專利名稱：酶電化學(xué)生物傳感器檢測水體環(huán)境中酚類化合物的方法
酶電化學(xué)生物傳感器檢測水體環(huán)境中酚類化合物的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物傳感領(lǐng)域，特別是涉及新型氨基酸離子液體改性的介孔碳復(fù)合材料固載酪氨酸酶的電化學(xué)傳感器檢測水體環(huán)境中酚類化合物的方法。
背景技術(shù)：
酚類化合物是環(huán)境中廣泛存在的一類有機污染物，主要來自煉焦、醫(yī)藥、化工等工業(yè)排放及農(nóng)藥降解。飲用水源中的酚類化合物在加氯消毒的水處理工藝中可生成毒性更大、具有“三致”效應(yīng)的氯酚等，從而威脅飲用水安全。
隨著人們對水體環(huán)境安全及身體健康的日益關(guān)注，迫切需要快速判斷地表水及飲用水源的安全狀況。酚類化合物作為水體環(huán)境中的一類重要有機污染物，對人類和動植物有潛在的危害。為了預(yù)防酚類污染物的危害，發(fā)展用于環(huán)境(特別是飲用水、地表水和廢水)中酚類污染物快速、靈敏、可靠、可重復(fù)使用的檢測方法顯得尤為重要。目前對環(huán)境中酚類污染物的篩查檢測通常利用色譜和光譜等方法完成。然而這些儀器通常集中在某些遠離現(xiàn)場的實驗室，不僅儀器價格昂貴，而且通常需要專業(yè)的操作人員和復(fù)雜的樣品預(yù)處理以及萃取步驟，很難滿足水環(huán)境中酚類快速現(xiàn)場檢測的要求。
本發(fā)明所使用的酶電化學(xué)傳感器結(jié)合了酶和電化學(xué)的優(yōu)點，總體來說，包括以下幾個方面的優(yōu)勢1)、選擇性好，酶分子對底物選擇專一性強，具有非常高的特異性識別能力；2)、電化學(xué)響應(yīng)快，靈敏度高；3)、成本低廉，可重復(fù)使用；4)、設(shè)備便攜容易微型化，適合大批量樣品的現(xiàn)場檢測。
酪氨酸酶是一種具有生物催化活性的蛋白質(zhì)，在生物體外容易失去活性，因此目前許多酪氨酸酶傳感器普遍存在一個問題是操作和存儲穩(wěn)定性不夠高。
本發(fā)明使用對酶分子生物相容性較好的固定基底(氨基酸離子液體改性的介孔碳復(fù)合材料)來提供一個有利的微環(huán)境以保持其生物活性和穩(wěn)定性。介孔碳復(fù)合材料改善了單純的介孔碳材料水相分散性差的問題，提高了實驗操作的重現(xiàn)性。介孔碳材料的空間限制效應(yīng)，能夠防止酶分子的去折疊失活，提高了酶的長期穩(wěn)定性和生物催化活性。同時氨基酸離子液體具有很好的生物相容性，為固載的酪氨酸酶分子提供了更加友好的微環(huán)境； 酶分子與導(dǎo)電基底之間由于距離較近而減少了長程電子運輸，利于電化學(xué)換能，提高傳感器的靈敏度；介孔碳多孔的網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)還可以為酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物提供轉(zhuǎn)移的通道， 提高傳感器的響應(yīng)速度。此外，本發(fā)明使用的氨基酸離子液體對含苯環(huán)(通過η電子)和羥基(通過氫鍵)的酚類污染物具有較強的相互作用，可以通過富集效應(yīng)進一步提高檢測的靈敏度。
本發(fā)明提供了一種簡易、快速而靈敏的水體環(huán)境中酚類化合物的檢測方法，不僅提高了酪氨酸酶的存儲穩(wěn)定性，還具有更高的靈敏度和更低的檢測限。儀器設(shè)備選擇性好， 小型廉價，檢測通量大，樣品不需要前處理，適合水體樣品的現(xiàn)場快速檢測。酪氨酸酶傳感器直接應(yīng)用于水體環(huán)境樣品的現(xiàn)場快速檢測，達到經(jīng)濟、靈敏、準確和大批量檢測的目的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于三電極系統(tǒng)的酶電化學(xué)生物傳感器及應(yīng)用其檢測水體環(huán)境中酚類化合物的方法，是能夠用于現(xiàn)場篩查檢測環(huán)境污染物、尤其是水體中酚類化合物的生物傳感器檢測方法。