專利名稱：一種柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物。
背景技術(shù)：
柿樹屬柿樹科(Ebenaceae)柿樹屬(Diospyros)植物柿(Diospyros kaki L. . f) 植物，是我國南北各地普遍栽培的食用品種。柿果、柿核、柿蒂、柿霜、柿漆、柿餅、柿樹心木、 柿花、柿葉、柿子皮、柿木皮及柿根皮等均可作為藥用或有可能成為藥物。在我國柿葉資源 特別豐富，使用方便，醫(yī)用療效確切，正日益受到人們的重視，柿的新鮮或干燥葉，其入藥始 見于明《滇南本草》記載“經(jīng)霜葉敷臃瘡”。柿葉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和功效成分，具有抗 菌消炎、生津止渴、清熱解毒、潤肺強(qiáng)心、鎮(zhèn)咳止血、抗癌防癌等多種保健功能，而且柿葉產(chǎn) 品食用安全無毒，故柿葉的開發(fā)利用前景廣闊?，F(xiàn)代研究表明柿葉含有以萘為骨架的芳香化合物(萘醌類、萘酚類)，苯并吡喃 酮類(黃酮類、花色素類、香豆素類)，萜類(主要是三萜化合物且都是五環(huán)三萜化合物)， 谷甾醇類，脂肪酸，鞣質(zhì)，柿葉中含有大量的維生素C、E和有機(jī)酸類等。柿葉有好的改善心 腦血管功能作用。柿葉具有止血作用；柿葉提取液有抗菌、解熱作用；柿葉具有明顯的抗氧 化作用；柿葉具有明顯的減肥降脂作用；柿葉有抗癌變和抗誘變作用，調(diào)節(jié)免疫功能作用。 柿葉粉能顯著降低食用高固醇食物小鼠肝臟中的膽固醇濃度，增加膽汁酸的排泄。臨床上柿葉有軟化血管和預(yù)防動(dòng)脈硬化的作用，用于治療心腦血管疾?。粦?yīng)用柿 葉可治療多種出血癥；柿葉具有抗菌消炎、解熱作用；柿葉有預(yù)防貧血、降脂減肥和美容的 作用；有抗癌和抗誘變作用；柿葉復(fù)方對婦女某些疾病如痛經(jīng)有效，柿葉茶對患者的精神 狀態(tài)和食欲有好。柿葉有清血利尿、治療燒傷和褥瘡的作用。腦缺血耐受現(xiàn)象[1] (Brain ischemic tolerance，BIT)是指預(yù)先短暫性缺血或輕 度缺氧激發(fā)或動(dòng)員機(jī)體內(nèi)在的防護(hù)能力，使機(jī)體對隨后嚴(yán)重的缺血、缺氧產(chǎn)生防御和保護(hù) 作用的現(xiàn)象。腦缺血耐受現(xiàn)象最初在研究心肌缺血時(shí)發(fā)現(xiàn)，腦、骨骼肌、肝、腎、小腸等器官 中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。現(xiàn)認(rèn)為腦缺血耐受的機(jī)制主要有興奮性氨基酸(EAA)、炎癥、熱休克 蛋白(HSP)、腺苷、細(xì)胞凋亡、反應(yīng)性星形細(xì)胞增生和信號傳導(dǎo)通路。藥物(腺苷、3-硝基丙 酸(3-NPA)、某些抗生素、麻醉藥物、阿司匹林、內(nèi)毒素、緩激肽、神經(jīng)營養(yǎng)因子等)對腦缺血 耐受的提高作用，但因多方原因，上述藥物在腦缺血耐受中應(yīng)用受到了制約。祖國醫(yī)學(xué)沒有 腦缺血耐受的明確提法，但祖國醫(yī)學(xué)對腦缺血辨證清楚，腦缺血屬于中醫(yī)“缺血中風(fēng)”的范 疇。缺血中風(fēng)的發(fā)生主要與風(fēng)、火、痰、淤、虛等因素有關(guān)，而與“淤”關(guān)系最為密切，“活血化 淤”可是提高腦缺血耐受的基本方法。那么如何利用中醫(yī)藥大寶庫來解決提高腦缺血耐受 作用呢？至今未見有公開報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種柿葉中提高 腦缺血耐受作用的提取物，可有效解決提高腦缺血耐受作用的問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該提取物為柿葉提取物，是將柿葉粉碎成粗粉，加入柿 葉粗粉重量的8-10倍量的質(zhì)量濃度為70%的乙醇，浸泡30min后，回流提取Ih ；過濾，藥渣 再加柿葉粗粉重量的6-8倍的質(zhì)量濃度為70%的乙醇，回流提取Ih過濾，合并兩次濾液，回 收乙醇后，用NaOH調(diào)pH至13，3000r/min離心15min，得柿葉提取物，或稱取柿葉粗粉，用超 臨界( 萃取法，萃取壓力為30. OmPa,萃取溫度50°C，CO2流量30Kg/h，萃取池，得柿葉提 取物。本發(fā)明提取物有效用于制備治療提高腦缺血耐受作用的藥物。制備方法簡單，原 材料豐富，成本低，效果好，開拓了柿葉的藥用價(jià)值，是中藥上的創(chuàng)新。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說明。