專利名稱：一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒以其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及的體外試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒以其制備方法。
背景技術(shù)：
:動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)性血管疾病已成為威脅國人健康的"頭號殺手"，隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，我國每年用于該類疾病的醫(yī)療費用高達千億元人民幣，加強AS性血管疾病及其并發(fā)癥的防治已成為我國重大疾病防治的主要任務(wù)。AS性血管疾病引發(fā)的急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是臨床最常見和最嚴重的表現(xiàn)，而冠脈易損斑塊破裂繼發(fā)血栓形成是其發(fā)生的最主要病理基礎(chǔ)。目前作為冠心病診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的冠狀動脈造影并不能很好的識別易損斑塊，易損斑塊的識別和診斷主要依賴于血管內(nèi)超聲及血管鏡等介入影像學(xué)手段，可以顯示血管壁的病變，精確地區(qū)別病變的性質(zhì)來識別易損斑塊，但卻不能檢測斑塊中的炎癥活性，更由于其為有創(chuàng)性檢查，技術(shù)條件要求高且費用較昂貴，限制了它的推廣應(yīng)用。因此，尋找能反映AS易損斑塊敏感而特異性的血清學(xué)標(biāo)志物，并通過有效干預(yù)，在易損斑塊破裂前，早期將其識別并使之趨向穩(wěn)定，有望達到減少ACS發(fā)生的目的。但現(xiàn)有的診斷試劑盒多集中于借助外周血清標(biāo)志物提高對ACS的診斷敏感性和特異性方面，在改善患者的危險分層和預(yù)后判斷方面的相關(guān)試劑盒還是一個空白，而這方面恰恰是目前臨床患者管理所急需的。液相芯片技術(shù)(xMAP)也稱為流式熒光技術(shù)，是一種可廣泛應(yīng)用于蛋白、基因、受體/配體等多種生物反應(yīng)的生物芯片技術(shù)平臺，主要包括微球、探針分子、被檢測物和報告分子四種成分，其微球在制作過程中使用不同配比的兩種紅色分類熒光染料將微球(微球分為直徑為5.6 μ m的聚苯乙烯微球和6.5 μ m的磁性微球,兩種微球主要在后期的洗漆和適用的儀器有所不同，原理一致)染成不同的熒光色，從而獲得多達100種熒光編碼的微球。把針對不同待測物的抗體分子或者基因探針以共價交聯(lián)的方式結(jié)合到特定的編碼微球上，每個編碼微球都對應(yīng)相應(yīng)的檢測項目。先把針對不同待測物的熒光編碼微球混合，然后加入待測物質(zhì)或者待測的擴增片段，所形成的復(fù)合物再與標(biāo)記熒光素發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。微球在流動鞘液的帶動下單列依次通過紅綠激光，紅激光用來判定微球的熒光編碼，綠激光用來測定微球上報告分子的熒光強度。從而達到快速準(zhǔn)確的定量檢測目的。由于所有反應(yīng)均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)想，使探針和被檢測物的反應(yīng)更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種改進的用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒以其制備方法，它可克服現(xiàn)有技術(shù)中診斷試劑盒多集中于借助外周血清標(biāo)志物提高對ACS的診斷敏感性和特異性方面，在改善患者的危險分層和預(yù)后判斷方面的相關(guān)試劑盒還是一個空白，同時現(xiàn)有試劑盒的制備方法復(fù)雜、穩(wěn)定性差、應(yīng)用效果不佳的一些不足。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒，其特征在于:所述的液相芯片試劑盒包括有以下組分:I)包被微球:微球主要包括兩類,一種直徑為5.6μηι的聚苯乙烯微球和另一種6.5 μ m的磁性微球，上述兩類微球分別包被了 ox-LDL捕獲抗體的微球、包被了 s⑶40L捕獲抗體的微球、包被了 MMP-9捕獲抗體的微球、包被了 TF捕獲抗體的微球、包被了 omentin捕獲抗體的微球和包被了 esRAGE捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；2)生物素標(biāo)記檢測抗體:含有分別用生物素標(biāo)記的ox-LDL、s⑶40L、MMP_9、TF、omentin及esRAGE的檢測抗體；3)鏈親合素藻紅蛋白。