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提高酪氨酸酶電化學(xué)傳感器的長期穩(wěn)定性，并且提供一種應(yīng)用于水體中酚類污染物篩查的基于酪氨酸酶電化學(xué)傳感器的檢測方法，應(yīng)用其對酚類污染物檢測。此檢測方法應(yīng)具有靈敏度高，檢測限低，長期穩(wěn)定性好，步驟簡單，結(jié)果準確可靠，適合大批量樣品現(xiàn)場檢測的特點。
酪氨酸酶傳感器檢測酚類污染物的原理酪氨酸酶能夠利用分子氧催化單酚(或多酚)生成相應(yīng)的鄰苯酚和鄰苯醌，而鄰苯醌又可以在電極表面通過電化學(xué)催化還原生成相應(yīng)的鄰苯酚形成信號循環(huán)放大。通過記錄酪氨酸電化學(xué)傳感器與酚類污染物作用前后的電信號變化可以判斷目標分析物是否存在及其總量。對于單一的目標分析物，該酶基傳感器的信號變化強度與目標分析物的濃度在一定范圍內(nèi)線性相關(guān)。對于水、土壤、食品、空氣、 煙道氣等復(fù)雜的目標樣品，該酶基傳感器能夠快速篩查目標樣品中是否含有酚類化合物。
本發(fā)明將酪氨酸酶分子誘陷到IOnm孔徑的親水介孔碳復(fù)合材料的介孔中。在液相中，親水性的室溫離子液體(BMM[Ala])與疏水性介孔碳材料混勻振蕩半小時得到表面親水改性的介孔碳離子液體復(fù)合材料。親水性離子液體(BMIM[Ala)在液相中對介孔碳表面進行可控的 親水改性，使離子液體在介孔碳表面形成近“單層”或多層的修飾，解決了介孔碳在水相中分散性差的問題；并且IOnm直徑的介孔碳材料提供了“納米籠”微環(huán)境(“空間限制效應(yīng)”)固定酪氨酸酶分子(6. 5nmX9. 8nmX5. 5nm),空間限制效應(yīng)能夠防止酶分子去折疊失活，提高了酶在體外的長期穩(wěn)定性和生物活性。同時酶分子與導(dǎo)電基底之間由于距離較近而減少了長程電子運輸，利于電化學(xué)換能；介孔碳多孔的網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)還可以為酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物提供通過的通道，提高傳感器的響應(yīng)速度和靈敏度。此外，本發(fā)明使用的親水性離子液體(BMIM[Ala)對含苯環(huán)(通過π電子)和羥基(通過氫鍵)的酚類污染物具有較強的相互作用，可以通過富集效應(yīng)進一步提高檢測的靈敏度。
本發(fā)明檢測的水體中酚類污染物通過電化學(xué)檢測前后信號的變化，檢測分析水體環(huán)境中酚類污染物的濃度。目標分析物為實際水體樣品時，可以通過電化學(xué)分析檢測確定樣品中是否含有酚類污染物及其對應(yīng)總濃度。
酪氨酸電化學(xué)傳感器的制備與樣品的檢測過程可以分為以下四個步驟
I)介孔碳材料與室溫離子液體(BMM[Ala])在室溫下超聲震蕩30分鐘。
2)將酪氨酸酶加入到離子液體修飾介孔碳材料的液相溶液中，4°C低溫振蕩一小時。
3)成膜能力和粘著力極好的生物相容性殼聚糖加入到酶分子和介孔碳形成的超分子組裝體溶液中，取4μ L的上述溶液滴加到打磨處理干凈的玻碳電極表面。
4)將待檢測的酚類污染物水溶液滴加到檢測緩沖溶液中，進行電化學(xué)掃描并記錄響應(yīng)信號。
本發(fā)明使用電流信號升高的強度檢測分析酚類化合物濃度Ia為修飾后玻碳電極在空白緩沖溶液中掃描的電流，即背景溶液掃描的電流；ib為酚類污染物溶液滴加到檢測緩沖溶液后掃描的電流為酚類污染物溶液處理前后電流信號變化量。電流信號變化公式如下
w = Ib-Ia
所述的離子液體在水相中對介孔碳表面進行可控的親水改性，使離子液體在介孔碳表面形成近“單層”或多層的修飾；酪氨酸酶被誘陷到離子液體親水改性的介孔碳材料中，利用介孔的“空間限制”效應(yīng)，防止酶分子的去折疊失活；氨基酸離子液體中的氨基酸為酪氨酸酶分子提供了更加友好的微環(huán)境，提高了酪氨酸酶分子的長期穩(wěn)定性。