實(shí)施例1，本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，是由柿葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過30目篩成柿葉粗粉，然 后，取柿葉粗粉100克加入柿葉粗粉重量十倍量的質(zhì)量濃度為70%乙醇1000克，浸泡30 分鐘，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液；藥渣再加入柿葉粗粉重量8倍的質(zhì)量濃度為70%的乙 醇800g，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液，合并兩次濾液，回收乙醇后，用NaOH調(diào)pH值為13， 3000r/min離心15min，得柿葉提取物。實(shí)施例2，本發(fā)明在具體實(shí)施中，還可由以下實(shí)現(xiàn)將柿葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過50目 篩，成柿葉粗粉然后，取柿葉粗粉50克加入柿葉粗粉重量8倍量的質(zhì)量濃度為70%乙醇 400克，浸泡30分鐘，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液；藥渣再加入柿葉粗粉重量6倍的質(zhì)量 濃度為70%的乙醇300g，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液，合并兩次濾液，回收乙醇后，用NaOH 調(diào)PH值為13，3000r/min離心15min，得柿葉提取物。實(shí)施例3，本發(fā)明在具體實(shí)施中，還可由以下實(shí)現(xiàn)將柿葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粗粉， 然后，取柿葉粗粉80克加入柿葉粗粉重量9倍量的質(zhì)量濃度為70%乙醇720克，浸泡30 分鐘，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液；藥渣再加入柿葉粗粉重量7倍的質(zhì)量濃度為70%的乙 醇560g，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液，合并兩次濾液，回收乙醇后，用NaOH調(diào)pH值為13， 3000r/min離心15min，得柿葉提取物。實(shí)施例4，本發(fā)明在具體實(shí)施中，也可由以下具體方案實(shí)現(xiàn)將柿葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎 成粗粉，取粗粉100g，置入超臨界萃取釜中，用超臨界CO2萃取法，萃取壓力為30. OmPaJ^ 度50°C，CO2流量30Kg/h，萃取池，得柿葉提取物。本發(fā)明提取物可有效用于制備治療提高腦缺血耐受作用的藥物，對于提高腦缺血 耐受作用經(jīng)試驗(yàn)得到了充分的證明，有關(guān)試驗(yàn)資料如下對小鼠腦缺血耐受模型的影響1實(shí)驗(yàn)材料1.1試劑藥品本發(fā)明柿葉提取物稱取柿葉粗粉，加8-10倍量的70%乙醇，浸泡30min后回流 提取Ih ；過濾，藥渣再加6-8倍量的70%乙醇，回流提取Ih過濾。合并兩次濾液，回收乙醇 后用NaOH調(diào)pH至13，離心(3000r/min) 15min,得柿葉提取物?；蚍Q取柿葉粗粉，采用超臨 界C02萃取法，萃取壓力為30. OmPa，萃取溫度50°C，(X)2流量30Kg · h—1，萃取時(shí)間3h，得柿 葉提取物。
銀杏葉提取物片(金納多)，德國威瑪舒博士藥廠，批號9900908 ；水合氯醛，天 津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號20071018 ；醫(yī)用酒精，鄭州晟弘工貿(mào)有限公司，批號 20090801 ；氯化鈉注射液，鄭州永和制藥有限公司，批號09073105 ；碘[1251]6_酮-前列 腺素-F1 α內(nèi)皮素，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所， 批號20091125;碘[125I]血栓烷素化放射免疫分析藥盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公 司解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所，批號20091125;纖溶酶原激活劑(t-PA)含量測定 試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，上海太陽生物技術(shù)有限公司，批號41130;纖溶酶原激活劑抑制 物-I(PAI-I)含量測定試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，上海生物科技有限公司，批號42135。1. 