一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于:所述的制備方法包括有如下步驟:I)按照上述試劑盒的組成，制備相應(yīng)的抗體包被微球:分別選取不同的微球，經(jīng)渦旋或超聲懸浮20-25秒；將50 μ I微球活化后，離心條件為彡8000g,離心1-2分鐘；吸去上清，將微球重懸于250 μ I 50mM的MES的溶液中，渦旋25_30秒，超聲25-30秒，離心收集活化后的微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘；重復(fù)該步驟一次；吸去上清，將微球重懸于100 μ I 50mM的MES的溶液中，渦旋25_30秒，超聲25-30秒，加入I μ g的抗體，用50mM的MES的溶液將總體積補至500 μ I ;經(jīng)渦旋震蕩混勻，室溫避光振蕩3小時；離心收集偶聯(lián)抗體的微球，離心條件為> 8000g，離心2-3分鐘；吸去上清，將微球重懸于500 μ 1的PBS-TBN溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，室溫避光震蕩30分鐘，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘；吸去上清，將微球重懸于Iml的PBS-TBN溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘重復(fù)該步驟一次；吸去上清，將微球重懸于600 μ I的PBS-TBN溶液中，將包被好的微球送往Luminex儀器或流式細胞儀計數(shù)；包被好抗體的微球置于2-8度避光保存，每種抗體偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，根據(jù)檢測項目選擇等比例混合。2)進行每種檢測抗體的生物素標(biāo)記:依據(jù)蛋白濃度計算反應(yīng)體系:計算將抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，為目標(biāo)體積(V)，配制NHS-Biotin反應(yīng)液(用DMSO溶解，終濃度為10mg/ml);按摩爾比I: 100的比例在反應(yīng)管中分別加入檢測抗體和N-Biotin反應(yīng)液；加入1/10V的碳酸氫鈉溶液(pH8.9)；加入PBS溶液補至目標(biāo)體積；包上鋁箔或放入避光暗盒中，將反應(yīng)管或避光暗盒置于圓周震蕩器上，于25度恒溫箱中避光孵育5小時，轉(zhuǎn)速為IOOOrpm ；將反應(yīng)管中的液體轉(zhuǎn)至透析卡中，于1000倍體積的PBS緩沖液中透析過夜兩次，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin，測定蛋白濃度。
使用時，本發(fā)明的所公開的液相芯片試劑盒可以同時完成多種血清標(biāo)志物的定量檢測，從而達到對急性冠脈綜合患者的危險分層和預(yù)后判斷，還具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點，同時檢測的血清標(biāo)志物以ox-LDL、TF、s⑶40L為核心，通過與剩余的esRAGE、MMP-9和omentin進行不同搭配,可實現(xiàn)從損傷和修復(fù)兩個角度全面綜合評估患者的預(yù)后情況。同時本發(fā)明的制備方法簡單易行，穩(wěn)定性好，其技術(shù)方案中的各種工藝參數(shù)如微球和抗體的量、反應(yīng)過程等均是在大量實驗基礎(chǔ)上得出的，為制備過程最佳的參數(shù)值。


圖1為本發(fā)明正常對照人群和ACS患者外周血ox-LDL水平(μ g/ml)的對照表。
圖2為本發(fā)明正常對照人群和ACS患者外周血s⑶40L水平(ng/ml)的對照表。
圖3為本發(fā)明正常對照人群和ACS患者外周血TF水平(ng/ml)的對照表。
圖4為本發(fā)明正常對照人群和ACS患者外周血MMP-9水平(ng/ml)的對照表。
圖5為本發(fā)明正常對照人群和ACS患者外周血omentin水平(ng/ml)的對照表。
圖6為本發(fā)明正常對照人群和ACS患者外周血esRAGE水平(ng/ml)的對照表。
圖7為本發(fā)明依據(jù)血清標(biāo)志物進行ACS患者的危險分層的圖表。
具體實施方式
:下面結(jié)合圖表和實施例對本發(fā)明作進一步的描述。本發(fā)明的一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒，其特征在于:所述的液相芯片試劑盒包括有以下組分:I)包被微球:微球主要包括兩類,一種直徑為5.6μηι的聚苯乙烯微球和另一種