本發(fā)明采用一種高靈敏度、高選擇性、低檢測限、可靠便攜、具有長期的操作和存儲穩(wěn)定性的酪氨酸酶生物傳感器，進行水體環(huán)境中酚類化合物的檢測。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
I、步驟簡單，穩(wěn)定性好，結(jié)果準確可靠。酪氨酸電化學(xué)傳感器對水體環(huán)境樣品中酚類污染物的檢測不需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，簡化了操作步驟；親水性氨基酸離子液體改性的介孔碳材料作為固定基底，介孔碳提供了一個“納米籠”微環(huán)境(空間限制效應(yīng))防止酶分子的去折疊失活，親水性氨基酸離子液體的生物相容性特征為酶分子提供了更加友好的微環(huán)境，極大提高了酶分子的長期穩(wěn)定性和生物催化活性。
2、靈敏度高，檢測限低。酶分子與導(dǎo)電基底之間由于距離近從而縮短了電子傳輸距離，利于電化學(xué)換能；介孔碳材料多孔的網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)還可以為酶反應(yīng)的底物和產(chǎn)物提供通暢的通道，提高傳感器的響應(yīng)速度和靈敏度；此外生物相容性室溫離子液體對含苯環(huán) (通過η電子)和羥基(通過氫鍵)的酚類化合物具有非常強的相互作用，可以通過富集效應(yīng)進一步提聞檢測的靈敏度。
3、便捷容易微型化、快速高通量篩查酚類污染物。檢測設(shè)備由一個微型化的電化學(xué)工作站、一個三電極體系以及一個檢測池組成，設(shè)備簡單，易于攜帶，適合野外現(xiàn)場檢測。 可以用來檢測實際水體樣品中是否含有酚類污染物。


圖I為本發(fā)明方法中酪氨酸酶電化學(xué)傳感器組裝過程示意圖。
圖2A)為本發(fā)明合成的IOnm直徑的二氧化硅球透射電鏡(TEM)圖，B)為IOnm孔徑的介孔碳TEM圖。
圖3A)為IOnm介孔碳的掃描電鏡(SEM)圖，B)為氨基酸離子液體改性修飾的介孔碳復(fù)合材料的SEM圖。
圖4為本發(fā)明方法實施例I中監(jiān)測酪氨酸酶與玻碳電極組裝過程，圖中a為未修飾的玻碳電極在50mmol L-1 PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安(CV)曲線,b酪氨酸酶修飾的玻碳電極的CV曲線。
圖5A)為酪氨酸酶修飾電極在PBS溶液中不同掃速下掃描曲線，自上到下為100、 90、80、70、60、50、40、30、20、10mV/s ；B)為掃描速度與電信號線性相關(guān)曲線。
圖6A)為本發(fā)明方法實施例2的兒茶酚、苯酚和壬基酚濃度與電信號關(guān)系的曲線； B)為濃度與電流信號線性相關(guān)曲線。
具體實施方式
本發(fā)明所述的生物傳感器檢測裝置包括工作電極、輔助電極、參比電極、檢測池和電化學(xué)工作站；具體操作步驟將親水性離子液體(例如，I- 丁基-3-甲基咪唑丙氨酸， BMIMtAla])加入介孔碳溶液中，振蕩半小時，得到新型的介孔碳和親水性離子液體的復(fù)合材料；將酪氨酸酶加入到介孔碳和親水性離子液體的復(fù)合材料溶液中，振蕩一小時，滴加到工作電極表面得到固載酪氨酸酶的工作電極；將固載酪氨酸酶的工作電極、輔助電極和參比電極插入到盛有磷酸緩沖液的檢測池中，在攪拌的條件下加入酚類化合物的單一標準品，即產(chǎn)生了相應(yīng)的電流響應(yīng)信號。與現(xiàn)有的檢測酚類污染物的生物傳感器相比，該方法主要優(yōu)點是1.靈敏度高，介孔碳離子液體復(fù)合材料大大提高了工作電極的導(dǎo)電性，增大了響應(yīng)電流；2.選擇性好，酪氨酸酶對酚類化合物等底物有很好的選擇性；3.性能穩(wěn)定，酶分子與介孔碳孔徑大小相匹配，空間限制效應(yīng)防止酶分子四級結(jié)構(gòu)改變而失活；生物相容性離子液體對介孔碳改性，提高了酶的活性及長期穩(wěn)定性；4.儀器設(shè)備小型廉價，檢測通量大，樣品前處理簡單，適合現(xiàn)場快速篩查檢測。此方法不但可以對苯酚等單一酚類樣品進行定量檢測，而且可以快速篩查實際樣品中是否含有酚類化合物，并對實際樣品中酚類化合物總量進行評估。