2實(shí)驗(yàn)儀器JT6001電子天平，上海精天電子儀器廠；1202080019電子分析天平，奧豪斯 (上海)公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；酶免儀， 680MicroplateReader, Bio-Rad Laboratories ；SN-695B 型智能放免 γ 測量儀，上海原子 核研究所日環(huán)儀器一廠。1. 3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級小鼠，昆明種，雄性，體重25 30g ；由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供，合格證 編號 911137。2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1造模與給藥取小鼠1 只，隨機(jī)均勻分為7組，分別為假手術(shù)組、缺血再灌注組、預(yù)處理模型 組、柿葉醇提物高劑量組、柿葉醇提物中劑量組、柿葉醇提物低劑量組、銀杏葉提取物組。所 有小鼠經(jīng)10%水合氯醛(0. 03ml/10g)腹腔注射麻醉，仰固定于手術(shù)臺(tái)上，頸前正中切口， 鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。除假手術(shù)組、缺血再灌注組外，其余各組小鼠用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè) 頸總動(dòng)脈，分別阻斷血流lOmin，然后恢復(fù)灌流；假手術(shù)組、缺血再灌注組只暴露雙側(cè)頸總 動(dòng)脈，但不阻斷血流。動(dòng)物手術(shù)蘇醒后，各給藥組分別給予高劑量柿葉醇提物(400mg/kg)、 中劑量柿葉醇提物(200mg/kg)、低劑量柿葉醇提物(100mg/kg)、銀杏葉提取物片GOmg/ kg)，假手術(shù)組、缺血再灌注組及預(yù)處理模型組灌同體積的生理鹽水，所有小鼠的灌藥體積 是0. lml/10g,每天給藥1次，連續(xù)給藥5天。于第5天禁食1 給藥后lh，所有小鼠經(jīng) 10%水合氯醛(0. 03ml/10g)腹腔注射麻醉，仰位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸前正中切口，鈍性分 離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，除假手術(shù)組外，其余小鼠均用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分別阻斷血 流30min，然后恢復(fù)灌流；假手術(shù)組只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流。術(shù)中維持環(huán)境溫度 M±1°C。實(shí)驗(yàn)過程中死亡33只小鼠，各組小鼠情況見結(jié)果。2. 2觀察項(xiàng)目及檢測方法所有小鼠于末次手術(shù)后24h取血，枸櫞酸鈉抗凝，分離血漿，采用酶聯(lián)免疫法測定 纖溶酶原激活劑(t-PA)含量、纖溶酶原激活劑抑制物-I(PAI-I)含量；取血后處死，迅速 剝?nèi)∧X組織，冠狀切取做HE染色，切取皮層組織15mg，采用放射免疫法測定6-酮-前列腺 素-F1 α、血栓烷素化含量。2. 2. 1纖溶酶原激活劑含量的測定方法檢驗(yàn)原理采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法原理定量測定組織纖溶酶原激活劑水 平。包被人t-PA抗體與待測樣本中的t-PA結(jié)合，加入酶標(biāo)抗體形成復(fù)合物，后者與底物作用呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。490nm處測得的A值與待測樣本t_PA含量成正比。操作程序①試劑重建濃稀釋液用前置于37°C水浴15min，振搖均勻(因?yàn)槟敢蝴} 濃度高，冰箱保存易結(jié)冰析出)，然后用蒸餾水做10倍稀釋(Iml濃稀釋液+9ml蒸餾水)。 濃洗滌液用前置于37°C水浴15min，振搖均勻(因?yàn)槟敢蝴}濃度高，冰箱保存易結(jié)冰析出)， 然后用蒸餾水做20倍稀釋(Iml濃稀釋液+19ml蒸餾水)。將每瓶校準(zhǔn)品用1. 8ml稀釋液準(zhǔn) 確復(fù)溶(60ng/ml)。取250 μ 1，用稀釋液作四倍比稀釋，得濃度為60、30、15、7. 5、3. 75ngml 五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。②加樣每孔加不同濃度校準(zhǔn)品或待測樣本100μ 1，空白對照孔加入稀釋液 100μ 1，37°C孵育150分鐘。③洗滌棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3秒鐘，甩 干，反復(fù)三次后拍干。