6.5 μ m的磁性微球，上述兩類微球分別包被了 ox-LDL捕獲抗體的微球、包被了 s⑶40L捕獲抗體的微球、包被了 MMP-9捕獲抗體的微球、包被了 TF捕獲抗體的微球、包被了 omentin捕獲抗體的微球和包被了 esRAGE捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；2)生物素標(biāo)記檢測抗體:含有分別用生物素標(biāo)記的ox-LDL、s⑶40L、MMP_9、TF、omentin及esRAGE的檢測抗體；3)鏈親合素藻紅蛋白。每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為120-130個/ μ I ;每種生物素標(biāo)記檢測抗體的使用濃度為1-4 μ g/ml ο一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于:所述的制備方法包括有如下步驟:I)按照上述試劑盒的組成，制備相應(yīng)的抗體包被微球:分別選取不同的微球，經(jīng)渦旋或超聲懸浮20-25秒；將50 μ I微球活化后，離心條件為彡8000g,離心1-2分鐘；吸去上清，將微球重懸于250 μ I 50mM的MES的溶液中，渦旋25_30秒，超聲25_30秒，離心收集活化后的微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘；重復(fù)該步驟一次；吸去上清，將微球重懸于100 μ I 50mM的MES的溶液中，渦旋25_30秒，超聲25_30秒，加入I μ g的抗體，用50mM的MES的溶液將總體積補至500 μ I ;經(jīng)渦旋震蕩混勻，室溫避光振蕩3小時；
離心收集偶聯(lián)抗體的微球，離心條件為> 8000g，離心2-3分鐘；吸去上清，將微球重懸于500 μ I的PBS-TBN溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，室溫避光震蕩30分鐘，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘；吸去上清，將微球重懸于Iml的PBS-TBN溶液中，渦旋25_30秒，超聲25_30秒，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘重復(fù)該步驟一次；吸去上清，將微球重懸于600 μ 1的PBS-TBN溶液中，將包被好的微球送往Luminex儀器或流式細胞儀計數(shù)；包被好抗體的微球置于2-8度避光保存，每種抗體偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，根據(jù)檢測項目選擇等比例混合。2)進行每種檢測抗體的生物素標(biāo)記:依據(jù)蛋白濃度計算反應(yīng)體系:計算將抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，為目標(biāo)體積(V)，配制NHS-Biotin反應(yīng)液(用DMSO溶解，終濃度為10mg/ml);按摩爾比I: 100的比例在反應(yīng)管中分別加入檢測抗體和N-Biotin反應(yīng)液；加入1/10V的碳酸氫鈉溶液(pH8.9)；加入PBS溶液補至目標(biāo)體積；包上鋁箔或放入避光暗盒中，將反應(yīng)管或避光暗盒置于圓周震蕩器上，于25度恒溫箱中避光孵育5小時，轉(zhuǎn)速為1000rpm ；將反應(yīng)管中的液體轉(zhuǎn)至透析卡中，于1000倍體積的PBS緩沖液中透析過夜兩次，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin，測定蛋白濃度。所述活化微球的步驟如下:用渦旋振蕩器或者超聲波懸浮微球；取50 μ I微球離心收集沉淀，離心條件為彡8000g,離心1-2分鐘；去掉上清液，將微球懸于100 μ I的雙蒸水中，用潤旋振蕩器或者超聲波懸浮微球20-25秒，離心收集沉淀，離心條件為彡8000g，離心1-2分鐘；吸棄上清，加入80 μ I的磷酸鹽緩沖液(ρΗ6.2)，渦旋振蕩20_25秒，超聲波懸浮微球20-25秒； 加入10 μ 1 50mg/ml的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(S-NHS)，用渦旋振蕩器輕輕地混勻；加入10μ1 50mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙級)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，用渦旋振蕩器輕輕地混勻；室溫避光靜置20min，每10分鐘使用渦旋振蕩器輕輕地混勻。