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
以下是部分本發(fā)明實施例中所用的儀器和設(shè)備，其它未具體注明的實驗條件，按照常規(guī)或儀器制造廠建議的條件。
紅外光譜所用儀器為傅立葉變換紅外光譜儀(Spectrum GX, Perkin-Elmer, USA)。紅外光譜測量條件光源為紫外和可見燈，掃描范圍為^OlOOOcnT1。電化學(xué)檢測所用儀器為上海辰華電化學(xué)工作站CHI440，三電極體系。酪氨酸酶(菌菇)購于 Sigma-aldrich (China)。
實施例I.酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器組裝
玻碳電極組裝步驟
I)直徑為O. 3cm的玻碳電極用粒徑分別為I μ m、O. 3 μ m、O. 05 μ m的三氧化二鋁粉末拋光，然后在去離子水中超聲清洗3次，每次2分鐘。放入2mmo I L—1的鐵氰化鉀溶液中在-O. 1-0. 6V之間掃描循環(huán)伏安曲線。該曲線氧化還原峰電位差小于75mV,說明玻碳電極表面的鐵氰化鉀反應(yīng)屬于完全可逆反應(yīng)，電極表面沒有雜質(zhì)。
2)酪氨酸酶介孔碳材料的超分子自組裝體的構(gòu)建。利用溶膠-凝膠法制備的單分散硅膠球作為硬模板，以聚苯乙烯為碳源，經(jīng)氮氣氣氛下的高溫催化碳化，去除模板等步驟后，獲得一定孔徑的有序介孔碳。具體合成步驟=IOOmL的三頸燒瓶中加入O. 0292g L-Iys, 27. SmL去離子水以及4mL的正硅酸乙酯，體系在70°C下磁力攪拌反應(yīng)12小時，于80°C緩慢蒸干溶劑得到IOnm納米硅球。在石英研缽中研細上述硅球，然后向硅球中加入3mL O. 024g mL—1的Ni (NO3)2 · 6H20的乙醇水溶液(Vill V水=1:1)，最終使Ni與Si的摩爾比為 I 34。然后將浸潰過Ni (NO3)2 ·6Η20的SiO2模板在80°C烘箱中干燥后在紅外壓片機上壓成后Imm的薄片(壓力6Mpa)。向IOmL新鮮蒸懼的苯乙烯單體中滴加O. 05mL濃硫酸,使苯乙烯初步聚合；取Ig浸潰Ni (NO3)2的SiO2模板于25mL坩堝中，加入5mL初步聚合的苯乙烯，160°C預(yù)碳化24h，然后將Si02/C的復(fù)合物移入管式爐中，高純氮氣保護下升溫至850°C 熱解3h，升溫速率5°C /min。熱解結(jié)束后將復(fù)合物冷卻至室溫，在20% HF溶液中攪拌12h 除去SiO2，過濾、洗滌后干燥，得到孔徑為IOnm的介孔碳。通過調(diào)整正硅酸乙酯的濃度和反應(yīng)時間，可以得到不同粒徑的硅球。以不同粒徑的硅球為模板，最終制得不同粒徑的介孔碳。將合成的介孔碳材料加入到等體積的相同質(zhì)量濃度的BMIM[Ala]的水溶液中，超聲震蕩30分鐘，利用含咪唑陽離子的氨基酸離子液體與介孔碳之間固有的強相互作用(包括咪唑陽離子與介孔碳電子間的強相互作用、氫鍵、親疏水、靜電作用等)，在液相中對介孔碳表面進行可控的親水改性，使其在介孔碳表面形成近單層或多層修飾，可以獲得離子液體功能化的介孔碳復(fù)合材料。20 μ L O. 8mg ι Γ1水溶性的改性有序介孔碳溶液中加入10 μ L酪氨酸酶溶液(IOmg低溫振蕩I小時，通過液相自組裝將酶分子誘陷到介孔碳的介孔中形成超分子自組裝體(O. 4mg ml/1介孔碳、O. 4mg mL_1BMIM[Ala]以及5mg ml/1酪氨酸酶)。
3) 10 μ L成膜能力和粘著力極好的生物相容性殼聚糖(6mg ml/1)加入到30 μ L超分子自組裝體中輔助固載，4yL上述溶液加入到玻碳電極表面，室溫下(25°C)干燥2小時，得到均一性薄膜。
