專利名稱：一種柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種柿葉的成分的分析技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用高效液相色譜法進(jìn)行的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法。
背景技術(shù)：
柿葉為柿科植物柿樹的干燥葉，柿葉主要含黃酮類、有機(jī)酸和三萜等成分。柿葉具有抗菌消炎、清熱解毒、抗氧化、軟化血管等作用，因而可以作為藥物來(lái)利用。由于柿葉具有上述的藥效，因而，在現(xiàn)有技術(shù)中，柿葉的提取得到多方研究，一般地，柿葉的提取過(guò)程為 將柿葉經(jīng)過(guò)水提醇沉后，得到水提液再由乙酸乙酯萃取，得到柿葉提取物，再由柿葉提取物加輔料制成中藥制劑。來(lái)自不同地區(qū)、不同品種的柿葉，其成分及質(zhì)量也不一樣，帶來(lái)的效能也會(huì)有所差異，因而，有必要對(duì)柿葉進(jìn)行篩選，篩選出符合制藥要求的柿葉，所以需要一種分析方法，對(duì)柿葉進(jìn)行分析，考察柿葉的成分及質(zhì)量的穩(wěn)定性，然而到目前為止，仍然沒(méi)有較好的方法來(lái)全面考察柿葉的成分及柿葉質(zhì)量的穩(wěn)定性。在現(xiàn)有技術(shù)中，采用如下技術(shù)方案進(jìn)行處理稱取柿葉粉末約5g，置于索氏提取器中，加入200mL石油醚，80°C回流證，用于脫脂及除葉綠素。精密稱取脫脂柿葉粉末1. Og于25mL具塞錐形瓶中，加入10. OOmL甲醇-水(75 25)的提取溶液，密塞后稱重。超聲提取40min，放冷，稱重，甲醇補(bǔ)足減失重量。搖勻，過(guò)0.45μπι濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)樣。精密吸取供試品溶液10 μ 1進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫P(yáng)henomenex Luna Cw色譜柱6mm X 250mm，5 μ m)和保護(hù)柱；檢測(cè)波長(zhǎng) 360nm ；柱溫為室溫；流速0. 8mL · min-1 ；進(jìn)樣量20 μ L。流動(dòng)相為乙腈-IOmmol · L^1KH2PO4 溶液，二元梯度洗脫，0 20min，13%乙腈，20 45min，20%乙腈，45 60min，60%乙腈， 60 70min，100% 乙腈。上述的現(xiàn)有技術(shù)存在如下缺點(diǎn)1、供試品溶液的制備過(guò)程比較繁雜，索氏提取的過(guò)程既費(fèi)時(shí)，還要用到石油醚有機(jī)溶劑，成本高，也不環(huán)保。2、供試品溶液的制備過(guò)程主要針對(duì)黃酮類化學(xué)成分的提取，用石油醚脫脂及除葉綠素，必然會(huì)造成部分脂溶性成分的流失。3、現(xiàn)有的方法技術(shù)所得的指紋圖譜中含有12個(gè)特征峰，只對(duì)其中的2個(gè)進(jìn)行了指認(rèn)，反映的信息量小，不能達(dá)到有效控制柿葉藥材質(zhì)量的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，能更好地達(dá)到控制柿葉藥材質(zhì)量的目的。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明是采用如下技術(shù)解決方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的一種柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，包括如下步驟1)稱取至少十個(gè)柿葉粉末樣品，將各柿葉粉末樣品分別與提取液混合，回流后放冷，然后過(guò)濾，得到供試品溶液；
2)而后利用高效液相色譜法進(jìn)行分析，得到柿葉的高效液相色譜指紋圖譜，根據(jù)各柿葉粉末樣品的高效液相色譜指紋圖譜建立柿葉的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜；其中， 高效液相色譜分析法的色譜條件中流動(dòng)相設(shè)定如下乙腈-磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為9 llmin，濃度從13% 15%變化至17% 19%的乙腈；洗脫時(shí)間為14 16min， 濃度為17% 19%的乙腈；洗脫時(shí)間為19min 21min，濃度從17% 19%變化至四％ 31 %的乙腈；洗脫時(shí)間為14 16min，濃度從四％ 31 %變化至49% 51 %的乙腈；3)將待測(cè)樣品與提取液混合，回流后放冷，然后過(guò)濾，得到供試品溶液，而后用高效液相色譜法按步驟2、中的色譜條件進(jìn)行分析，得到該待測(cè)樣品的高效液相色譜指紋圖譜，將該指紋圖譜與柿葉的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較。