各種溶液的配方如下:50mM的MES緩沖液，pH5.0, 500ml配方如下:將購自Sigma公司的MES4.88g溶于450ml雙蒸水中，加入事先配置好的0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0,經(jīng)0.22 μ m無菌濾器過濾后，4度冰箱備用；PBS配方:將購自Takara公司的PBS片劑10片，溶于IOOOml雙蒸餾水中，再加入NaCl 8, 000mg, KCl 200mg, Na2HPO4 1150mg, KH2PO4 200mg，高壓滅菌后常溫備用。PBS-TBN配方，pH為7.4,將購自Amresco公司的BSAlg,購自Sigma公司的Tween-20,0.2ml和疊氮鈉500mg,溶于購自takara公司的IL配好的PBS溶液,攪拌混勻。不同的微球指分別包被了ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin 及 esRAGE 捕獲抗體的不同微球，上述不同的微球購置于美國Luminex公司。本發(fā)明根據(jù)大量的文獻資料結(jié)合之前對三十多種血清標(biāo)志物的篩選，從中確定了ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin和esRAGE這六種有助于ACS患者危險分層和預(yù)后判斷的血清生物標(biāo)志物，利用液相芯片平臺進行這六種指標(biāo)的同步并行檢測。ox-LDL、sCD40L、MMP-9和TF是與ACS病程密切相關(guān)的幾個介導(dǎo)血管損傷的血清生物學(xué)標(biāo)志物，Omentin和esRAGE是近期新發(fā)現(xiàn)的兩種介導(dǎo)保護作用的因子，大量研究表明其與ACS患者的血管病變的嚴重程度呈負相關(guān)，但現(xiàn)有的研究多采用上述的一種或兩種因子進行相關(guān)實驗，對于ACS患者的整體情況缺乏一個全方面的了解，因此我們擬采用上述因子聯(lián)合應(yīng)用于ACS患者的危險分層和臨床預(yù)后判斷，其中ox-LDL、sra40L、MMP-9和TF用于評估患者受致病因素的損傷情況，Omentin和esRAGE用于患者內(nèi)在的自我保護機制激活情況，兩者可以根據(jù)實際情況進行相互組合進行應(yīng)用。目前，對于上述血清標(biāo)志物的測定已有多種檢測方法，包括免疫熒光分析、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)等，但這些技術(shù)一次只能針對一個標(biāo)志物進行檢測，且操作繁瑣、敏感度各異，不能真正滿足臨床的需要，此外由于各種血清標(biāo)志物在ACS的病程中有不同的表達，上述問題使得各個指標(biāo)在ACS患者的危險分層和預(yù)后判斷中的價值各異，若能同時檢測，則能大幅度提高ACS患者危險分層和預(yù)后判斷的準(zhǔn)確度。而固相生物芯片技術(shù)存在著重復(fù)性差、敏感度不高及操作繁瑣的缺點。實施例1急性冠脈綜合征患者危險分層和預(yù)后判斷的液相芯片的制備及抗原的檢測本發(fā)明所述的捕獲抗體為分別能對應(yīng)與ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE特異性結(jié)合的單克隆抗體；所述的檢測抗體為分別能與OX-LDL、Sra40L、MMP_9、TF、omentin及esRAGE特異性結(jié)合的單克隆或多克隆抗體。本實施例中所用的“ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin 及 esRAGE” 的捕獲抗體與檢測抗體分別購自Abeam、Santa cruz、Invitrogen和Millipore公司。不同編號的微球(表面羧基修飾)、鏈霉親和素-藻紅蛋白均購置于美國Luminex公司。EDC、S-NHS 和 S-NHS-Biotin 均購置于 Pierce 公司。本實施例中，所述各種溶液的配方如下:l、50mM的MES緩沖液(ρΗ5.0)配方(500ml):將購自Sigma公司的MES(貨號為M5287)4.88g溶于450ml雙蒸水中，加入事先配置好的0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至