4)將修飾后的玻碳電極放入50mmo I Γ1 PBS溶液中攪拌15分鐘，去除表面吸附力弱的酶分子，在50mmo I Γ1 PBS溶液中以 10、20、30、40、50、60、70、80、90、IOOmV s-1 十個不同的掃速掃描，得出掃描速度與信號強度成線性相關(guān)，此反應(yīng)屬于電極表面控制反應(yīng)。
5)將氨基酸離子液體修飾介孔碳復(fù)合材料固定的酪氨酸酶電極與介孔碳固定的酪氨酸酶電極放入磷酸緩沖溶液中進行電化學(xué)循環(huán)伏安掃描，得到循環(huán)伏安曲線a和b ;放置3周以后,在50mmol L—1 PBS中對介孔碳復(fù)合材料固定的酪氨酸酶電極與介孔碳固定的酪氨酸酶電極進行電化學(xué)循環(huán)伏安掃描，得到循環(huán)伏安曲線c和d ;分別計算兩根修飾電極的循環(huán)伏安曲線峰電流的下降百分比(a_c/a*100%和b_d/b*100% )，得到介孔碳復(fù)合材料固定的酪氨酸酶電極在放置三周后僅僅下降了 2%，然而介孔碳固定的酪氨酸酶電極在放置三周后峰電流下降了 11%。說明了氨基酸離子液體改善了介孔碳材料的生物相容性， 提高了酪氨酸酶分子的長期穩(wěn)定性。
實施例2.酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測兒茶酚、苯酚及壬基酚的標準溶液
分別將兒茶酚、苯酚和壬基酚溶于乙腈溶液中，配成Immol Γ1的標準溶液。
采用上海辰華電化學(xué)工作站(Chi 440B)在-O. IV恒電位條件下掃描電流與時間的曲線，以40s為間隔向8mL 50mmol L—1磷酸緩沖溶液中滴加4μ L lmmol L—1的兒茶酚標準溶液，得到電流信號與時間之間的相關(guān)曲線。將酪氨酸酶電化學(xué)傳感器在空白檢測溶液 (50mmol L—1磷酸緩沖液)中掃描記錄的響應(yīng)信號記為Ia，將兒茶酚標準溶液加入空白檢測溶液中得到的響應(yīng)信號記錄為Ib;以兒茶酚濃度(c)為橫坐標，其對應(yīng)產(chǎn)生的電流信號強度(Ib-Ia)為縱坐標，繪制出兒茶酚濃度與電流信號強度的線性相關(guān)曲線；從圖6中可以看出，隨著兒茶酚濃度的升高，電流信號逐步增強，信號變化強度與兒茶酚的濃度成線性相關(guān)。
兒茶酚作為酪氨酸酶的天然底物，在氧氣存在情況下，酪氨酸酶催化兒茶酚生成相應(yīng)的醌類化合物，而醌類化合物又可以在電極表面通過電化學(xué)催化還原生成兒茶酚，形成信號循環(huán)放大。隨著兒茶酚濃度的升高，電流信號逐步增強，電流信號的增加量與兒茶酚的濃度在一定范圍內(nèi)線性相關(guān)。苯酚和壬基酚采用與兒茶酚相同的實驗檢測過程進行檢測。結(jié)果顯示酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器對苯酚和壬基酚產(chǎn)生了比天然底物(兒茶酚)弱的電流信號。隨著苯酚和壬基酚濃度的升高，電流信號強度逐步增加。酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器對兒茶酚、苯酚和壬基酚等酚類污染物都可以產(chǎn)生明顯的電化學(xué)響應(yīng)信號變化，因此可以用來檢測樣品中是否含有兒茶酚、苯酚、壬基酚等酚類污染物。通過檢測酪氨酸酶電化學(xué)傳感器的電流上升量(Ib-Ia)來確定檢測樣品中是否含有酚類化合物；當電流上升量(Ib-Ia)大于O. 13微安時(三倍信噪比)被認為含有酚類化合物；當電流上升量(Ib-Ia) 小于O. 13時，被認為不含有酚類化合物；將電流上升量(Ib-Ia)帶入繪制的苯酚線性相關(guān)曲線(圖6)中，通過對比可以得到檢測樣品中總的酚類化合物的濃度相對于苯酚的濃度。
實施例3.酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器潛在干擾物的檢測