④加酶標(biāo)抗體每孔加入酶標(biāo)抗體100 μ 1，37°C孵育60分鐘。⑤洗滌 棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3秒鐘，甩干，反復(fù)三次后拍干。⑥顯色臨用前 每片OPD用5ml底物緩沖液溶解。每孔加底物液100 μ 1，37°C孵育15分鐘。⑦終止每孔 加終止液50μ1。⑧比色在酶標(biāo)儀上490nm處，以空白對照空調(diào)零，測定各孔A值。⑨數(shù)據(jù) 處理以A49c^it-PA校準(zhǔn)品濃度(ng/ml)在普通坐標(biāo)系上作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣本t_PA含量 (ng/ml)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。2. 2. 2纖溶酶原激活劑抑制物-1含量的測定方法檢驗(yàn)原理采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法原理定量測定纖溶酶原激活劑抑制 物-1水平。包被人PAI-I抗體與待測樣本中的PAI-I結(jié)合，加入酶標(biāo)抗體形成復(fù)合物，后 者與底物作用呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。490nm處測得的A值與待測樣本PAI-I含量成正比。操作程序①試劑重建濃稀釋液用前置于37°C水浴15min，振搖均勻(因?yàn)槟敢蝴} 濃度高，冰箱保存易結(jié)冰析出)，然后用蒸餾水做10倍稀釋(Iml濃稀釋液+9ml蒸餾水)。 濃洗滌液用前置于37°C水浴15min，振搖均勻(因?yàn)槟敢蝴}濃度高，冰箱保存易結(jié)冰析出)， 然后用蒸餾水做20倍稀釋(Iml濃稀釋液+19ml蒸餾水)。將每瓶校準(zhǔn)品用0. 5ml稀釋液 準(zhǔn)確復(fù)溶(120ng/ml)。取250 μ 1，用稀釋液作六倍比稀釋，得濃度為120、60、30、15、7· 5、 3. 75,1. 875ngml七個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。②加樣每孔加不同濃度校準(zhǔn)品或待測樣本100μ 1，空白對照 孔加入稀釋液100μ 1，37°C孵育150分鐘。③洗滌棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔， 靜置3秒鐘，甩干，反復(fù)三次后拍干。④加酶標(biāo)抗體每孔加入酶標(biāo)抗體100 μ 1，37°C孵育60 分鐘。⑤洗滌棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3秒鐘，甩干，反復(fù)三次后拍干。 ⑥顯色臨用前每片OPD用5ml底物緩沖液溶解。每孔加底物液100μ1，37 孵育15。⑦終 止每孔加終止液50μ 1。⑧比色在酶標(biāo)儀上490nm處，以空白對照空調(diào)零，測定各孔A值。⑨ 數(shù)據(jù)處理以A49t^iPAI-I校準(zhǔn)品濃度(ng/ml)在普通坐標(biāo)系上作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣本PAI-I 含量(ng/ml)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。2. 2. 3血栓烷化的測定方法測定原理利用液相競爭抑制原理，采用平衡法對樣品進(jìn)行測定。待測樣本或標(biāo)準(zhǔn) 品與限量的抗血清及標(biāo)記抗原加在一起進(jìn)行競爭性結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)完全后，加入免疫分離 劑，分離出抗原-抗體復(fù)合物，測定復(fù)合物的放射性(B)，計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率(Β/Β0%)。校準(zhǔn)試劑緩沖液A，1瓶(液體)；緩沖液B，1瓶(藍(lán)色，液體)；抗血清1瓶 (白色，凍干粉)；標(biāo)準(zhǔn)品1支(白色，凍干粉)，濃度為濃度為20，60，180，500，1000pg/ml ； 125I-TXB2 :1瓶(白色，凍干粉)；I3R分離劑1瓶(液體)，使用前充分搖勻。操作程序本實(shí)驗(yàn)采用平衡法，取聚乙烯試管編號，按下表程序操作
TXB2RIA 加液程序(μ 1)
權(quán)利要求