5.0，經(jīng)0.22 μ m無菌濾器過濾后，4度冰箱備用。2、PBS配方:將購自Takara公司的PBS片劑(貨號T900) 10片，溶于1000ml雙蒸餾水中(NaCl 8，OOOmg, KCl 200mg, Na2HPO41150mg, KH2PO4 200mg)，高壓滅菌后常溫備用。3、PBS-TBN 配方(即 PBS 中含有 0.1 % 的 BSA，0.02 % 的 Tween_20，0.05 % 的疊氮鈉，pH為7.4),將購自Amresco公司的BSA(貨號為0903) Ig,購自Sigma公司的Tween-20 (貨號為P2287)0.2ml和疊氮鈉500mg(貨號為S8032)，溶于IL實現(xiàn)配好的PBS溶液(購自takara公司，貨號T900)攪拌混勻。4、急性冠脈綜合征患者危險分層和預(yù)后判斷的液相芯片試劑盒，包括有:1)包被微球:含有分別包被了 ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE捕獲抗體的不同微球；2)生物素標(biāo)記檢測抗體:含有分別用生物素標(biāo)記的ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE的檢測抗體；3)鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE，10 μ g/ml) ；4)配套的分析緩沖液；5)微球標(biāo)準(zhǔn)品；6)質(zhì)控液一 ；7)質(zhì)控液二 ；8)血清基質(zhì)液；9)封口膜；10)濾板。5、制備上述液相芯片試劑盒，包括有如下步驟:I)按照上述試劑盒的組成，制備抗體包被微球，(每種捕獲抗體包被微球的制備方法相同):分別選取不同的微球(購置于美國Luminex公司)，經(jīng)潤旋或超聲懸浮20_25秒；取50 μ I微球于1.5ml離心管中，離心條件為彡8000g，離心1-2分鐘；吸去上清液，將微球重懸于100 μ I的雙蒸水中，用渦旋或超聲懸浮20-25秒，離心收集沉淀，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘；先后加入各10 μ I 50mg/ml的S-NHS和EDC，經(jīng)渦旋混勻；室溫避光靜置25-30分鐘，每10分鐘使用渦旋混勻一次；離心收集活化后的微球，離心條件為彡8000g,離心1-2分鐘；吸去上清，將微球重懸于250 μ I 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，離心收集活化后的微球，離心條件為> 8000g,離心1-2分鐘；重復(fù)該步驟一次；吸去上清，將微球重懸于100 μ I 50mM的MES (pH5.0)的溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，加入I μ g的抗體，用50mM的MES (pH5.0)的溶液將總體積補至500 μ I ;經(jīng)渦旋震蕩混勻，室溫避光 振蕩3小時；離心收集偶聯(lián)抗體的微球，離心條件為> 8000g，離心2-3分鐘；吸去上清，將微球重懸于500 μ I的PBS-TBN溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，室溫避光震蕩30分鐘，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘；吸去上清，將微球重懸于Iml的PBS-TBN溶液中，渦旋25_30秒，超聲25_30秒，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘重復(fù)該步驟一次；吸去上清，將微球重懸于600 μ I的PBS-TBN溶液中，將包被好的微球送往Luminex儀器或流式細胞儀計數(shù)；包被好抗體的微球置于2-8度避光保存，每種抗體偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，根據(jù)檢測項目選擇等比例混合。2)按照上述試劑盒的組成，進行每種檢測抗體的生物素標(biāo)記:依據(jù)蛋白濃度計算反應(yīng)體系:計算將抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，為目標(biāo)體積(V)，配制NHS-Biotin反應(yīng)液(用DMSO溶解，終濃度為10mg/ml);按摩爾比I: 100的比例在反應(yīng)管中分別加入檢測抗體和N-Biotin反應(yīng)液；加入1/10V的碳酸氫鈉溶液(pH8.9)；加入PBS溶液補至目標(biāo)體積；包上鋁箔或放入避光暗盒中，將反應(yīng)管或避光暗盒置于圓周震蕩器上，于25度恒溫箱中避光孵育5小時，轉(zhuǎn)速為IOOOrpm ；將反應(yīng)管中的液體轉(zhuǎn)至透析卡中，于1000倍體積的PBS緩沖液中透析過夜兩次，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin，測定蛋白濃度。6、進行檢測，包括以下步驟:I)使用前取出所有試劑，放置平衡至室溫15-30分鐘；