將下列化合物溶于乙腈中，配成IOOmmol Γ1的溶液，用酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器記錄電信號變化；檢測化合物分別為酒石酸、檸檬酸鈉、草酸鈉、尿素、乙酸乙酯、碳酸二乙酯以及葡萄糖等。上述化合物的檢測過程與兒茶酚檢測過程相同。
乙酸乙酯等化合物不是酪氨酸酶的特異性底物，產(chǎn)生的電流信號變化強度(W)小于O. 13微安(三倍信噪比)，即沒有檢出。兒茶酚等酚類化合物作為酪氨酸酶的反應(yīng)底物， 引起了酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號變化量遠遠大于O. 13微安，即明顯檢出；因此可以使用酪氨酸酶電化學(xué)傳感器檢測環(huán)境中存在的酚類污染物；并且可以通過電化學(xué)信號變化強度的大小，來檢測分析待測溶液中酚類污染物的濃度。
酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器能夠明顯的區(qū)別干擾物和酚類化合物的響應(yīng)信號，因此可以用來檢測分析大批量的環(huán)境樣品。酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器不但可以實現(xiàn)對單一酚類樣品的定量檢測，而且可以實現(xiàn)對復(fù)雜樣品的快速檢測以及總的酚類化合物的含量檢測分析，此外該傳感器檢測方法還具有色譜方法所不具備的一些優(yōu)勢(例如，快速、便攜、 廉價、不需要復(fù)雜樣品的預(yù)處理和萃取步驟等)。酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器為環(huán)境中酚類污染物的快速現(xiàn)場檢測分析提供了一個有力的支持。
權(quán)利要求
1.酶電化學(xué)生物傳感器檢測水體環(huán)境中酚類化合物的方法，其基于三電極系統(tǒng)，該方法包括以下步驟a).有序介孔碳材料的制備取l-5g直徑為5-50nm的納米硅球(SiO2)，隨后向SiO2中加入3mL0. 024g mL—1的 Ni (NO3)2 · 6H20的乙醇水溶液(V [醇:V水=I : I);浸潰過Ni (NO3)2 · 6H20的SiO2在烘箱中干燥，然后將干燥后的SiO2在壓片機上壓成薄片；向IOmL苯乙烯單體中加入150 μ L濃硫酸(質(zhì)量濃度98% )酸化處理10-30分鐘；將 IOmL酸化后的苯乙烯滴加至Ij l_5g浸潰過Ni (NO3)2 · 6H20的SiO2薄片上，120-200°C下反應(yīng)，然后將苯乙烯和SiO2的復(fù)合物移入管式爐中，在高純惰性氣體(氮氣或氬氣等氣體)保護下升溫至750-950°C熱解2-5h ;將熱解產(chǎn)物加入質(zhì)量濃度為15-30% HF溶液中攪拌去除 SiO2模板，過濾得到孔徑為5-50nm的介孔碳；b).有序介孔碳的表面改性和功能化將O. 2-0. 8mg介孔碳材料加入到ImL O. 56mg mL—1親水性離子液體中超聲振蕩；利用含咪唑陽離子的親水離子液體與介孔碳之間固有的強相互作用，使離子液體在介孔碳表面形成近單層或多層修飾，可以獲得親水性離子液體功能化的介孔碳復(fù)合材料；c).酶生物傳感器的構(gòu)建在親水性離子液體功能化的介孔碳復(fù)合材料溶液中加入等體積的2. 5-20mg ml/1的酶溶液，4°C低溫振蕩O. 5-3小時，通過介孔材料的虹吸作用將酶分子誘陷到介孔碳的介孔中形成超分子自組裝體，然后取3-10 μ L的超分子自組裝體溶液滴加到電極表面，得到酶修飾電極；d).將c)中所述的酶修飾電極作為工作電極放入空白檢測溶液(SOmmoir1磷酸緩沖液)中，進行電化學(xué)掃描并記錄響應(yīng)信號Ia，將酚類化合物作為目標分析物加入到空白檢測溶液中，進行電化學(xué)掃描并記錄響應(yīng)信號Ib ;隨著加入酚類目標物濃度的升高，酶生物傳感器產(chǎn)生的電流信號逐漸增強，并且在O.5-10 μ mo I I/1范圍內(nèi)線性相關(guān)；以酚類目標分析物濃度(c)為橫坐標，其對應(yīng)產(chǎn)生的電流信號強度(Ib-Ia)為縱坐標，繪制出酚類目標物濃度與電流信號強度的線性相關(guān)曲線；e).