gNaN3的0. 002mol/L pH9. 0硼酸緩沖液定容至 1000. OmT,〇
[0116] 包被緩沖液的配制：含6%甲醇的0. Olmol/L pH7. 2 PBS緩沖液為包被緩沖液， 0.22_膜濾過，置41：備用，有效期一周。100.01^含6%甲醇的0.01111〇1/1?117.2?85緩沖 液配方：NaCl 0? 8g，KCl 0? 02g，Na2HPO4. 12H20 0? 29g，KH2PO4 0? 02g，甲醇 6. OmL，雙蒸去離 子水定容至100. OmL。
[0117] 封閉液的配制：2%BSA，1%吐溫-20,0. 5%聚乙烯吡咯烷酮K30 (PVP K30)、2. 5%蔗 糖，0? 02%NaN3,0. Olmol/L pH7. 4 PBS溶液，0? 22mm微孔濾膜濾過，置4°C備用，有效期四個 月。10001^封閉液配方：20.(^85六，0.28似隊，5.(^?￥? 1(30,25.(^蔗糖，10.01111吐溫-20， 0? 01mol/L pH7. 4 PBS 溶液定容至 1000mL。
[0118] 2、實驗方法
[0119] 2. 1、硝酸纖維素（NC)膜的選擇實驗
[0120] 以金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體和兔抗P32蛋白IgG作為檢測試劑。先 將兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗體分別用包被緩沖液稀釋后，分別包被于不同的 硝酸纖維素膜上，即：MilliPore HF075、Millipore HF090、MilliPore HF120、Millipore HF135、Millipore HF180、MilliPore HF240、S&S FF60、S&S FF85、S&S FF120、S&S AE100,于 37°C溫箱烘干備用；同時將金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體用包被緩沖液稀釋后， 涂覆于金標墊，37°C烘干備用；將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附于背襯上 組裝成試紙條，將其插入PH7. 4的PBS及稀釋后的羊痘病毒液中，觀察結(jié)果，選取最佳的硝 酸纖維素膜。
[0121] 2. 2、包被緩沖液的優(yōu)化實驗
[0122] 以金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體和兔抗P32蛋白IgG作為檢測 試劑。將兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗體分別用不同的包被緩沖液（IOmM pH7. 2 PBSUOmM PH7. 2 PBS+3%MethanolUOmM PH7. 2 PBS+1% SucroseUOmM PH7. 2 PBS+0. 5%Tween-20U0mM PH7. 2 PBS+l%BSAUOmM PH7. 2 PBS+3%Methanol+l%BSAU0mM PH7.2 PBS+3%Methanol+l%Suerose、10mM PH7.2 PBS+3%Methanol+0.5%Tween-20)稀釋后， 包被于硝酸纖維素膜上，37°C烘干，得到含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；同時將金標 記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體也用上述不同的包被緩沖液稀釋后，涂覆于玻璃纖維膜 表面，37°C烘干，得到金標結(jié)合墊；
[0123] 將玻璃纖維膜用封閉液封閉后得到樣品墊；
[0124] 將樣品墊、金標結(jié)合墊、含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附于 背襯上組裝成試紙條，將其插入PH7. 4的PBS及稀釋后的羊痘病毒液中，觀察結(jié)果，篩選獲 得最適的包被緩沖液。
[0125] 2. 3、封閉液的優(yōu)化實驗
[0126] 封閉液在膠體金快速檢測方法的建立過程中非常重要，封閉液中往往添加一些高 分子物質(zhì)或者表面活性劑。本實驗以金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體和兔抗P32蛋 白IgG作為檢測試劑。
[0127] 先將兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗體分別用包被緩沖液稀釋后，包被于硝 酸纖維素膜上，37°C烘干，得到含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；；
[0128] 同時將金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體稀釋后，涂覆于按表1中所示不同 封閉液封閉后的玻璃纖維膜上，37°C烘干，得到金標結(jié)合墊；
[0129] 將玻璃纖維膜用表1的封閉液封閉后得到樣品墊；
[0130] 將樣品墊、金標結(jié)合墊、含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附于 背襯上組裝成試紙條，將其插入PH7. 4的PBS及稀釋后的羊痘病毒液中，觀察結(jié)果，篩選最 適的封閉液。
[0131] 表1不同封閉液的配制
[0132]

【權利要求】
1. 一種檢測羊痘病毒膠體金試紙條，包括：樣品墊（1)、金標結(jié)合墊（3)、硝酸纖維素膜 (6 )、吸收墊（7 )和被襯（2 );其中，樣品墊（1)、金標結(jié)合墊（3 )、硝酸纖維素膜（6 )和吸收墊 (7)依次粘附于不吸水的支撐薄片（2)上；其特征在于：所述金標結(jié)合墊是結(jié)合有金標記抗 羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜；在所述硝酸纖維素膜上各有一條由兔抗P32 蛋白IgG噴制成的檢測線（4)以及由羊抗鼠多克隆抗體噴制成的質(zhì)控線（5)，其中檢測線4 靠近金標結(jié)合墊3,質(zhì)控線5靠近吸收墊7。
2. 按照權利要求1所述的檢測羊痘病毒膠體金試紙條，其特征在于：所述的硝酸纖維 素膜為 Miliipore HF135 膜。
3. 按照權利要求1所述的檢測羊痘病毒膠體金試紙條，其特征在于：檢測線（4)和質(zhì)控 線（5)的間隔為3. 0-10. Omm，優(yōu)選為5. Omm。
4. 按照權利要求1所述的檢測羊痘病毒膠體金試紙條，其特征在于：所述的背襯是不 吸水的具有支撐作用的薄片。
5. 按照權利要求1或4所述的檢測羊痘病毒膠體金試紙條，其特征在于：所述的背襯 是PVC板、木板或金屬板。
6. -種制備權利要求1-5任何一項所述檢測羊痘病毒膠體金試紙條的方法，包括： (1) 制備金標結(jié)合墊：將玻璃纖維膜用封閉液封閉；將金標記抗羊痘病毒P32蛋白單克 隆抗體稀釋后涂覆于封閉后的玻璃纖維膜上，干燥后備用； (2) 制備含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素：將兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗 體分別用包被緩沖液稀釋后噴印在硝酸纖維素膜上印制成檢測線和質(zhì)控線，干燥后備用； (3) 制備樣品墊：將玻璃纖維膜用封閉液封閉后，干燥即得； (4) 將樣品墊、金標結(jié)合墊、含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素和吸收墊依次粘帖在被 襯上。
7. 按照權利要求6所述的方法，其特征在于，所述封閉液為：10mMpH7. 4 PBS+2%BSA+0. 5%PVP K30+1. 0%Tween-20+0. 02%NaN3。
8. 按照權利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被緩沖液為：10mM pH7. 2 PBS+3%Methanol。
【文檔編號】G01N33/569GK104407130SQ201310594930
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權日:2013年11月21日
【發(fā)明者】王海艷, 趙治國, 敖威華, 郭鐵箏, 潘國卿, 高利, 李剛, 趙林立, 吳紹強, 周艷君 申請人:王海艷