專利名稱：基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型的液相芯片，具體是涉及一種全新設(shè)計(jì)的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀。
背景技術(shù)：
隨著分析診斷技術(shù)的高速發(fā)展，20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的被譽(yù)為后基因時(shí) 代的液相芯片是一種新型的蛋白質(zhì)研究平臺(tái)，它是將流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和傳統(tǒng)的芯片技術(shù) 結(jié)合起來(lái)的新型蛋白質(zhì)研究平臺(tái)。該體系有機(jī)地整合了有色微球、現(xiàn)代免疫技術(shù)、激光技 術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就的極高的檢測(cè)特異性 和靈敏度?？捎糜谂R床疾病診斷，如檢測(cè)細(xì)胞因子、過(guò)敏原和自身免疫反應(yīng)、HLA分型、SNP 檢測(cè)、腫瘤特異抗原定量檢測(cè)、多重微生物定量檢測(cè)等；或用于基礎(chǔ)研究方面，如基因分 型、蛋白表達(dá)分型、酶-底物分析、核酸研究等；還可運(yùn)用到食品安全、農(nóng)獸藥殘留多重定量 檢測(cè)和司法鑒定等方面。美國(guó)Luminex公司在1997年最早開(kāi)發(fā)出商業(yè)化應(yīng)用的液相芯片，代表產(chǎn)品主要 為L(zhǎng)uminex 100和Luminex 200液相芯片檢測(cè)儀。目前市場(chǎng)上的液相芯片檢測(cè)儀都采用相 同或類似的原理。該液相芯片檢測(cè)儀的原理為由許多大小均一的圓形微球(通常直徑為 5. 6um)為主要基質(zhì)構(gòu)成，微球由兩種有機(jī)熒光染料進(jìn)行編碼，每種微球上固定有不同的探 針?lè)肿?，將這些微球懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了一個(gè)液相芯片，加入待測(cè)物和報(bào)告熒 光分子，進(jìn)行免疫反應(yīng)或核酸雜交反應(yīng)，通過(guò)兩束激光激發(fā)微球上編碼熒光和報(bào)告熒光，通 過(guò)激光閱讀器和計(jì)算機(jī)的運(yùn)算得到檢測(cè)物種類和數(shù)量。在實(shí)際使用中，我們發(fā)現(xiàn)Luminex液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)以及同類產(chǎn)品存在以下一些 缺陷(1)用于微球編碼的的熒光染料在光學(xué)特征上具有一些固有缺點(diǎn)，如激發(fā)帶窄，發(fā) 射譜寬，光不穩(wěn)定，容易光漂白等，在應(yīng)用中限制了其高通量、高靈敏度和精確分辨率；⑵ 該液相芯片系統(tǒng)采用了兩束激光，其中，紅色激光用來(lái)激發(fā)微球上編碼分類熒光，通過(guò)激光 閱讀器進(jìn)行檢測(cè)種類分辨；綠色激光則針對(duì)報(bào)告分子的棗紅蛋白熒光，通過(guò)激光閱讀器進(jìn) 行檢測(cè)報(bào)告熒光分子。該設(shè)計(jì)是針對(duì)于兩種熒光染料來(lái)配套設(shè)計(jì)的，因此造成其光學(xué)系統(tǒng) 復(fù)雜，體積大，成本高，也限制了其檢測(cè)速度；(3)由于采用單個(gè)微球通過(guò)的微鞘道系統(tǒng)，該 設(shè)計(jì)制約了其檢測(cè)的速度，每秒種只能讀取幾十個(gè)微球。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有液相芯片檢測(cè)儀存在的問(wèn)題和不足，提供一種新型的 液相芯片檢測(cè)儀，即基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀。本發(fā)明所述的一種基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，包括液相芯片、激發(fā)光源、微 流通道、光學(xué)成像系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)，所述液相芯片是量子點(diǎn)編碼微球的液相芯片，包括 表面被化學(xué)修飾的高分子聚合物微球，所述微球中包埋有量子點(diǎn)納米材料；探針?lè)肿?，偶?lián) 在被化學(xué)修飾的微球表面；以及用特定熒光蛋白標(biāo)記的報(bào)告分子；所述的激發(fā)光源，以單一波長(zhǎng)的光作為激發(fā)光，折射入微流通道檢測(cè)區(qū)域；所述的微流通道是寬度為0. 1mm 5mm 的寬鞘道微流通道；所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是CCD或CMOS或光譜成像系統(tǒng)；所述的圖像分析 系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)硬件和圖像分析軟件，接收和處理來(lái)自光學(xué)成像系統(tǒng)的數(shù)據(jù)。