專利名稱：一種肝癌多肽標(biāo)志物抗原競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及肝癌多肽標(biāo)志物抗原競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著肝癌外科的成熟和發(fā)展，肝癌的治療方法和手段日漸豐富，而不再局限于單一的手術(shù)治療。肝切除術(shù)和肝移植仍然是肝癌患者治療的主要方法，但微創(chuàng)治療、經(jīng)皮肝動(dòng)脈化療栓塞等技術(shù)方法，作為手術(shù)治療的重要補(bǔ)充，也得到了較廣泛的應(yīng)用，它們?cè)跒榛颊邉?chuàng)造手術(shù)治療機(jī)會(huì)、降低或減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面都起到了一定的作用，延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間。雖然如此，肝癌患者發(fā)病隱匿、無(wú)明顯癥狀、多數(shù)患者就診時(shí)已失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。因此，“早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療”是降低癌癥死亡率的重要措施。篩選和建立用于癌癥早期診斷的、高敏感、高特異的血清學(xué)診斷技術(shù)，提供癌癥早期預(yù)警普查，具有重大意義和巨大市場(chǎng)前景。目前國(guó)內(nèi)外廣泛采用檢測(cè)血清中甲胎蛋白(AFP)來(lái)確診肝癌(HCC)，盡管這種方法提高了 HCC的檢測(cè)水平，但仍有顯著數(shù)量患者的甲胎蛋白并未升高，尤其對(duì)腫瘤直徑小于3CM的小肝癌患者，其敏感性及特異性更低。近年來(lái)，標(biāo)志物聯(lián)檢在腫瘤診斷中的應(yīng)用的研究得到很大的重視。如通過(guò)聯(lián)檢甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清鐵蛋白(SF)、 α-L-巖藻糖苷酶(AFU)可顯著提高肝癌診斷的陽(yáng)性率。AFP、CEA、SF、CA等四標(biāo)志物聯(lián)檢原發(fā)肝癌的實(shí)驗(yàn)也獲得不錯(cuò)的結(jié)果。但由于診斷特異性或成本效益方面的原因，很難在肝癌普查中廣泛應(yīng)用。血清中豐富的多肽資源在目前重大疾病診斷中扮演重要的角色。采用目前常規(guī)的臨床手段進(jìn)行多肽檢測(cè)逐漸引起學(xué)術(shù)界和醫(yī)藥界的高度重視，基于多肽的腫瘤診斷技術(shù)正開(kāi)始向臨床應(yīng)用高速發(fā)展，腫瘤的早期預(yù)警技術(shù)也在開(kāi)發(fā)之中，一些多肽的聯(lián)合應(yīng)用有可能為腫瘤等重大疾病的預(yù)警提供革新性的突破。血清中多肽同血清中蛋白不同，其分子量低于lOOOODa，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，變化多樣。是否能夠采用目前常規(guī)的臨床手段進(jìn)行檢測(cè)仍在探索。目前，檢測(cè)血清中多肽進(jìn)行臨床診斷還沒(méi)有先例。血清多肽能否用于診斷或早期診斷肝癌可以從三個(gè)方面來(lái)判斷。1、血清多肽是血清蛋白的降解產(chǎn)物或基因直接編碼產(chǎn)物。當(dāng)生理狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)尤其向腫瘤轉(zhuǎn)化時(shí)，蛋白的代謝發(fā)生變化，導(dǎo)致多肽相應(yīng)變化， 從而建立了多肽----疾病的相關(guān)關(guān)系，因此，多肽可以像蛋白一樣進(jìn)行疾病診斷。2、實(shí)踐上已經(jīng)有一些疾病的診斷采用多肽標(biāo)志物，1985年以來(lái)，利用合成多肽檢測(cè)艾滋病病毒 (PM)、風(fēng)疹病毒、人巨細(xì)胞病毒及類風(fēng)濕等已應(yīng)用到臨床。3、文獻(xiàn)表明，多肽可以用于臨床診斷，如，Clinical Chemistry 51 10,1933-1945(2005)和 Clinical Chemitry 53:61， 067-1074(2007)認(rèn)為血清多肽標(biāo)志物能更精確的區(qū)分蛋白標(biāo)志物不能區(qū)分的腫瘤。Nat Methods. 2008 Jan ；5(1) :57_9認(rèn)為質(zhì)譜診斷腫瘤甚至比MRI還好。質(zhì)譜技術(shù)給生命科學(xué)帶來(lái)的促進(jìn)作用舉世公認(rèn)，近十年來(lái)，質(zhì)譜在新生二篩查、基因突變檢測(cè)方面取得一系列重要進(jìn)展，并出現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析專業(yè)質(zhì)譜儀器，顯示了質(zhì)譜在臨床診斷方面
3的價(jià)值?；谘宥嚯目乖哪[瘤早期診斷試劑盒是當(dāng)前最受關(guān)注的腫瘤早期診斷技術(shù)之一。目前臨床領(lǐng)域中單一標(biāo)志物始終存在著特異性不強(qiáng)、陽(yáng)性率較低等不足，特別是對(duì)早期腫瘤的檢測(cè)率不高，多標(biāo)志聯(lián)合檢測(cè)事在必行，但苦于沒(méi)有一個(gè)很好的手段實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)。2006年Jos印Villanueva等人對(duì)32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌血清多肽研究，發(fā)現(xiàn)14個(gè)、10個(gè)和58個(gè)可分別作為前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的腫瘤標(biāo)志多肽， 預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%。血清中存在的豐富的多肽為腫瘤預(yù)警和早期診斷提供了豐富的標(biāo)志物資源，這些多肽的聯(lián)合應(yīng)用有可能為腫瘤等重大疾病的預(yù)警提供革新性突破。