優(yōu)選地，過(guò)濾采用微孔濾膜進(jìn)行。優(yōu)選地，所述微孔濾膜的孔徑為0. 35 μ m 0. 45 μ m。優(yōu)選地，所述提取液為乙醇或甲醇。優(yōu)選地，所述提取液為濃度為65% 85%的乙醇或甲醇。優(yōu)選地，所述提取液為濃度為75%的乙醇或甲醇。優(yōu)選地，高效液相色譜分析法分析中，采用二極管陣列檢測(cè)器采集波長(zhǎng)，采集范圍為從(190nm 210nm)至(390nm 410nm)；檢測(cè)波長(zhǎng) 250nm 260nm。優(yōu)選地，所述磷酸溶液的濃度為0. 0. 3%。優(yōu)選地，步驟2)中，平衡時(shí)間為IOmin 30min。優(yōu)選地，步驟1)中，回流時(shí)間為0. 5小時(shí) 2小時(shí)。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明由于對(duì)色譜條件進(jìn)行合理設(shè)置，使得采用本發(fā)明的方法所得的指紋圖譜中含有17個(gè)特征峰，并對(duì)其中的5個(gè)進(jìn)行了指認(rèn)，相比于現(xiàn)有技術(shù)中所得的指紋圖譜中含有12個(gè)特征峰，只對(duì)其中的2個(gè)進(jìn)行指認(rèn)，本發(fā)明反映的信息量大，能更好地達(dá)到控制柿葉藥材質(zhì)量的目的。本發(fā)明由于供試品溶液的制備步驟簡(jiǎn)潔、耗時(shí)短，從而使得整個(gè)分析流程所耗用的時(shí)間大為縮短；由于不需用石油醚有機(jī)溶劑進(jìn)行脫脂及除葉綠素，不會(huì)造成部分脂溶性成分的流失，既環(huán)保又經(jīng)濟(jì)；進(jìn)一步，采用乙醇或甲醇進(jìn)行提取，可比較全面提取柿葉中的化學(xué)成分，不會(huì)造成部分脂溶性成分的流失。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例一建立的柿葉對(duì)照指紋圖譜； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例二建立的柿葉對(duì)照指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的基本構(gòu)思是建立柿葉高效液相色譜指紋圖譜分析方法，對(duì)不同產(chǎn)地及品種的柿葉的高效液相色譜指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比研究，建立柿葉的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜，為柿葉藥材的篩選和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。以上所述的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜是指用高效液相色譜(簡(jiǎn)稱HPLC)對(duì)樣品的主要成分進(jìn)行綜合分析，通過(guò)對(duì)多批次藥材的HPLC指紋圖譜測(cè)試、處理，建立起來(lái)的能夠真正反映柿葉藥材質(zhì)量的HPLC圖譜。通過(guò)測(cè)試柿葉藥材樣品指紋圖譜特征峰的個(gè)數(shù)以及與對(duì)照指紋圖譜的相似度來(lái)鑒別藥材質(zhì)量的優(yōu)劣程度，能達(dá)到有效控制柿葉藥材質(zhì)量的目的。實(shí)施例一取柿葉粉末0. 50g，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇15ml，稱重，回流1小時(shí)， 放冷，稱重，用75%乙醇補(bǔ)足減失重量，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μ 1進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫色譜柱(美國(guó)安捷倫公司TC 6謹(jǐn)Χ250_，5μπι)；乙腈-0. 磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為9min，濃度從13%變化至18% 的乙腈；洗脫時(shí)間為Hmin，濃度為18%的乙腈；洗脫時(shí)間為21min，濃度從18%變化至 31%的乙腈；洗脫時(shí)間為Hmin，濃度從31%變化至51%的乙腈；流速1. 5ml · mirT1 ；進(jìn)樣量10 μ 1 ；柱溫240C ；DAD檢測(cè)器采集范圍2IOnm 4IOnm ；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。