所述液相芯片的優(yōu)選方案是微球是由以下材料制成聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙 烯、聚氯乙烯。微球的直徑范圍是1-10 ym。量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍是100-720nm。在微球 中包埋的量子點(diǎn)可以是同一種發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，也可以是兩種或兩種以上發(fā)射波長(zhǎng)的量 子點(diǎn)。微球表面的化學(xué)修飾包括氨基化、羧基化、巰基化、醛基化、羥基化等。探針?lè)肿涌?選自核酸、蛋白、抗體、抗原、生物素、親和素。所述的激發(fā)光源可選自氙燈、高壓汞燈、金屬鹵素?zé)?、LED或激光。所述寬鞘道微流通道的優(yōu)選方案是寬度為0. 1mm 5mm、長(zhǎng)度為5mm 50mm、深 度為5 y m 200 y m的微通道，可由玻璃或石英或高分子聚合物加工而成的。優(yōu)選地，所述的寬微流通道是由步進(jìn)電機(jī)控制的微量進(jìn)樣器。所述的光學(xué)成像系統(tǒng)包括但不限于以下幾種實(shí)施方式(一)所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是由物鏡、聚光鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、分光 鏡、帶通濾光片、CCD裝置、計(jì)算機(jī)組成；其中，在微流通道檢測(cè)區(qū)域上方設(shè)置物鏡，用作激 發(fā)光落射到微流通道檢測(cè)區(qū)域的聚光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域發(fā)出的激發(fā)熒 光的聚光器；在激發(fā)光入射的光路上設(shè)置與光軸成45°的雙色束分離器，將激發(fā)光反射到 所述物鏡中，同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡聚集的激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在 所述雙色束分離器之后設(shè)置阻斷濾波片，吸收透過(guò)雙色束分離器的殘余激發(fā)光，允許激發(fā) 熒光通過(guò)至第一聚光鏡；第一分光鏡將由第一聚光鏡聚集的報(bào)告分子激發(fā)熒光反射到第一 (XD裝置，在第一分光鏡與第一 (XD裝置之間的光路中設(shè)置第一帶通濾光片；第二分光鏡 將穿過(guò)第一分光鏡透射的微球編碼熒光反射到第CCD裝置，在第二分光鏡與第二 CCD裝置 之間的光路中設(shè)置第二帶通濾光片；第三CCD裝置接收穿過(guò)第二分光鏡透射的微球編碼熒 光，在第二分光鏡與第三CCD裝置之間的光路中設(shè)置第三帶通濾光片；第四CCD裝置在微流 通道檢測(cè)區(qū)域下方獲取激發(fā)光通過(guò)檢測(cè)區(qū)域向前散射的光以及激發(fā)光通過(guò)微球探針間隙 的直射光，在微流通道檢測(cè)區(qū)域與第四CCD裝置之間的光路中依次設(shè)置第二聚光鏡、第三 分光鏡和第四帶通濾光片；所述第一、第二、第三和第四C⑶裝置分別與計(jì)算機(jī)連通，所述 計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采集卡獲取來(lái)自四臺(tái)CCD裝置的圖像數(shù)據(jù)。( 二)所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是由若干聚光鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、分光鏡、 帶通濾光片、CMOS裝置、計(jì)算機(jī)組成；其中，在微流通道檢測(cè)區(qū)域上方設(shè)置物鏡，用作激發(fā) 光落射到微流通道檢測(cè)區(qū)域的聚光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域發(fā)出的激發(fā)熒光 的聚光器；在激發(fā)光入射的光路上設(shè)置與光軸成45°的雙色束分離器，將激發(fā)光反射到所 述物鏡中，同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡聚集的激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在所 述雙色束分離器之后設(shè)置阻斷濾波片，吸收透過(guò)雙色束分離器的殘余激發(fā)光，允許激發(fā)熒 光通過(guò)至第一聚光鏡；第一分光鏡將由第一聚光鏡聚集的報(bào)告分子激發(fā)熒光反射到第一 CMOS裝置，在第一分光鏡與第一 CMOS裝置之間的光路中設(shè)置第一帶通濾光片；第二分光鏡 將穿過(guò)第一分光鏡透射的微球編碼熒光反射到第二 CMOS裝置，在第二分光鏡與第二 CMOS 