將含有酚類化合物的檢測樣品加入到c)中所述的酶修飾電極的空白檢測溶液中， 進行電化學(xué)掃描并記錄響應(yīng)信號Ib，并將其產(chǎn)生的電流上升量(Ib-Ia)帶入線性相關(guān)曲線中就可以評估出檢測樣品中酚類化合物的濃度。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所采用的電化學(xué)裝置的參比電極為銀/氯化銀電極，對電極為鉬絲電極，工作電極是玻碳電極、金電極、鉬電極或碳糊電極，優(yōu)選玻碳電極。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的酶為反應(yīng)底物為酚類化合物的酶，為酪氨酸酶或漆酶，優(yōu)選酪氨酸酶；步驟I. d)所述的目標分析物酚類化合物包括兒茶酚、苯酚、壬基酚和雙酚A中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于5-50nm直徑的納米硅球的制備過程將O. 2mmoL賴氨酸和4mL正硅酸乙酯加入30mL水溶液中，在50-901溫度范圍內(nèi)磁力攪拌反應(yīng)；反應(yīng)完成后，80-100 0C緩慢蒸干溶劑，即得到5-50nm直徑的納米硅球。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(a)所述的介孔碳孔徑大小為550nm， 優(yōu)選10nm。
6.如權(quán)利要求I)所述的方法，其特征在于步驟(b)所述的超分子組裝體中的介孔碳疏水內(nèi)表面由生物相容性親水離子液體修飾；所述的親水性離子液體陽離子通常是咪唑基團，陰離子基團通常是四氟硼或者氨基酸等，優(yōu)選I-丁基-3-甲基咪唑丙氨酸離子液體(BMM[Ala])。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的檢測樣品通過酶電化學(xué)傳感器檢測的電流上升量(Ib-Ia)來確定檢測樣品中是否含有酚類化合物；當電流上升量(Ib-Ia)大于O. 13微安時(三倍信噪比)被認為含有酚類化合物；當電流上升量(Ib-Ia)小于O. 13時，被認為不含有酚類化合物；將電流上升量 (Ib-Ia)帶入Id)中繪制的酚類目標物線性相關(guān)曲線，通過對比可以得到檢測樣品中酚類化合物的濃度。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于將步驟c)中所述形成超分子自組裝體進行如下操作，10 μ L 6mg mL-1殼聚糖加入到30 μ L超分子自組裝體中輔助固載，然后取 3-10 μ L的超分子自組裝體溶液滴加到電極表面，得到酶修飾電極。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶電化學(xué)生物傳感器檢測水體環(huán)境中酚類化合物的方法。所述生物傳感器檢測裝置包括工作電極、輔助電極、參比電極、檢測池和電化學(xué)工作站；具體操作步驟將親水性離子液體(例如，1-丁基-3-甲基咪唑丙氨酸，BMIM[Ala])加入介孔碳溶液中，振蕩半小時，得到新型的介孔碳和親水性離子液體的復(fù)合材料；將酪氨酸酶加入到介孔碳和親水性離子液體的復(fù)合材料溶液中，振蕩一小時，滴加到工作電極表面得到固載酪氨酸酶的工作電極；將固載酪氨酸酶的工作電極、輔助電極和參比電極插入到盛有磷酸緩沖液的檢測池中，在攪拌的條件下加入酚類化合物的單一標準品，即產(chǎn)生了相應(yīng)的電流響應(yīng)信號。
文檔編號G01N27/327GK102928488SQ201110377608
公開日2013年2月13日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者吳立冬, 盧憲波, 蘇凡, 陳吉平 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所