1.一種柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物，其特征在于，該提取物是由該提取物為 柿葉提取物，是將柿葉粉碎成粗粉，加入柿葉粗粉重量的8-10倍量的質(zhì)量濃度為70%的乙 醇，浸泡30min后，回流提取Ih ；過濾，藥渣再加柿葉粗粉重量的6_8倍的質(zhì)量濃度為70% 的乙醇，回流提取Ih過濾，合并兩次濾液，回收乙醇后，用NaOH調(diào)pH至13，3000r/min離心 15min，得柿葉提取物，或稱取柿葉粗粉，用超臨界(X)2萃取法，萃取壓力為30. OmPa，萃取溫 度50°C，CO2流量30Kg/h，萃取池，得柿葉提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物，其特征在于，由柿葉 經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過30目篩成柿葉粗粉，然后，取柿葉粗粉100克加入柿葉粗粉重量十倍量的 質(zhì)量濃度為70%乙醇1000克，浸泡30分鐘，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液；藥渣再加入柿 葉粗粉重量8倍的質(zhì)量濃度為70%的乙醇800g，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液，合并兩次濾 液，回收乙醇后，用NaOH調(diào)pH值為13，3000r/min離心15min，得柿葉提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物，其特征在于，將柿葉 經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過50目篩，成柿葉粗粉然后，取柿葉粗粉50克加入柿葉粗粉重量8倍量的質(zhì) 量濃度為70%乙醇400克，浸泡30分鐘，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液；藥渣再加入柿葉粗 粉重量6倍的質(zhì)量濃度為70%的乙醇300g，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液，合并兩次濾液， 回收乙醇后，用NaOH調(diào)pH值為13，3000r/min離心15min，得柿葉提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物，其特征在于，將柿葉 經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粗粉，然后，取柿葉粗粉80克加入柿葉粗粉重量9倍量的質(zhì)量濃度為70% 乙醇720克，浸泡30分鐘，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液；藥渣再加入柿葉粗粉重量7倍的 質(zhì)量濃度為70%的乙醇560g，回流提取1小時(shí)，過濾得濾液，合并兩次濾液，回收乙醇后，用 NaOH調(diào)pH值為13，3000r/min離心15min，得柿葉提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物，其特征在于，將柿葉 經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粗粉，取粗粉100g，置入超臨界萃取釜中，用超臨界(X)2萃取法，萃取壓力為 30. OmPa，溫度50°C，CO2流量30Kg/h，萃取3h，得柿葉提取物。
6.權(quán)利要求1或2-5所述的柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物為在制備治療提高腦 缺血耐受作用藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種柿葉中提高腦缺血耐受作用的提取物，可有效解決提高腦缺血耐受作用的問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該提取物為柿葉提取物，是將柿葉粉碎成粗粉，加入柿葉粗粉重量的8-10倍量的質(zhì)量濃度為70％的乙醇，浸泡30min后，回流提取1h；過濾，藥渣再加柿葉粗粉重量的6-8倍的質(zhì)量濃度為70％的乙醇，回流提取1h過濾，合并兩次濾液，回收乙醇后，用NaOH調(diào)pH至13，3000r/min離心15min，得柿葉提取物，或稱取柿葉粗粉，用超臨界CO2萃取法，萃取壓力為30.0mPa，萃取溫度50℃，CO2流量30Kg/h，萃取3h，得柿葉提取物。本發(fā)明提取物有效用于制備治療提高腦缺血耐受作用的藥物。制備方法簡單，原材料豐富，成本低，效果好，開拓了柿葉的藥用價(jià)值，是中藥上的創(chuàng)新。
文檔編號A61P9/10GK102068483SQ20111000311
公開日2011年5月25日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者張小莉, 白明, 苗明三, 苗艷艷 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院