裝置之間的光路中設(shè)置第二帶通濾光片；第三CMOS裝置接收穿過(guò)第二分光鏡透射的微球 編碼熒光，在第二分光鏡與第三CMOS裝置之間的光路中設(shè)置第三帶通濾光片；第四CMOS裝置在微流通道檢測(cè)區(qū)域下方獲取激發(fā)光通過(guò)檢測(cè)區(qū)域向前散射的光以及激發(fā)光通過(guò)微球 探針間隙的直射光，在微流通道檢測(cè)區(qū)域與第四CMOS裝置之間的光路中依次設(shè)置第二聚 光鏡、第三分光鏡和第四帶通濾光片；所述第一、第二、第三和第四CMOS裝置分別與計(jì)算機(jī) 連通，所述計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采集卡獲取來(lái)自四臺(tái)CMOS裝置的圖像數(shù)據(jù)。(三)所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是由物鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、聚光鏡、濾光 閘、面陣CCD探測(cè)器與計(jì)算機(jī)組成；其中，在微流通道檢測(cè)區(qū)域上方設(shè)置物鏡，用作激發(fā)光 落射到微流通道檢測(cè)區(qū)域的聚光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域發(fā)出的激發(fā)熒光的 聚光器；在激發(fā)光入射的光路上設(shè)置與光軸成45°的雙色束分離器，將激發(fā)光反射到所述 物鏡中，同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡聚集的激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在所 述雙色束分離器之后設(shè)置阻斷濾波片，吸收透過(guò)雙色束分離器的殘余激發(fā)光，允許激發(fā)熒 光通過(guò)至聚光鏡；所述濾光間由計(jì)算機(jī)控制其速度至少比微球流速快4倍，將由聚光鏡聚 集的微球編碼熒光和報(bào)告分子熒光、以及激發(fā)光的散射光和直射光投射到面陣CCD探測(cè)器 上；所述面陣CCD探測(cè)器與計(jì)算機(jī)連通，所述計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采集卡獲取來(lái)自面陣CCD探測(cè) 器的圖像數(shù)據(jù)。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在于(1)將微球中包埋的兩種有機(jī)熒光染料換成了量子點(diǎn)包埋，具有熒光穩(wěn)定、熒光 強(qiáng)、不容易光漂白等優(yōu)點(diǎn)，并且具有激發(fā)帶寬、發(fā)射譜窄的優(yōu)勢(shì)，因此穩(wěn)定性、靈敏度和分辨 率更高。只需使用一束光源(而不需要采用兩束激光)即可激發(fā)所有量子點(diǎn)不同的熒光色， 達(dá)到一元激發(fā)、多元發(fā)射的特點(diǎn)，可以完全改變傳統(tǒng)兩束激光，降低儀器成本。(2)基于液相芯片的改進(jìn)，將傳統(tǒng)的單通道改為寬微流通道，將微球多排、連續(xù)、均 勻、平穩(wěn)、勻速地通過(guò)寬微流通道系統(tǒng)，使檢測(cè)速度和效率得到顯著的提高，每秒可檢測(cè)幾 千個(gè)微球。(3)將激光閱讀器和復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)改為使用固定截面一臺(tái)或多臺(tái)高像素 CCD或CMOS或光譜成像等攝取不同波長(zhǎng)的熒光，通過(guò)一個(gè)高分辨率圖像采集卡對(duì)圖像進(jìn)行 分辨和處理，交給計(jì)算機(jī)和圖像處理軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行處理和分析，最后啟動(dòng)打印系統(tǒng)打印 出分析報(bào)告。這樣，整個(gè)結(jié)構(gòu)變得簡(jiǎn)單而緊湊，并且體積比傳統(tǒng)液相芯片檢測(cè)儀小很多，據(jù) 此可以開(kāi)發(fā)出小體積以適應(yīng)不同環(huán)境下使用的量子點(diǎn)液相芯片系統(tǒng)。


圖1為本發(fā)明所述基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀的一種實(shí)施例的示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一本發(fā)明所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀的制備本發(fā)明所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，在液相芯片方面采用直徑lOym以 下微球，用量子點(diǎn)進(jìn)行編碼；在傳輸設(shè)計(jì)方面采用寬微流通道多微球傳輸設(shè)計(jì)，結(jié)合CCD或 CMOS或光譜等成像系統(tǒng)，以及圖像采集卡、大型軟件處理系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理模塊等。