通過(guò)上述方法對(duì)十個(gè)批次的柿葉指紋圖譜進(jìn)行測(cè)定，色譜儀上安裝國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，通過(guò)該系統(tǒng)建立柿葉對(duì)照指紋圖譜，柿葉藥材應(yīng)具有17個(gè)共有特征峰(其中有5個(gè)特征峰得到指認(rèn))，結(jié)果如圖1所示，其中峰8 金絲桃苷；峰9 異槲皮素；峰13 黃芪苷；峰16 槲皮素；峰17 山柰素以上圖譜中共含17個(gè)特征峰。稱取待測(cè)柿葉樣品粉末0. 50g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇15ml，稱重， 回流1小時(shí)，放冷，稱重，用80%乙醇補(bǔ)足減失重量，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μ 1進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫乙腈-0. 2%磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為lOmin，濃度從15%變化至19% 的乙腈；洗脫時(shí)間為Hmin，濃度為19%的乙腈；洗脫時(shí)間為21min，濃度從19%變化至 30%的乙腈；洗脫時(shí)間為Hmin，濃度從30%變化至51%的乙腈；流速1. Oml · mirT1 ；進(jìn)樣量10 μ 1 ；柱溫250C ；DAD檢測(cè)器采集范圍:190nm 4IOnm ；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。用上述測(cè)試方法得到該柿葉樣品的指紋圖譜，再利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)將該指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，得出該指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。在使用對(duì)照指紋圖譜對(duì)柿葉藥材樣品進(jìn)行鑒別時(shí)，樣品的指紋圖譜中，應(yīng)呈現(xiàn)17個(gè)與對(duì)照指紋圖譜相對(duì)應(yīng)的特征峰，同時(shí)，樣品的指紋圖譜與特征圖譜的相似度應(yīng)該不低于 0.90，使用本發(fā)明的對(duì)照指紋圖譜能很好地達(dá)到控制柿葉藥材質(zhì)量的目的。實(shí)施例二取柿葉粉末0.50g，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇15ml，稱重，回流2小時(shí)， 放冷，稱重，用65%乙醇補(bǔ)足減失重量，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μ 1進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫色譜柱(美國(guó)安捷倫公司TC 6謹(jǐn)Χ250_，5μπι)；流動(dòng)相乙腈-0. 2%磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為lOmin，濃度從15%變化至17%的乙腈；洗脫時(shí)間為Hmin，濃度為17%的乙腈；洗脫時(shí)間為21min，濃度從17%變化至 30%的乙腈；洗脫時(shí)間為Hmin，濃度從30%變化至51%的乙腈；平衡時(shí)間IOmin0 流速 1. Oml · mirT1 ；進(jìn)樣量10μ 1 ；柱溫；DAD檢測(cè)器采集范圍200nm 400nm ；檢測(cè)波長(zhǎng)^Onm。通過(guò)上述方法對(duì)十個(gè)批次的柿葉指紋圖譜進(jìn)行測(cè)定，色譜儀上安裝國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，通過(guò)該系統(tǒng)建立柿葉HPLC對(duì)照指紋圖譜，柿葉藥材應(yīng)具有17個(gè)特征峰(其中有5個(gè)特征峰得到指認(rèn))，結(jié)果如圖2所示，其中峰8::金絲桃苷；峰9:異槲皮素；峰13:黃芪苷；峰16:槲皮素；峰17:山柰素以上圖譜中共含17個(gè)特征峰。稱取待測(cè)柿葉樣品粉末0. 50g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇15ml，稱重， 回流2小時(shí)，放冷，稱重，用80%乙醇補(bǔ)足減失重量，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μ 1進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫色譜柱美國(guó)安捷倫公司TC C18(4. 6匪Χ250_，5μπι)；流動(dòng)相乙腈-0. 