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，序列為 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln 的多肽是癌癥重要血清多肽標(biāo)志物之一。近幾年興起的血清多肽組學(xué)已成功應(yīng)用于幾種癌的診斷研究，如乳腺癌，卵巢癌， 前列腺癌等，主要采用的是表面增強(qiáng)激光解吸離子化(SELDI)技術(shù)和免疫磁珠技術(shù)，但該體系存在價(jià)格昂貴，不利推廣的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供肝癌多肽標(biāo)志物抗原競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的肝癌多肽標(biāo)志物抗原競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 5269的抗人原發(fā)性肝癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株AP0105分泌的單克隆抗體以及和待測(cè)樣品中的多肽標(biāo)志物競(jìng)爭(zhēng)的多肽標(biāo)準(zhǔn)品，所述多肽的序列為Asn-Le u-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。本其中，所述雜交瘤細(xì)胞株是以多肽標(biāo)志物抗原(序列為Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln 的多肽，命名為多肽 5)與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)的偶聯(lián)物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明提供的抗人原發(fā)性肝癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株AP0105，已于2011年9月 27號(hào)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3 號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 5269。其中，所述的單克隆抗體為酶標(biāo)單克隆抗體，優(yōu)選的，所述標(biāo)記的酶可為辣根過(guò)氧化物酶。本發(fā)明的肝癌多肽標(biāo)志物抗原競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒還可進(jìn)一步含有包被液、5%脫脂奶粉、TMB顯色液、2M硫酸和96孔酶聯(lián)板。本發(fā)明提供的檢測(cè)肝癌多肽標(biāo)志物抗原檢測(cè)方法，包括步驟(1)采集樣品；(2)用所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果優(yōu)選地，所述方法具體包括如下步驟1)取1-1. 5 μ g/mL多肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μ L (包被液溶解)，置于96孔板中，4°C放置過(guò)夜或37°C放置2小時(shí)；2)棄包被液，用0. 01M、pH7. 4 PBST緩沖液200-300 μ L清洗5-7次，拍干;
3)加入200-300 μ L 5%的脫脂奶粉，37°C靜置封閉1-2小時(shí)；4)棄封閉液，用0. 01M、pH7. 4 PBST緩沖液200-300 μ L清洗5-7次，拍干;5)待測(cè)樣品與0. 3 μ g/mL的HRP標(biāo)記多肽抗體以體積比1 1在板外37°C結(jié)合 0. 5-1小時(shí)；同時(shí)以PBS代替待測(cè)樣品作為陰性對(duì)照；6)加入80-120 μ L 5)中結(jié)合溶液，37°C靜置0. 5-1小時(shí)；7)棄 6)中溶液，用 0. 01M、pH7. 4 PBST 緩沖液 200-300 μ L 清洗 5-7 次，拍干；8)加入80-120 μ LTMB顯色液，37°C避光孵育15min顯色；9)加入30-70 μ L 2M硫酸，終止反應(yīng)；10)用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的光吸收值(0D值)。本發(fā)明所提供的單克隆抗體針對(duì)多肽標(biāo)志物抗原的特異性強(qiáng)；多肽標(biāo)志物抗原的檢測(cè)方法的操作步驟簡(jiǎn)便快捷，利于臨床檢測(cè)；可進(jìn)行高通量、低成本的酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)。本發(fā)明將多肽抗體與ELSIA技術(shù)聯(lián)合，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)生物標(biāo)志群，并可用于大規(guī)模的樣本檢測(cè)，是驗(yàn)證血清標(biāo)志物和應(yīng)用于臨床檢測(cè)的理想工具。


圖1為本發(fā)明的檢測(cè)肝癌與正常血清的ROC曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1多肽標(biāo)志物抗原單克隆抗體的制備方法1)采用偶聯(lián)載體蛋白KLH的合成的多肽5作為免疫原免疫BALB/C小鼠；其全長(zhǎng)序列為Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。2)2周后檢測(cè)尾血滴度，達(dá)到1 1000以上后，取BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞在PEG作用下進(jìn)行融合；3)通過(guò)ELISA方法進(jìn)行篩選，用有限稀釋法對(duì)分泌抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆純化；4)篩選出10株針對(duì)合成肽5的雜交瘤細(xì)胞，意外地發(fā)現(xiàn)其中一株敏感性較高(lng/well)，擴(kuò)增細(xì)胞系，制備并純化單抗腹水，檢測(cè)單抗的效價(jià)(1 200000)、滴度 (0.0005 μ g/ml)及亞型鑒定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特異性單克隆抗體。