本實(shí)施例所述的液相芯片檢測(cè)儀包括以下組成部分(1)液相芯片該液相芯片是量子點(diǎn)編碼微球的液相芯片，包括表面被化學(xué)修飾 的高分子聚合物微球，所述微球中包埋有量子點(diǎn)納米材料；探針?lè)肿?，偶?lián)在被化學(xué)修飾的微球表面；以及用特定熒光蛋白標(biāo)記的報(bào)告分子。微球可以由以下材料制成聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯。微球的直徑范圍是1-lOym。量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍是100-720nm。在微球中包埋的量子點(diǎn)可以是同一種 發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，也可以是兩種或兩種以上發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)。微球表面的化學(xué)修飾包 括氨基化、羧基化、巰基化、醛基化、羥基化等。探針?lè)肿涌蛇x自核酸、蛋白、抗體、抗原、生 物素、親和素等。(2)寬微流通道是由玻璃或石英或高分子聚合物加工的寬度為0. 1mm 5mm、長(zhǎng) 度為5mm 50mm、深度為5 μ m 200 μ m的微通道。優(yōu)選地，所述的寬微流通道是由步進(jìn)電 機(jī)控制的微量進(jìn)樣器，能使微球多排、連續(xù)、均勻、平穩(wěn)、勻速地通過(guò)寬微流通道系統(tǒng)。(3)激發(fā)光源選自氙燈、高壓汞燈、金屬鹵素?zé)?、LED或激光。氙燈、金屬鹵素?zé)艉?高壓汞等使用單色濾光片分離出單一波長(zhǎng)的光作為激發(fā)光，LED或激光可直接選用合適的 單一波長(zhǎng)。(4)光學(xué)成像系統(tǒng)如圖2所示，所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是由物鏡、聚光鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、 分光鏡、帶通濾光片、CCD裝置、計(jì)算機(jī)組成；其中，在微流通道1的檢測(cè)區(qū)域2上方設(shè)置物 鏡L1，用作激發(fā)光落射到微流通道檢測(cè)區(qū)域的聚光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域 發(fā)出的激發(fā)熒光的聚光器；激發(fā)光源5發(fā)出的激發(fā)光經(jīng)單色濾光片6過(guò)濾后入射到與光軸 成45°的雙色束分離器3，將激發(fā)光反射到所述物鏡L1中，同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡L1聚集的 激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在所述雙色束分離器3之后設(shè)置阻斷濾波 片4，吸收透過(guò)雙色束分離器3的殘余激發(fā)光，允許激發(fā)熒光通過(guò)至第一聚光鏡L2 ；第一分光鏡D1將由第一聚光鏡L2聚集的報(bào)告分子激發(fā)熒光反射到第一 (XD裝置 7(001)，在第一分光鏡01與第一00裝置7(001)之間的光路中設(shè)置第一帶通濾光片F(xiàn)1 ；第二分光鏡D2將穿過(guò)第一分光鏡D1透射的微球編碼熒光反射到第二 (XD裝置 8(002)，在第二分光鏡02與第二00裝置8(002)之間的光路中設(shè)置第二帶通濾光片F(xiàn)2 ；第三(XD裝置9 (CXD3)接收穿過(guò)第二分光鏡D2透射的微球編碼熒光，在第二分光 鏡D2與第三(XD裝置9 (CXD3)之間的光路中設(shè)置第三帶通濾光片F(xiàn)3 ；第四C⑶裝置10((XD4)在微流通道檢測(cè)區(qū)域2下方獲取激發(fā)光通過(guò)檢測(cè)區(qū)域2向 前散射的光以及激發(fā)光通過(guò)微球探針間隙的直射光，在微流通道檢測(cè)區(qū)域2與第四CCD裝 置10((XD4)之間的光路中依次設(shè)置第二聚光鏡L3、第三分光鏡D3和第四帶通濾光片F(xiàn)4 ；所述第一、第二、第三和第四(XD裝置分別與計(jì)算機(jī)連通，所述計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采 集卡獲取來(lái)自四臺(tái)(XD裝置的圖像數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)根據(jù)從第四(XD裝置獲取的圖像數(shù)據(jù)重建微球的全息影像圖，包括微球的 三維位置和尺寸等，該全息影像圖是激發(fā)光通過(guò)向前散射光和通過(guò)微球探針間隙的直射光 產(chǎn)生。計(jì)算機(jī)根據(jù)從其他CCD裝置獲取的圖像數(shù)據(jù)分析微球編碼數(shù)據(jù)和探針結(jié)合數(shù)據(jù)。(5)圖像分析系統(tǒng)，包括計(jì)算機(jī)硬件，如電腦主機(jī)、圖像采集卡等，以及特定圖像分 析軟件，接收和處理來(lái)自CCD裝置的光學(xué)影像數(shù)字信號(hào)。