3%磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為llmin，濃度從14%變化至18% 的乙腈；洗脫時(shí)間為15min，濃度為18%的乙腈；洗脫時(shí)間為20min，濃度從18%變化至 30%的乙腈；洗脫時(shí)間為15min，濃度從30%變化至50%的乙腈；平衡時(shí)間30min ；流速 1. Oml · mirT1 ；進(jìn)樣量10μ 1 ；柱溫；DAD檢測(cè)器采集范圍190nm 390nm ；檢測(cè)波長(zhǎng)256nm。通過(guò)上述方法測(cè)試得到該柿葉樣品的指紋圖譜后，用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算得出該指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，同時(shí)觀察該指紋圖譜相對(duì)應(yīng)的特征峰個(gè)數(shù)，最后評(píng)價(jià)柿葉樣品的質(zhì)量。在其他實(shí)施方式中，可以采用甲醇或者其他濃度的乙醇，如乙醇濃度為65 % 85%中的任意一值。實(shí)施例三取柿葉粉末0. 50g，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇15ml，稱重，回流1. 5小時(shí)，放冷，稱重，用65%乙醇補(bǔ)足減失重量，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μ 1進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫色譜柱(美國(guó)安捷倫公司TC 6謹(jǐn)Χ250_，5μπι)；流動(dòng)相乙腈-0. 3%磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為9min，濃度從13%變化至17% 的乙腈；洗脫時(shí)間為16min，濃度為17%的乙腈；洗脫時(shí)間為21min，濃度從17%變化至 30%的乙腈；洗脫時(shí)間為Hmin，濃度從30%變化至49%的乙腈；平衡時(shí)間25min。流速 1. Oml · mirT1 ；進(jìn)樣量10μ 1 ；柱溫；
DAD檢測(cè)器采集范圍200nm 400nm ；檢測(cè)波長(zhǎng)256nm。通過(guò)上述方法對(duì)十個(gè)批次的柿葉指紋圖譜進(jìn)行測(cè)定，色譜儀上安裝國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，通過(guò)該系統(tǒng)建立柿葉HPLC對(duì)照指紋圖譜，柿葉藥材對(duì)照指紋圖譜應(yīng)具有17個(gè)共有特征峰(其中有5個(gè)特征峰得到指認(rèn))。稱取待測(cè)柿葉樣品粉末0. 50g，置具塞錐形瓶中，精密加入85%乙醇15ml，稱重， 回流1.5小時(shí)，放冷，稱重，用85%乙醇補(bǔ)足減失重量，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μ 1進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫色譜柱美國(guó)安捷倫公司TC C18(4. 6匪Χ250_，5μπι)；流動(dòng)相乙腈-0. 3%磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為llmin，濃度從14%變化至18% 的乙腈；洗脫時(shí)間為16min，濃度為18%的乙腈；洗脫時(shí)間為20min，濃度從18%變化至
的乙腈；洗脫時(shí)間為15min，濃度從變化至51%的乙腈；平衡時(shí)間28min。流速 1. Oml · mirT1 ；進(jìn)樣量10μ 1 ；柱溫；DAD檢測(cè)器采集范圍205nm 405nm ；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。通過(guò)上述方法測(cè)試得到該柿葉樣品的指紋圖譜后，用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)得出該指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，同時(shí)觀察該指紋圖譜相對(duì)應(yīng)的特征峰個(gè)數(shù)，最后評(píng)價(jià)柿葉樣品的質(zhì)量。在其他實(shí)施方式中，可以采用甲醇或者其他濃度的乙醇作為提取液，如可選用 66 %的乙醇、69 %的乙醇、70 %的乙醇、76 %的乙醇、82 %的乙醇。