將該雜交瘤細(xì)胞株命名為抗人原發(fā)性肝癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并于2011年9月27 號(hào)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 5269。實(shí)施例2多肽標(biāo)志物抗原的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的組裝1) 1. 25 μ g/ml辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的實(shí)施例1的抗多肽5的特異性單克隆抗體；2)多肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 μ g/ml合成肽5的包被溶液；3)包被液0. IM pH9. 6的碳酸鹽緩沖液；4) 5%脫脂奶粉5g/100ml脫脂奶粉；5) TMB顯色液購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技公司；6) 2M 硫酸；7)96孔酶聯(lián)板。
實(shí)施例3多肽標(biāo)志物抗原的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法樣本臨床確診的肝癌血清、正常血清各60份。檢測(cè)過(guò)程1)取1 μ g/mL多肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μ L (包被液溶解)，置于96孔板中，4°C放置過(guò)夜；2)棄包被液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST緩沖液200 μ L清洗6次，拍干；3)加入200 μ L 5%的脫脂奶粉，37°C靜置封閉1. 5小時(shí)；4)棄封閉液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST緩沖液200 μ L清洗6次，拍干；5)待測(cè)樣品與0. 3 μ g/mL的HRP標(biāo)記多肽抗體以體積比1 1在板外37°C結(jié)合 1小時(shí)；同時(shí)以PBS代替待測(cè)樣品作為陰性對(duì)照；6)加入100 μ L 5)中結(jié)合溶液，37°C靜置1小時(shí)；7)棄6)中溶液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST緩沖液200 μ L清洗6次，拍干；8)加入100 μ LTMB顯色液，37°C避光孵育15min顯色；9)加入50 μ L 2Μ硫酸，終止反應(yīng)；10)用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的光吸收值(0D值)。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)，如圖1的ROC曲線顯示，肝癌血清與正常血清兩組診斷陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為OD 值< =0. 967，敏感度達(dá)到94. 3%，特異度達(dá)到95. 1 %，說(shuō)明用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)，特異性很強(qiáng)、重復(fù)性好。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種肝癌多肽標(biāo)志物抗原競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 5269的抗人原發(fā)性肝癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株APO105分泌的單克隆抗體以及和待測(cè)樣品中的多肽標(biāo)志物競(jìng)爭(zhēng)的多肽標(biāo)準(zhǔn)品，所述多肽的序列為Asn-Le u-Gly-His-Gly-His_Lys_His-Glu—Arg—Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Glnο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的單克隆抗體為酶標(biāo)單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其還含有包被液、5%脫脂奶粉、TMB 顯色液、2M硫酸和96孔酶聯(lián)板。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種肝癌多肽標(biāo)志物抗原競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其含有保藏編號(hào)為CGMCC No.5269的抗人原發(fā)性肝癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株AP0105分泌的單克隆抗體以及和待測(cè)樣品中的多肽標(biāo)志物競(jìng)爭(zhēng)的多肽標(biāo)準(zhǔn)品，所述多肽的序列為Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。本發(fā)明所提供的單克隆抗體針對(duì)多肽標(biāo)志物抗原的特異性強(qiáng)；多肽標(biāo)志物抗原的檢測(cè)方法的操作步驟簡(jiǎn)便快捷，利于臨床檢測(cè)；可進(jìn)行高通量、低成本的酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102520175SQ20111035948
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者付海媛, 侯利平, 原劍, 周曉明, 孫云波, 張拓, 楊保安, 王東茂, 甄蓓, 肖漢族, 鄭俊杰, 魏開(kāi)華, 黃亞娟 申請(qǐng)人:北京正旦國(guó)際科技有限責(zé)任公司, 湖南金健藥業(yè)有限責(zé)任公司