本發(fā)明所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀的原理為采用化學(xué)合成法制備出聚 苯乙烯微球，再將量子點(diǎn)通過(guò)化學(xué)工藝包埋于聚苯乙烯微球中，從而使微球具有可尋址和 示蹤的顏色編碼。由于量子點(diǎn)的激發(fā)光譜寬，呈連續(xù)分布，而發(fā)射光譜窄，單色性好，并且通過(guò)改變量子點(diǎn)的粒徑即可發(fā)出不同的熒光色，據(jù)此可以對(duì)微球進(jìn)行百種以上的顏色編碼， 每種編碼代表一種分析物。因此采用同一波長(zhǎng)激發(fā)光即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同顏色量子點(diǎn)同時(shí)激 發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，可構(gòu)成上百種的可分辨顏色。包埋量子點(diǎn)的微球經(jīng)過(guò)修飾處理 后，根據(jù)需要在微球表面偶聯(lián)上不同的探針?lè)肿?，并封閉處理。分析時(shí)將不同編碼的微球混 合(或采用多分析物檢測(cè)試劑盒)，加入待檢物樣本和報(bào)告分子，置于流體模塊系統(tǒng)中雜交 反應(yīng)結(jié)合。反應(yīng)結(jié)合后的微球通過(guò)一特殊推進(jìn)器系統(tǒng)，將微球均勻、平穩(wěn)、勻速、連續(xù)的通過(guò) 寬微流通道，此時(shí)通過(guò)一束與CCD同步的激發(fā)光激發(fā)微球的顏色編碼和報(bào)告熒光信號(hào)，信 號(hào)通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)處理，被CCD等成像系統(tǒng)分別采集，CCD的拍攝速度與微流場(chǎng)微球流過(guò)的截 面速率同步，保證每個(gè)微球只被(XD記錄一次信息，(XD1、(XD2、(XD3分別記錄報(bào)告分子熒 光、微球的兩種分辨熒光，CCD4采集全息干涉條紋圖像，圖像信息通過(guò)一個(gè)高分辨率的圖像 采集卡對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)字重建，整合處理后傳輸給計(jì)算機(jī)，并且(XD1 (XD3預(yù)先采集無(wú)熒光 微球時(shí)的微流場(chǎng)通道圖像作為背景噪音。將熒光微球的微球通道圖像與背景噪音圖像通過(guò) 相關(guān)計(jì)算，獲得除去噪音后的微球熒光信號(hào)，利用單個(gè)微球熒光信號(hào)模板匹配，確定圖像上 微球的位置。利用電腦的強(qiáng)大分析能力，確定檢測(cè)物的種類和濃度，然后激活打印系統(tǒng)，打 印出報(bào)告。本實(shí)施例中的CCD裝置可用CMOS裝置代替。CCD (Charge CoupledDevice,電荷耦 合元件)和 CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor，金屬氧化物半導(dǎo)體元件) 是兩種圖像傳感器，都是組成數(shù)字?jǐn)z像頭的重要組成部分。本發(fā)明所述的CCD裝置是指含 有(XD圖像傳感器的裝置；所述的CMOS裝置是指含有CMOS圖像傳感器的裝置。在上述光 學(xué)系統(tǒng)中將CCD裝置更換為CMOS裝置，也可達(dá)到相當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)成像效果。實(shí)施例二、采用光譜成像系統(tǒng)的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀本實(shí)施例將實(shí)施例一中的CCD或CMOS光學(xué)成像系統(tǒng)改進(jìn)為光譜成像系統(tǒng)，使得 本發(fā)明所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀結(jié)構(gòu)更為緊湊，并且具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu) 點(diǎn)。所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是由物鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、聚光鏡、濾光閘、面陣 CCD探測(cè)器與計(jì)算機(jī)組成；其中，在微流通道檢測(cè)區(qū)域上方設(shè)置物鏡，用作激發(fā)光落射到微 流通道檢測(cè)區(qū)域的聚光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域發(fā)出的激發(fā)熒光的聚光器； 在激發(fā)光入射的光路上設(shè)置與光軸成45°的雙色束分離器，將激發(fā)光反射到所述物鏡中， 同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡聚集的激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在所述雙色束 分離器之后設(shè)置阻斷濾波片，吸收透過(guò)雙色束分離器的殘余激發(fā)光，允許激發(fā)熒光通過(guò)至 聚光鏡；所述濾光間由計(jì)算機(jī)控制其速度至少快于微球流速的4倍，將由聚光鏡聚集的微 球編碼熒光和報(bào)告分子熒光、以及激發(fā)光的散射光和直射光投射到面陣CCD探測(cè)器上；所 述面陣CCD探測(cè)器與計(jì)算機(jī)連通，所述計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采集卡獲取來(lái)自面陣CCD探測(cè)器的 圖像數(shù)據(jù)。