2)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:每個標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置6個稀釋度，然后等比例混合，使得各自的終濃度為所需的濃度，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在稀釋完后須用渦旋徹底混勻三次后才可用于下一濃度的稀釋，混勻過程中可使用高速離心以減少可能產(chǎn)生的泡沫對后續(xù)稀釋的影響。各管的稀釋方法及理論濃度:3)根據(jù)不同孔板(96或384孔濾孔板)的布局以及儀器讀數(shù)的順序確定標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測樣品及空白孔的位置；在設(shè)置好的孔板布局中，每孔加入25μ I的分析緩沖液，再分別加入25μ I的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測樣品到各自孔中，空白孔加25μ I的分析緩沖液；4)分別取出上述制備的六種捕獲抗體偶聯(lián)微球，經(jīng)渦旋和超聲分別處理30秒后等比例混合，使得混合液中微球的濃度均為125個/μ I。往每孔中加入的六種捕獲抗體偶聯(lián)微球的混合懸液25μ I。微球應(yīng)當(dāng)在臨用前混勻，且混勻后應(yīng)即刻應(yīng)用，避免微球沉淀；5)用封口膜封住所有加樣孔，并用錫箔包住孔板或放入避光暗盒內(nèi)以避光，25度放置在微孔板振蕩器上以800轉(zhuǎn)速度震蕩，孵育I小時，然后通過真空抽濾裝置吸去緩沖液，使用洗滌緩沖液洗滌兩次，再加入緩沖液；6)隨后每孔加入25μ I上述制備的生物素標(biāo)記的檢測抗體的混合液，用封口膜封住整塊板，并用錫箔包裹避光，25度放置在微孔板振蕩器上以800轉(zhuǎn)速度震蕩，再孵育I小時，孵育完成后通過真空抽濾裝置吸去緩沖液，使用洗滌緩沖液洗滌兩次，再加入緩沖液；7)每孔加入25μ I鏈親和素藻紅蛋白，用封口膜封住整塊板，并用錫箔包裹，25度放置在微孔板振蕩器上以800轉(zhuǎn)速度震蕩，再孵育半小時，孵育完成后通過真空抽濾裝置吸去緩沖液，使用洗滌緩沖液洗滌兩次，再加入緩沖液；8)于液相芯片分析儀上讀取結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出待測樣品的數(shù)值。

9)上述操作為配合聚苯乙烯微球，使用濾孔板和手動或自動真空抽吸裝置實現(xiàn)整塊板的快速洗滌操作，當(dāng)配合的為磁性微球時，則既可使用上述操作流程，也可改用磁吸附板和自動或手動洗板裝置完成快速洗滌操作。7、實驗結(jié)果分析:具體參見表1-2和圖1-圖7。表1.正常對照組外周血清標(biāo)志物濃度值
^~ox-LDL~IsCD40L^ TF |~ΜΜΡ-9~|~Omentin~|esRAGE~
正常對照組
(pg/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml)(ng/ml)
1440.0 0230.0 170.0 456.0046
2430.04~0220.0 160.0 480.0045
3410.04~5210.0 130.0 490.0044
4400.02 205.0 120.0 440.0043
5408.0Z5208.0 110.0 470.0042表2.ACS組外周血清標(biāo)志物濃度值
權(quán)利要求
1.一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒，其特征在于:所述的液相芯片試劑盒包括有以下組分: 1)包被微球:微球主要包括兩類，一種直徑為5.6 μ m的聚苯乙烯微球和另一種6.5 μ m的磁性微球，上述兩類微球分別包被了 ox-LDL捕獲抗體的微球、包被了 SCD40L捕獲抗體的微球、包被了 MMP-9捕獲抗體的微球、包被了 TF捕獲抗體的微球、包被了 omentin捕獲抗體的微球和包被了 esRAGE捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼； 2 )生物素標(biāo)記檢測抗體:含有分別用生物素標(biāo)記的ox-LDL、s⑶40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE的檢測抗體；3)鏈親合素藻紅蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒，其特征在于:每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為120-130個/μ I ;每種生物素標(biāo)記檢測抗體的使用濃度為1-4 μ g/mL.