以上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)介紹，文中應(yīng)用具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，包括如下步驟1)稱取至少十個(gè)柿葉粉末樣品，將各柿葉粉末樣品分別與提取液混合，回流后放冷，然后過(guò)濾，得到供試品溶液；2)而后利用高效液相色譜法進(jìn)行分析，得到柿葉的高效液相色譜指紋圖譜，根據(jù)各柿葉粉末樣品的高效液相色譜指紋圖譜建立柿葉的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜；其中，高效液相色譜分析法的色譜條件中流動(dòng)相設(shè)定如下乙腈-磷酸溶液，二元梯度洗脫洗脫時(shí)間為9 llmin，濃皮從13% 15%變化至17% 19%的乙腈；洗脫時(shí)間為14 16min，濃度為17% 19%的乙腈；洗脫時(shí)間為19 21min，濃度從17% 19%變化至四％ 31% 的乙腈；洗脫時(shí)間為14 16min，濃度從 31%變化至49% 51%的乙腈；3)將待測(cè)樣品與提取液混合，回流后放冷，然后過(guò)濾，得到供試品溶液，而后用高效液相色譜法按步驟i)中的色譜條件進(jìn)行分析，得到該待測(cè)樣品的高效液相色譜指紋圖譜，將該指紋圖譜與柿葉的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較。
2.如權(quán)利要求1所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，過(guò)濾采用微孔濾膜進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求2所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，所述微孔濾膜的孔徑為0. 35 μ m 0. 45 μ m。
4.如權(quán)利要求3所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，所述提取液為乙醇或甲醇。
5.如權(quán)利要求4所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，所述提取液為濃度為65% 85%的乙醇或甲醇。
6.如權(quán)利要求4所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，所述提取液為濃度為75%的乙醇或甲醇。
7.如權(quán)利要求1所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，高效液相色譜分析法分析中，采用二極管陣列檢測(cè)器采集波長(zhǎng)，采集范圍為從(190nm 210nm)至 (390nm 410nm)；檢測(cè)波長(zhǎng) 250nm 260nm。
8.如權(quán)利要求1所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，所述磷酸溶液的濃度為0. 0.3%。
9.如權(quán)利要求1所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，步驟2)中，平衡時(shí)間為IOmin 30min。
10.如權(quán)利要求1所述的柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，其特征在于，步驟1)中， 回流時(shí)間為0. 5小時(shí) 2小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種柿葉質(zhì)量的高效液相色譜分析方法，包括如下步驟1)稱取至少十個(gè)柿葉粉末樣品，將各柿葉粉末樣品分別與提取液混合，回流后放冷，然后過(guò)濾，得到供試品溶液；2)而后利用高效液相色譜法進(jìn)行分析，得到柿葉的高效液相色譜指紋圖譜，根據(jù)各柿葉粉末樣品的高效液相色譜指紋圖譜建立柿葉的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜；3)將待測(cè)樣品與提取液混合，回流后放冷，然后過(guò)濾，得到供試品溶液，而后用高效液相色譜法按步驟2)中的色譜條件進(jìn)行分析，得到該待測(cè)樣品的高效液相色譜指紋圖譜，將該指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較。本發(fā)明中供試品溶液的制備步驟簡(jiǎn)潔，整個(gè)分析流程所用時(shí)間縮短，且能更好地達(dá)到控制柿葉藥材質(zhì)量的目的。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102401819SQ201110288418
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者利幼, 吳睿, 尹仁杰, 李蘭芳, 李楚源, 林挺, 梁敬儀, 王德勤, 羅杰 申請(qǐng)人:廣州白云山和記黃埔中藥有限公司