圖像采集卡完成單幅圖像采集、光譜序列圖像采集和時(shí)間序列圖像采集，然后將 圖像信息傳輸給計(jì)算機(jī)處理，以獲取微球編碼信息和報(bào)告熒光數(shù)據(jù)。實(shí)施例三采用本發(fā)明所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)本實(shí)施例將本發(fā)明所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀運(yùn)用于血液中乙肝病毒、 丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒螺旋體等4項(xiàng)的多重檢測(cè)，以驗(yàn)證該液相芯片檢測(cè)儀的技術(shù)效果。首先，按現(xiàn)有方法制備直徑為5 u m的聚苯乙烯微球，采用溶脹法將發(fā)射波長(zhǎng)為 540nm和620nm的CdSe/ZnS量子點(diǎn)包埋到聚苯乙烯微球中。編碼方法將540nm的CdSe/ZnS量子點(diǎn)包埋到聚苯乙烯微球中，代表乙肝病毒檢 測(cè)項(xiàng)，編碼為“1號(hào)”；將620nm的CdSe/ZnS量子點(diǎn)包埋到聚苯乙烯微球中，代表丙肝病毒檢 測(cè)項(xiàng)，編碼為“2號(hào)”；將50%的620nm的CdSe/ZnS量子點(diǎn)和50%的540nmCdSe/ZnS量子點(diǎn) 包埋到聚苯乙烯微球中，代表艾滋病毒檢測(cè)項(xiàng)，編碼為“3號(hào)”；將30%的620nm的CdSe/ZnS 量子點(diǎn)和70%的540nmCdSe/ZnS量子點(diǎn)包埋到聚苯乙烯微球中，代表梅毒螺旋體檢測(cè)項(xiàng)， 編碼為“4號(hào)”。修飾與偶聯(lián)編碼后對(duì)聚苯乙烯微球進(jìn)行封閉處理，然后對(duì)包埋量子點(diǎn)后的微球 進(jìn)行氨基化修飾，將乙肝病毒的特異性核酸片段作為探針?lè)肿优悸?lián)到1號(hào)微球上；將丙肝 病毒的特異性核酸片段作為探針?lè)肿优悸?lián)到2號(hào)微球上；將艾滋病毒的特異性核酸片段作 為探針?lè)肿优悸?lián)到3號(hào)微球上；將梅毒螺旋體的特異性核酸片段作為探針?lè)肿优悸?lián)到4號(hào) 微球上。將偶聯(lián)后的微球進(jìn)行封閉處理。核酸提取與擴(kuò)增對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行核酸提取，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增中使用熒光蛋 白對(duì)擴(kuò)增物進(jìn)行熒光標(biāo)記。檢測(cè)將4種微球混合加入鞘流緩沖液，同時(shí)將擴(kuò)增物加入鞘流緩沖液中與微球 進(jìn)行雜交反應(yīng)，運(yùn)用本發(fā)明的量子點(diǎn)液相芯片檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果共檢測(cè)臨床傳染科血清樣本200份，其中檢測(cè)出乙肝陽(yáng)性30份、丙肝陽(yáng)性 16份、梅毒螺旋體陽(yáng)性11份、艾滋病毒陽(yáng)性1份，其中血清樣本中乙肝病毒與丙肝病毒聯(lián) 合感染的有1份；乙肝與梅毒聯(lián)合感染1份。使用臨床常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和 ELISA試劑盒進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果完全一致。使用本發(fā)明產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，雜交需要20min，檢測(cè)時(shí)間lmin，合計(jì)21min即可出 結(jié)果，而采用現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和ELISA試劑盒，每項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)均需要3小 時(shí)以上。因此，本發(fā)明所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，可以實(shí)現(xiàn)快速多重定量檢測(cè)， 而且液相芯片的靈敏度也比現(xiàn)有方法高。本發(fā)明所述的液相芯片檢測(cè)儀與現(xiàn)有Luminex公司產(chǎn)品的比較如下表