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于:所述的制備方法包括有如下步驟: O按照上述試劑盒的組成，制備相應(yīng)的抗體包被微球: 分別選取不同的微球，經(jīng)渦旋或超聲懸浮20-25秒；將50 μ I微球活化后，離心條件為^ 8000g， 離心1-2分鐘； 吸去上清，將微球重懸于250 μ I 50mM的MES的溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，離心收集活化后的微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘；重復(fù)該步驟一次； 吸去上清，將微球重懸于100 μ I 50mM的MES的溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，加入I μ g的抗體,用50mM的MES的溶液將總體積補至500 μ I ; 經(jīng)渦旋震蕩混勻，室溫避光振蕩3小時；離心收集偶聯(lián)抗體的微球，離心條件為^ 8000g，離心2-3分鐘； 吸去上清，將微球重懸于500 μ I的PBS-TBN溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，室溫避光震蕩30分鐘，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘； 吸去上清，將微球重懸于Iml的PBS-TBN溶液中，渦旋25-30秒，超聲25-30秒，離心收集微球，離心條件為> 8000g，離心1-2分鐘重復(fù)該步驟一次； 吸去上清，將微球重懸于600 μ I的PBS-TBN溶液中，將包被好的微球送往Luminex儀器或流式細胞儀計數(shù)；包被好抗體的微球置于2-8度避光保存，每種抗體偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，根據(jù)檢測項目選擇等比例混合； 2)進行每種檢測抗體的生物素標(biāo)記:依據(jù)蛋白濃度計算反應(yīng)體系:計算將抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，為目標(biāo)體積(V)，配制NHS-Biotin反應(yīng)液(用DMSO溶解，終濃度為10mg/ml);按摩爾比1:100的比例在反應(yīng)管中分別加入檢測抗體和N-Biotin反應(yīng)液；加入1/10V的碳酸氫鈉溶液(pH8.9);加入PBS溶液補至目標(biāo)體積； 包上鋁箔或放入避光暗盒中，將反應(yīng)管或避光暗盒置于圓周震蕩器上，于25度恒溫箱中避光孵育5小時，轉(zhuǎn)速為IOOOrpm ； 將反應(yīng)管中的液體轉(zhuǎn)至透析卡中，于1000倍體積的PBS緩沖液中透析過夜兩次，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin，測定蛋白濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于:所述活化微球的步驟如下:用渦旋振蕩器或者超聲波懸浮微球； 取50 μ I微球離心收集沉淀，離心條件為彡8000g，離心1-2分鐘； 去掉上清液，將微球懸于100μ I的雙蒸水中，用渦旋振蕩器或者超聲波懸浮微球20-25秒，離心收集沉淀，離心條件為彡8000g，離心1-2分鐘； 吸棄上清，加入80 μ I的磷酸鹽緩沖液(ρΗ6.2)，渦旋振蕩20-25秒，超聲波懸浮微球20-25 秒； 加入10μ I 50mg/ml的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(S-NHS)，用渦旋振蕩器輕輕地混勻；加入10 μ I 50mg/ml的1-乙基_(3-二甲基氨基丙級)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，用渦旋振蕩器輕輕地混勻； 室溫避光靜置20min，每10分鐘使用渦旋振蕩器輕輕地混勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于:各種溶液的配方如下: 50mM的MES緩沖液，pH5.0，500ml配方如下:將購自Sigma公司的MES4.88g溶于450ml雙蒸水中，加入事先配置好的0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0，經(jīng)0.22 μ m無菌濾器過濾后，4度冰箱備用； PBS配方:將購自Takara公司的PBS片劑10片，溶于IOOOml雙蒸餾水中，再加入NaCl8,000mg, KCl 200 mg，Na2HPO4 1150 mg，KH2PO4 200 mg，高壓滅菌后常溫備用； PBS-TBN配方,pH為7.4,將購自Amresco公司的BSAlg,購自Sigma公司的Tween-20,0.2ml和疊氮鈉500mg,溶于購自takara公司的IL配好的PBS溶液，攪拌混勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于:不同的微球指分別包被了 ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE捕獲抗體的不同微球，上述不同的微球購置于美國Luminex公司。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒及其制備方法。液相芯片主要包括有分別包被了氧化性低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)、可溶性CD40配體(solubleCD40ligand,sCD40L)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetallopeptidase9,MMP-9)、組織因子(tissuefactor,TF)、網(wǎng)膜素(omentin)和內(nèi)源性可溶性RAGE(endogenoussecretoryreceptorofadvancedglycationendproducts,esRAGE)捕獲抗體的微球；生物素標(biāo)記的檢測抗體以及鏈親和素藻紅蛋白。本發(fā)明所提供的液相芯片具有檢測效率高、所需樣本量少、特異性強、靈敏度高、檢測快速準(zhǔn)確等優(yōu)點。同時，該芯片同時反映了機體內(nèi)保護性和損傷性因素水平的高低，以便更全面綜合評估患者的危險分層和預(yù)后情況。同時本發(fā)明的制備方法簡單易行，穩(wěn)定性好，其技術(shù)方案中的各種工藝參數(shù)如微球和抗體的量、反應(yīng)過程等均是在大量實驗基礎(chǔ)上得出的，為制備過程最佳的參數(shù)值。
文檔編號G01N33/577GK103163295SQ20111040741
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者吳宗貴, 梁春, 賀治青, 張家友, 潘曉明, 樊民, 李玫, 丁茹, 甄奕, 伍鋒, 朱琳, 王新, 劉煥波 申請人:吳宗貴, 梁春, 賀治青