權(quán)利要求
一種基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，包括液相芯片、激發(fā)光源、微流通道、光學(xué)成像系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)，其特征在于所述液相芯片是量子點(diǎn)編碼微球的液相芯片，包括表面被化學(xué)修飾的高分子聚合物微球，所述微球中包埋有量子點(diǎn)納米材料；探針?lè)肿樱悸?lián)在被化學(xué)修飾的微球表面；以及用特定熒光蛋白標(biāo)記的報(bào)告分子；所述的激發(fā)光源，以單一波長(zhǎng)的光作為激發(fā)光，折射入微流通道檢測(cè)區(qū)域；所述的微流通道是寬度為0.1mm～5mm的寬鞘道微流通道；所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是CCD或CMOS或光譜成像系統(tǒng)；所述的圖像分析系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)硬件和圖像分析軟件，接收和處理來(lái)自光學(xué)成像系統(tǒng)的數(shù)據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述液相芯片 的微球的直徑范圍是1-10 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述液相芯片 的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍是100-720nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述的激發(fā)光 源選自氙燈、高壓汞燈、金屬鹵素?zé)簟ED或激光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述的寬鞘道 微流通道是寬度為0. Imm 5mm、長(zhǎng)度為5mm 50mm、深度為5 μ m 200 μ m的微通道。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述的寬微流 通道由玻璃或石英或高分子聚合物加工而成的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述的寬微流 通道是由步進(jìn)電機(jī)控制的微量進(jìn)樣器。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述的光學(xué)成 像系統(tǒng)是由物鏡、聚光鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、分光鏡、帶通濾光片、CCD裝置、計(jì)算 機(jī)組成；其中，在微流通道檢測(cè)區(qū)域上方設(shè)置物鏡，用作激發(fā)光落射到微流通道檢測(cè)區(qū)域的聚 光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域發(fā)出的激發(fā)熒光的聚光器；在激發(fā)光入射的光路上設(shè)置與光軸成45°的雙色束分離器，將激發(fā)光反射到所述物鏡 中，同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡聚集的激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在所述雙色束分離器之后設(shè)置阻斷濾波片，吸收透過(guò)雙色束分離器的殘余激發(fā)光，允 許激發(fā)熒光通過(guò)至第一聚光鏡；第一分光鏡將由第一聚光鏡聚集的報(bào)告分子激發(fā)熒光反射到第一 CCD裝置，在第一分 光鏡與第一 CCD裝置之間的光路中設(shè)置第一帶通濾光片；第二分光鏡將穿過(guò)第一分光鏡透射的微球編碼熒光反射到第二 CCD裝置，在第二分光 鏡與第二 CCD裝置之間的光路中設(shè)置第二帶通濾光片；第三CCD裝置接收穿過(guò)第二分光鏡透射的微球編碼熒光，在第二分光鏡與第三CCD裝 置之間的光路中設(shè)置第三帶通濾光片；第四CCD裝置在微流通道檢測(cè)區(qū)域下方獲取激發(fā)光通過(guò)檢測(cè)區(qū)域向前散射的光以及 激發(fā)光通過(guò)微球探針間隙的直射光，在微流通道檢測(cè)區(qū)域與第四CCD裝置之間的光路中依次設(shè)置第二聚光鏡、第三分光鏡和第四帶通濾光片；所述第一、第二、第三和第四CCD裝置分別與計(jì)算機(jī)連通，所述計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采集卡 獲取來(lái)自四臺(tái)CXD裝置的圖像數(shù)據(jù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述的光學(xué)成 像系統(tǒng)是由若干聚光鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、分光鏡、帶通濾光片、CMOS裝置、計(jì)算 機(jī)組成；其中，在微流通道檢測(cè)區(qū)域上方設(shè)置物鏡，用作激發(fā)光落射到微流通道檢測(cè)區(qū)域的聚 光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域發(fā)出的激發(fā)熒光的聚光器；在激發(fā)光入射的光路上設(shè)置與光軸成45°的雙色束分離器，將激發(fā)光反射到所述物鏡 中，同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡聚集的激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在所述雙色束分離器之后設(shè)置阻斷濾波片，吸收透過(guò)雙色束分離器的殘余激發(fā)光，允 許激發(fā)熒光通過(guò)至第一聚光鏡；第一分光鏡將由第一聚光鏡聚集的報(bào)告分子激發(fā)熒光反射到第一 CMOS裝置，在第一 分光鏡與第一 CMOS裝置之間的光路中設(shè)置第一帶通濾光片；第二分光鏡將穿過(guò)第一分光鏡透射的微球編碼熒光反射到第二 CMOS裝置，在第二分 光鏡與第二 CMOS裝置之間的光路中設(shè)置第二帶通濾光片；第三CMOS裝置接收穿過(guò)第二分光鏡透射的微球編碼熒光，在第二分光鏡與第三CMOS 裝置之間的光路中設(shè)置第三帶通濾光片；第四CMOS裝置在微流通道檢測(cè)區(qū)域下方獲取激發(fā)光通過(guò)檢測(cè)區(qū)域向前散射的光以及 激發(fā)光通過(guò)微球探針間隙的直射光，在微流通道檢測(cè)區(qū)域與第四CMOS裝置之間的光路中 依次設(shè)置第二聚光鏡、第三分光鏡和第四帶通濾光片；所述第一、第二、第三和第四CMOS裝置分別與計(jì)算機(jī)連通，所述計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采集 卡獲取來(lái)自四臺(tái)CMOS裝置的圖像數(shù)據(jù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，其特征在于所述的光學(xué)成 像系統(tǒng)是由物鏡、雙色束分離器、阻斷濾波片、聚光鏡、濾光閘、面陣CCD探測(cè)器與計(jì)算機(jī)組 成；其中，在微流通道檢測(cè)區(qū)域上方設(shè)置物鏡，用作激發(fā)光落射到微流通道檢測(cè)區(qū)域的聚 光器，以及用作聚集從微流通道檢測(cè)區(qū)域發(fā)出的激發(fā)熒光的聚光器；在激發(fā)光入射的光路上設(shè)置與光軸成45°的雙色束分離器，將激發(fā)光反射到所述物鏡 中，同時(shí)允許經(jīng)所述物鏡聚集的激發(fā)熒光通過(guò)，以致使激發(fā)光與激發(fā)熒光分開(kāi)；在所述雙色束分離器之后設(shè)置阻斷濾波片，吸收透過(guò)雙色束分離器的殘余激發(fā)光，允 許激發(fā)熒光通過(guò)至聚光鏡；所述濾光間由計(jì)算機(jī)控制其速度至少比微球流速快4倍，將由聚光鏡聚集的微球編碼 熒光和報(bào)告分子熒光、以及激發(fā)光的散射光和直射光投射到面陣CCD探測(cè)器上；所述面陣CCD探測(cè)器與計(jì)算機(jī)連通，所述計(jì)算機(jī)通過(guò)圖像采集卡獲取來(lái)自面陣CCD探 測(cè)器的圖像數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于量子點(diǎn)的液相芯片檢測(cè)儀，包括液相芯片、激發(fā)光源、微流通道、光學(xué)成像系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)；所述液相芯片是量子點(diǎn)編碼微球的液相芯片；所述的激發(fā)光源，以單一波長(zhǎng)的光作為激發(fā)光，折射入微流通道的檢測(cè)區(qū)域；所述的微流通道是寬度為0.1mm～5mm的寬鞘道微流通道；所述的光學(xué)成像系統(tǒng)是CCD或CMOS或光譜成像系統(tǒng)；所述的圖像分析系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)硬件和圖像分析軟件，接收和處理來(lái)自光學(xué)成像系統(tǒng)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明所述的液相芯片檢測(cè)儀具有熒光穩(wěn)定、熒光強(qiáng)、不易光漂白等優(yōu)點(diǎn)，具有激發(fā)帶寬、發(fā)射譜窄等優(yōu)勢(shì)，穩(wěn)定性、靈敏度和分辨率更高，檢測(cè)速度和效率顯著提高，每秒可檢測(cè)幾千個(gè)微球，整個(gè)結(jié)構(gòu)變得簡(jiǎn)單而緊湊。
文檔編號(hào)G01N21/49GK101988897SQ200910041710
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者曾令文, 熊業(yè)華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院